復(fù)配溶菌酶和甘草提取物的抑菌牙膏研究

徐天生，褚夫江，耿帥峰，歐陽學(xué)琭，李婷

（1.好易康生物科技（廣州）有限公司，廣東廣州 510700；2.廣東藥科大學(xué)，廣東廣州 510006）

口腔問題主要是由細(xì)菌引起的，采用有效的牙膏和漱口液可以明顯降低口腔內(nèi)致病菌的數(shù)量，改善甚至消除口腔疾病。牙膏等口腔護(hù)理產(chǎn)品之所以能實(shí)現(xiàn)這些功能主要是依靠產(chǎn)品中的活性成分或抑菌成分，這些抑菌成分多為化學(xué)類抑菌劑，如三氯生、西吡氯銨、洗必泰、抗生素等，經(jīng)常使用含有這些成分的口腔護(hù)理產(chǎn)品容易造成口腔細(xì)菌生態(tài)失調(diào)，或使細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性，不能達(dá)到預(yù)防口腔疾病的效果，反而引發(fā)其他多種口腔疾病。

溶菌酶（Lysozyme）是唾液中的一種非特異性物質(zhì)成分，可以抑制微生物生長，與抗生素或其他抑菌物質(zhì)對比，長期使用溶菌酶不易出現(xiàn)抗藥性[1]。溶菌酶能有效地水解細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖，其水解位點(diǎn)是N-乙酰胞壁酸（NAM）的1位碳原子和N-乙酰葡萄糖胺（NAG）的4位碳原子間的β-1.4糖苷鍵。肽聚糖是細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分，由NAM、NAG和肽“尾”（一般是4個氨基酸）組成，NAM與NAG通過β-1.4糖苷鍵相連，肽“尾”則是通過D-乳酰羧基連在NAM的第3位碳原子上，肽尾之間通過肽“橋”（肽鍵或少數(shù)幾個氨基酸）連接，NAM、NAG、肽“尾”與肽“橋”共同組成了肽聚糖的多層網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，作為細(xì)胞壁的骨架，上述結(jié)構(gòu)中的任何化學(xué)鍵斷裂，皆能導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞壁的損傷[2]。對于革蘭氏陽性菌（G+），如金黃色葡萄球菌、枯草桿菌或溶壁微球菌等，與革蘭氏陰性菌（G-），如大腸桿菌、具核梭桿菌、牙齦卟啉單胞菌、肺炎桿菌等，其細(xì)胞壁中肽聚糖含量不同，G+細(xì)菌細(xì)胞壁幾乎全部由肽聚糖組成，而G-細(xì)菌只有內(nèi)壁層為肽聚糖，因此，溶菌酶對G+細(xì)菌有很好的抑殺效果，但是對G-細(xì)菌的作用就比較弱[3]。

本研究針對目前存在的問題，著力從復(fù)配溶菌酶和甘草提取物的角度，去完善單一功能物質(zhì)的不足，并將溶菌酶和甘草提取物的復(fù)合物應(yīng)用在牙膏中，從而形成一系列更符合市場需求的抑菌牙膏產(chǎn)品。

1 材料與方法

1.1 材料

溶菌酶樣品為好易康公司實(shí)驗(yàn)室提供，甘草提取物為符合要求的市售優(yōu)級品；變異鏈球菌、牙齦卟啉單胞菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌由廣東省微生物研究所提供；涉及的試劑均為分析純。

1.2 溶液配制

1.2.1 溶菌酶水溶液的制備

準(zhǔn)確稱量0.1 g、0.2 g、0.3 g、0.4 g、0.5 g溶菌酶樣品，分別溶于50 mL水中，最后定容至100 mL，分別得0.1%、0.2%、0.3%、0.4%和0.5%含量的溶菌酶水溶液。

1.2.2 甘草提取物水溶液的制備

準(zhǔn)確稱量0.1 g、0.2 g、0.3 g、0.4 g和0.5 g甘草提取物樣品，分別溶于50 mL水中，最后定容至100 mL，分別得0.1%、0.2%、0.3%、0.4%和0.5%含量的甘草提取物水溶液。

1.3 抑菌效果檢測方法

按照QB 2738-2012《日化產(chǎn)品抗菌抑菌效果的評價(jià)方法》中7.3作為檢測依據(jù)，以對變異鏈球菌、牙齦卟啉單胞菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的抑制率為考察指標(biāo)，對物質(zhì)的抑菌效果進(jìn)行評價(jià)。具體操作方法如下：

（1）用PBS（0.03 mol/L磷酸鹽緩沖液）液將變異鏈球菌、牙齦卟啉單胞菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌稀釋成濃度為1×104～9×104cfu/mL；（2）將試驗(yàn)樣品用無菌標(biāo)準(zhǔn)硬水稀釋至合適低濃度；（3）吸取試驗(yàn)樣品原液5.0 mL放入滅菌試管中，20 ℃恒溫5 min；（4）吸取試驗(yàn)菌液0.1 mL加入到含5.0 mL樣品的試管中，迅速混勻，并立即計(jì)時；（5）作用3 min后，取試驗(yàn)菌與樣品混合液0.5 mL，加入到含4.5 mL經(jīng)滅菌的PBS試管中，充分混勻；（6）放置10 min后，吸取樣液1 mL，置于滅菌平皿內(nèi)，每個樣液接種兩個滅菌平皿，用涼至40～45 ℃的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基15 mL作傾注，轉(zhuǎn)動平皿，使其充分均勻，瓊脂凝固后翻轉(zhuǎn)平皿，（35±2）℃培養(yǎng)48 h后，做活菌菌落計(jì)數(shù)；（7）以PBS替代試驗(yàn)樣品，同時按以上步驟操作，作為對照樣品；（8）實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，求其平均值。計(jì)算公式如式1所示。式中，α為對照樣品平均菌落數(shù)，β為試驗(yàn)樣品平均菌落數(shù)，結(jié)果保留整數(shù)。

