超聲-纖維素酶協(xié)同提取萬年蒿總黃酮工藝及其抗氧化研究

尚東惠，黨永康，梁凱潔，楊敏

（吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，吉林吉林 132001）

萬年篙是朝鮮族的民間常用藥材，別名白蓮蒿、鐵桿蒿，具有抗氧化、清熱解毒、保肝利膽、抗菌、抗腫瘤等生物活性[1-2]。萬年蒿可作為陳茵蒿的替代品，東北某些地區(qū)在治療黃疸等肝炎癥狀時(shí)，更愿意選用萬年蒿替代陳茵蒿作為首選藥物。適量外用可治療創(chuàng)傷出血，也可做飼料，藥用部位一般為其地上部分，也可為全草[3]。因此，對(duì)萬年蒿的研究和應(yīng)用具有極其重要的社會(huì)意義和藥用價(jià)值[4]。

黃酮類化合物是萬年蒿發(fā)揮藥理學(xué)作用的主要有效成分。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，纖維素酶可以提高藥材有效成分的溶出率[4]。本實(shí)驗(yàn)在優(yōu)化萬年蒿總黃酮超聲提取工藝的基礎(chǔ)上，添加纖維素酶并采用單因素實(shí)驗(yàn)篩選出最佳的提取方法[5]，根據(jù)單因素的試驗(yàn)結(jié)果，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)篩選出的提取方法進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)其進(jìn)行清除DPPH自由基（二苯代苦味阱自由基）和還原能力的研究，為萬年蒿的研究和開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

纖維素酶（＞30 000 U/g）、95%乙醇、氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉、甲醇、無水乙醇、DPPH溶液、磷酸緩沖溶液、鐵氰化鉀、三氯化鐵、三氯乙酸等均為分析純，購(gòu)自上海國(guó)藥試劑有限公司，蘆丁購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司。

QCD6150型超聲提取器，天津恒瑞機(jī)電設(shè)備有限公司；TU-1221型紫外可見分光光度計(jì)，北京普析有限責(zé)任公司；恒溫水浴鍋，國(guó)華電器有限公司；TDL-40B型離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；BS224S型電子天平，德國(guó)賽多利斯。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

采用文獻(xiàn)[6]中報(bào)道的方法，取0.20 mg/mL的蘆丁對(duì)照品，用30%的乙醇溶解定容，配制成濃度為0 mg/mL、0.08 mg/mL、0.16 mg/mL、0.24 mg/mL、0.40 mg/mL的一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液；加入5% NaNO2溶液和10% Al(NO3)3溶液，搖勻靜置后加入4%的NaOH溶液，用紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)為510 nm處測(cè)量吸光度，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 超聲-纖維素酶協(xié)同法提取總黃酮及含量測(cè)定

稱取適當(dāng)?shù)睦w維素酶，加入pH 4.5醋酸-醋酸鈉緩沖液調(diào)節(jié)pH進(jìn)行活化，置于燒杯中，再添加萬年蒿粗粉1.0 g，在一定溫度的恒溫水浴鍋中酶解一定時(shí)間后滅酶。按一定的料液比（g∶mL）加入不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，密封，轉(zhuǎn)移至設(shè)定好參數(shù)的超聲波中進(jìn)行超聲波提取，得到的提取液進(jìn)行抽濾，2 000 r/min離心6 min，取上清液作為提取液的最終測(cè)定樣本，采用NaNO2-Al(NO3)3比色法測(cè)定萬年蒿總黃酮吸光度A，將測(cè)定的萬年蒿總黃酮的吸光度A代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中求出提取液中的總黃酮濃度C，按式1計(jì)算得率[7]。

式中，V為測(cè)定液的體積，mL；C為萬年蒿總黃酮測(cè)定樣品液濃度，mg/mL；X為萬年蒿總黃酮提取液稀釋總倍數(shù)；W為每次提取加入的萬年蒿質(zhì)量，g。

改變超聲波功率（400 W、500 W、600 W、700 W和 800 W）、超聲時(shí)間（30 min、40 min、50 min、60 min和70 min、）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（50%、60%、70%、80%和90%）及料液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40和1∶50）進(jìn)行單因素試驗(yàn)，得出每個(gè)因素最佳水平進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化。

1.2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以黃酮得率為考察指標(biāo)，通過正交試驗(yàn)確定最佳條件。如表1所示，選取超聲波功率、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲波時(shí)間及料液比作為主要考察因素，按照L9（34）進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

表1 試驗(yàn)因素水平表

1.2.4 萬年蒿總黃酮抗氧化活性研究

選取DPPH與黃酮類提取物進(jìn)行顯色反應(yīng)，通過顯色的結(jié)果確定所提取黃酮類物質(zhì)的抗氧化活性。準(zhǔn)確稱取一定量萬年蒿總黃酮粉末，分別加入甲醇配制成樣品溶液。稱取DPPH溶解于無水乙醇中，搖勻避光保存。分別取1 mL待測(cè)樣液和3 mL DPPH溶液混合搖勻，室溫避光靜置30 min，于517 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值[8]。根據(jù)公式2計(jì)算樣品自由基清除率K。

式中，K為樣品對(duì)DPPH的清除率，%；Ai為2 mL DPPH溶液+2 mL樣品提取液的吸光度；Aj為2 mL 樣品提取液+2 mL乙醇的吸光度；Ac為2 mL DPPH溶液+2 mL乙醇的吸光度。

