響應(yīng)曲面法優(yōu)化雷公藤甲素的微波萃取工藝

曾晶，朱龍

（1.湘南學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖南郴州，423000；2.深圳東陽光藥業(yè)有限公司，廣東深圳，518000）

雷公藤（TripterygiumwilfordiiHook F，TwHF）又名黃藤根、斷腸草、菜蟲藥、南蛇根和旱禾花等，為衛(wèi)矛科雷公藤屬植物，是一個有著上千年應(yīng)用歷史的中藥。其主要活性成分雷公藤甲素（Triptolide，TPL）是一種環(huán)氧二萜內(nèi)酯化合物[1-3]，結(jié)構(gòu)式見圖1。大量體內(nèi)和體外的研究證明，雷公藤甲素具有抗炎、免疫抑制、抗癌和抗HIV病毒等藥理作用，在臨床上治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和腎病綜合癥等疾病療效顯著[4-5]。

圖1 雷公藤甲素的結(jié)構(gòu)式

近年來，越來越多的研究集中于雷公藤甲素提取方法的優(yōu)化，目前普遍采用的方法為水提醇沉法、乙酸乙酯和氯仿等有機溶劑萃取[6-7]。然而，這些方法具有產(chǎn)量低、污染大、程序復(fù)雜和耗時長等缺點[8-10]。為提高產(chǎn)品的回收率和資源的利用率，本實驗采用微波輔助萃取法對雷公藤甲素進行提取分離，并在單因素試驗的基礎(chǔ)上，進一步通過響應(yīng)曲面法（Response surfacemethodology，RSM）優(yōu)化微波萃取過程中的各因素，為規(guī)模生產(chǎn)提供有價值的工藝參數(shù)，以促進新藥的開發(fā)。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器

LC-20AD高效液相色譜儀，日本島津，G80F20CN2L-B8RO型微波爐，格蘭仕微波爐電器有限公司，RE－3000D型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠，十萬分之一電子天平，梅特勒-托利多公司。

1.2 樣品和試劑

雷公藤（湖南蜂祥中藥材有限公司）；雷公藤甲素對照品，純度＞98%，上海源葉生物科技有限公司；乙腈，色譜純，上海阿拉?。灰掖迹ㄉ虾０⒗。┑绕渌噭┚鶠榉治黾儭?/p>

1.3 試驗方法

1.3.1 供試品制備

將雷公藤干燥根粉碎后過60目篩，得到雷公藤粉末。稱取雷公藤粉末1.00 g，加入一定量乙醇溶劑，按照不同的料液比、萃取時間進行微波萃取、離心，吸取上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥，采用中性氧化鋁層析柱進行富集。

1.3.2 高效液相色譜檢測條件

Ultimate XB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相A：水；流動相B：乙腈。洗脫梯度：0～24 min，10%～50% B；24～25 min，50～10% B，25～30 min，10% B，檢測波長218 nm，柱溫為室溫，流速1 mL/min，進樣量20 μL。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取雷公藤甲素對照品7.0 mg，加入50%乙腈水溶液制成7 mg/mL的儲備液。再逐級稀釋，最終得到濃度分別為 5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL和80 μg/mL的對照品溶液。按2.2項下色譜條件測定，以對照品濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=2.137×106x+576.8（R2=0.998 2），在 5～80 μg/mL線性良好。

1.3.4 單因素試驗

選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比和微波時間這3個因素，考察其對雷公藤甲素得率的影響。其中，乙醇體積分?jǐn)?shù)設(shè)置60%、70%、80%、90%和99.5%共5個水平；料液比設(shè)置1∶5、1∶10、1∶15、1∶20和1∶25（g∶mL）共5個水平；微波時間設(shè)置4 min、6 min、8 min、10 min和12 min共5個水平。

2.5 響應(yīng)曲面法優(yōu)化雷公藤甲素提取工藝

以雷公藤甲素萃取得率為考查指標(biāo)，在單因素試驗基礎(chǔ)上，以乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、微波時間為試驗因素，每因素選取3個水平進行響應(yīng)曲面設(shè)計試驗。根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計原理，采用Design-Expert 10.0.7進行三因素三水平的響應(yīng)面分析法優(yōu)化雷公藤甲素的提取工藝參數(shù)，試驗因素及水平見表1。