1.4 抑菌效果測定

1.4.1 溶菌酶水溶液

將以上制得的0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%溶菌酶水溶液共計(jì)5個樣品按照1.3方法，對變異鏈球菌（G-）、牙齦卟啉單胞菌（G-）、金黃色葡萄球菌（G+）、大腸桿菌（G+）4種口腔致病菌進(jìn)行抑菌檢測。

1.4.2 甘草提取物水溶液

將以上制得的0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%甘草提取物水溶液共計(jì)5個樣品按照1.3方法，對變異鏈球菌（G-）、牙齦卟啉單胞菌（G-）、金黃色葡萄球菌（G+）、大腸桿菌（G+）4種口腔致病菌進(jìn)行抑菌檢測。

1.4.3 溶菌酶復(fù)配甘草提取物

在不增加抑菌物用量的前提下，即控制抑菌物質(zhì)的總量為0.3%，測試溶菌酶和甘草提取物在復(fù)配比例分別為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、2∶1、3∶1和4∶1的抑菌效果，從而優(yōu)選最佳的復(fù)配比例。

1.5 溶菌酶和甘草提取物復(fù)配物在牙膏用的應(yīng)用

選定目前比較主流的氫氧化鋁、碳酸鈣、二氧化硅、磷酸氫鈣4種配方體系作為驗(yàn)證配方，為了盡量避免其他原料的影響，配方中不添加任何其他的功能劑，同時不添加任何防腐劑。配方設(shè)計(jì)見表1。

表1 配方設(shè)計(jì) 單位：%

2 結(jié)果與分析

2.1 溶菌酶水溶液的抑菌效果測定。

圖1為不同濃度溶菌酶的抑菌效果，隨著溶菌酶水溶液濃度的上升，樣品抑菌率也隨之上升，但當(dāng)濃度上升至0.3%后，抑菌能力提高有限，與濃度為0.4%、0.5%的樣品抑菌效果差別不大；同時還可以看出，溶菌酶對革蘭氏陽性菌的抑菌能力較革蘭氏陰性菌好。

圖1 不同濃度溶菌酶抑菌效果

2.2 甘草提取物水溶液的抑菌效果測定

圖2為不同濃度甘草提取物抑菌效果，可以看出，甘草提取物有一定的廣譜抑菌能力，隨著濃度的上升，抑菌能力也隨之上升，當(dāng)濃度上升至0.3%后，抑菌能力達(dá)到提高有限，與濃度為0.4%、0.5%的樣品抑菌率基本一致。

圖2 不同濃度甘草提取物抑菌效果

2.3 溶菌酶復(fù)配甘草提取物的抑菌效果

從2.1可以得出，0.3%溶菌酶已有較好的綜合抑菌能力，但由于抑菌機(jī)理的原因，對革蘭氏陽性菌的抑菌能力較革蘭氏陰性菌的抑菌能力要強(qiáng)；而從2.2可以得出，甘草提取物具有較好廣譜的抑菌能力，且達(dá)到0.3%濃度時，就有較為理想的廣譜抑菌能力。

將溶菌酶和甘草提取物按比例為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、2∶1、3∶1和4∶1的共計(jì)7個復(fù)配物對4種口腔致病菌病進(jìn)行抑菌檢測，結(jié)果見圖3。

從圖3可以看出，溶菌酶和甘草提取物的最佳復(fù)配比例為3∶1，即0.225%的溶菌酶復(fù)配0.075%的甘草提取物有最佳的抑菌能力，這個復(fù)配組合較好地起到了協(xié)同增效的能力，使得復(fù)配物的廣譜抑菌能力得到較大的提升，同時改善了溶菌酶對革蘭氏陽性菌抑菌的能力強(qiáng)于革蘭氏陰性菌的現(xiàn)象。

圖3 不同比例的溶菌酶和甘草提取物復(fù)配物的抑菌效果

2.4 4種配方體系的抑菌效果測定

4個配方體系的牙膏對4種口腔致病菌的抑菌檢測結(jié)果見圖4。從圖中可以看出，在牙膏中添加0.225%的溶菌酶復(fù)配0.075%的甘草提取物（比例為3∶1）后，不含任何功能劑和防腐劑的4種牙膏配方體系都延續(xù)了復(fù)配物原有的良好抑菌性能。

圖4 不同配方體系牙膏的抑菌效果

3 結(jié)論

溶菌酶和甘草提取物均有較好的抑菌能力，其中溶菌酶的抑菌能力好于甘草提取物；溶菌酶對革蘭氏陰性菌的抑菌能力弱于革蘭氏陽性菌，而甘草提取物對兩種菌的抑菌能力差異較?。谎芯咳芫概c甘草提取物復(fù)配，在總添加量為0.3%下，溶菌酶、甘草提取物比例為3∶1時，復(fù)配物的抑菌能力最強(qiáng)，在控制總量不增加的前提下，達(dá)到了溶菌酶和甘草提取物協(xié)同增強(qiáng)的效果，且該比例的復(fù)配物應(yīng)用在不含任何功能劑和防腐劑的4種體系牙膏配方中，膏體的抑菌能力與復(fù)配物基本一致，有良好的抑菌能力。