1.2.5 萬年蒿總黃酮的還原力測(cè)定研究

取萬年蒿中總黃酮樣品，配制成不同濃度的樣品溶液，各取1 mL加入0.2 mol/L的磷酸緩沖溶液（pH=6.6）2 mL和1%鐵氰化鉀溶液2 mL，混合物于50 ℃水浴保溫20 min，然后加入10%三氯乙酸溶液，3 000 r/min離心。取上清液2 mL，加入蒸餾水2 mL及0.1%三氯化鐵溶液0.5 mL，混合后于700 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線

如圖1所示，黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=2.020 4X-0.000 6，R2=0.998 8，其中Y為吸光度值，X為蘆丁溶液濃度。

圖1 黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 超聲波功率對(duì)萬年蒿總黃酮得率的影響

選定超聲波時(shí)間為50 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，料液比1∶20（g∶mL），研究不同超聲波功率對(duì)萬年蒿總黃酮得率的影響，結(jié)果如圖2所示。黃酮得率最大時(shí)超聲波功率為600 W，所采用超聲波功率小于最佳超聲波功率時(shí)，黃酮得率會(huì)隨著超聲波功率的增大而增加，當(dāng)超聲波功率大于最佳超聲波功率時(shí)，黃酮得率隨著超聲波功率的增大而下降?？赡苡捎诋?dāng)超聲波功率過高時(shí)，黃酮部分降解于溶液中，造成得率降低。

2.2.2 超聲時(shí)間對(duì)萬年蒿總黃酮得率的影響

選定超聲波功率為600 W，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，料液比1∶20，研究不同超聲時(shí)間對(duì)萬年蒿總黃酮得率的影響，結(jié)果如圖3所示。黃酮得率最大時(shí)，超聲時(shí)間為50 min，所采用超聲時(shí)間小于最佳超聲時(shí)間時(shí)，黃酮得率會(huì)隨著超聲時(shí)間的增加而提高，當(dāng)超聲時(shí)間大于最佳超聲時(shí)間時(shí)，黃酮得率隨著超聲時(shí)間的增加而下降?？赡艿脑蚴钱?dāng)超聲時(shí)間過長(zhǎng)時(shí)，黃酮會(huì)進(jìn)一步降解，造成得率降低。

圖2 超聲波功率對(duì)萬年蒿總黃酮得率的影響

圖3 超聲時(shí)間對(duì)萬年蒿總黃酮得率的影響

2.2.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)萬年蒿總黃酮得率的影響

選定超聲波功率為600 W，超聲時(shí)間為50 min，料液比1∶20，研究不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)萬年蒿總黃酮得率的影響，結(jié)果如圖4所示。黃酮得率最大時(shí)，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，所采用乙醇體積分?jǐn)?shù)小于最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)時(shí)，黃酮得率會(huì)隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的提高而增加，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)大于最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)時(shí)，黃酮得率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的提高而下降。由于乙醇體積分?jǐn)?shù)的進(jìn)一步增大會(huì)將所提取出的有效物質(zhì)黃酮降解，導(dǎo)致黃酮的得率降低。

2.2.4 料液比對(duì)萬年蒿總黃酮得率的影響

選定超聲波功率為600 W，超聲波時(shí)間為50 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，研究不同料液比對(duì)萬年蒿總黃酮得率的影響，結(jié)果如圖5所示。黃酮得率最大時(shí)，料液比為1∶20，料液比過高或過低都會(huì)導(dǎo)致黃酮得率下降。

圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)萬年蒿總黃酮得率的影響

圖5 料液比對(duì)萬年蒿總黃酮得率的影響

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

正交試驗(yàn)結(jié)果見表2，方差分析見表3。影響超聲-纖維素酶協(xié)同提取總黃酮的主要因素是超聲波功率，而乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比的影響相對(duì)較小。各因素的主次順序是：超聲波功率＞超聲時(shí)間＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞料液比。最優(yōu)提取條件為：超聲波功率為600 W，超聲波時(shí)間為50 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，料液比1∶20。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果

2.4 抗氧化活性試驗(yàn)

總黃酮的抗氧化活性試驗(yàn)結(jié)果見圖6。如圖6所示，當(dāng)總黃酮的濃度提高時(shí)，體系對(duì)DPPH的清除率也逐漸增大。數(shù)據(jù)表明，試驗(yàn)提取過程中沒有對(duì)黃酮的抗氧化性造成破壞。

圖6 總黃酮提取液的抗氧化活性測(cè)試曲線

2.5 還原力的測(cè)定試驗(yàn)

總黃酮的還原能力測(cè)定結(jié)果見圖7。如圖7所示，當(dāng)總黃酮的濃度提高時(shí)，體系對(duì)鐵離子的還原能力也逐漸提高。當(dāng)提取液中總黃銅濃度為1.6 mg/mL時(shí)，還原能力開始趨于平穩(wěn)但還是在逐漸提高。數(shù)據(jù)表明，超聲-纖維素酶協(xié)同提取過程中沒有對(duì)黃酮的還原性造成破壞。

圖7 總黃酮提取液的還原能力測(cè)試曲線

3 結(jié)論

萬年蒿中黃酮提取的最佳提取工藝為：纖維素酶用量8 mg/g，超聲波功率為600 W，超聲波時(shí)間為50 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，料液比1∶20（g∶mL）。在此條件下，黃酮得率為3.31 mg/g，且在提取過程中沒有對(duì)黃酮的抗氧化性和還原性造成破壞。