表1 試驗因素與水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

乙醇體積分?jǐn)?shù)對雷公藤甲素提取效果的影響如圖2所示，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)不斷增大時，雷公藤甲素的得率先增大后減小，乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時，得率最高。其原因可能是當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)較小時，雷公藤甲素的溶解度隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而增大，但乙醇體積分?jǐn)?shù)較大時，溶劑極性變小，雷公藤甲素溶解度降低。

料液比對雷公藤甲素提取效果的影響如圖3所示。在雷公藤粉末質(zhì)量一定的情況下，隨著提取液體積的不斷增大，雷公藤甲素的得率先增大后趨于平緩，當(dāng)料液比為1∶15（g/mL）時，得率最大。其原因可能是隨著溶劑用量的增加，溶于溶劑中的雷公藤甲素增多，但溶劑用量達到一定值后，溶于溶劑中的雷公藤甲素的量不再改變。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對雷公藤甲素得率的影響

圖3 料液比對雷公藤甲素得率的影響

微波時間對雷公藤甲素提取效果的影響如圖4所示，隨著微波時間的不斷增大，雷公藤甲素的得率先增大后減小，可能是因為溫度升高會導(dǎo)致分子熱運動加快，有利于雷公藤甲素的提取，但時間過長，則會導(dǎo)致雷公藤甲素分解。當(dāng)微波時間為8 min時，有最大得率。

圖4 微波時間對雷公藤甲素得率的影響

2.2 雷公藤甲素提取響應(yīng)面分析試驗結(jié)果

以雷公藤甲素得率為響應(yīng)值，利用Design-Expert 10.0.7軟件進行分析，得到回歸方程為：得率=1.19+0.078A+0.076B+0.15C-0.027AB-8.75×10-3AC+0.016BC-0.11A2–0.09B2–0.044C2，方差分析結(jié)果如表2所示。

由表2可知，影響雷公藤甲素得率的因素順序為：微波時間＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞料液比。其中，微波時間為極顯著因素，乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比為顯著因素，整體模型達到了極顯著水平（P＜0.01）。模型的R2為0.913 3，失擬項不顯著（P＞0.05），說明試驗?zāi)Ｐ蛿M合充分，可靠性高。

表2 回歸模型方差分析結(jié)果

各因素對響應(yīng)值的影響可通過響應(yīng)曲面表示，結(jié)果見圖5～7。從圖5可看出，當(dāng)料液比固定不變時，雷公藤甲素得率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大出現(xiàn)先升高后降低的趨勢；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)固定不變時，雷公藤甲素得率隨著料液比的增大而增大。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為76%～95%，料液比為1∶（14～23）時，雷公藤甲素得率接近最大值。

圖5 乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比對雷公藤甲素得率的交互影響

由圖6可見，當(dāng)微波時間固定不變時，雷公藤甲素得率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大出現(xiàn)先升高后降低的趨勢；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)固定不變時，雷公藤甲素得率隨著微波時間的增大出現(xiàn)先升高后降低的趨勢。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為76%～95%，微波時間在7～10 min時，雷公藤甲素得率接近最大值。

圖6 乙醇體積分?jǐn)?shù)和微波時間對雷公藤甲素得率的交互影響

由圖7可見，當(dāng)微波時間固定不變時，雷公藤甲素得率隨著料液比的增大而增大；當(dāng)料液比固定不變時，雷公藤甲素得率隨著微波時間的增大出現(xiàn)先升高后降低的趨勢。當(dāng)料液比為1∶（14～23），微波時間為7～10 min時，雷公藤甲素得率接近最大值。

圖7 料液比和微波時間對雷公藤甲素得率的交互影響

通過Design-Expert 10.0.7軟件得到雷公藤甲素的最佳微波提取條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)84.9%，料液比1∶19.7，微波時間7 min。考慮實際操作的可行性，確定最佳提取條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)85%，料液比1∶20，微波時間7 min。為了驗證試驗的準(zhǔn)確性，在此條件下進行3次平行試驗，得到雷公藤甲素的得率的平均值為1.31×10-3%，與模型預(yù)測值接近，說明利用此模型可以確定雷公藤甲素微波萃取的最佳提取工藝條件。

3 結(jié)論

本文在單因素分析的基礎(chǔ)上，用響應(yīng)曲面法建立了以雷公藤甲素為響應(yīng)值，以乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比和微波時間為試驗因子的回歸模型，此模型擬合良好。經(jīng)優(yōu)化得到最佳萃取條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)85%，料液比1∶20，微波時間7 min。本實驗為提取雷公藤甲素提供了一種有效方法，為規(guī)模生產(chǎn)提供了有價值的工藝參數(shù)。