羧肽酶在大豆蛋白水解中的脫苦作用

□ 石 慧 創(chuàng)嚴(yán)檢測（天津）有限公司

大豆蛋白的營養(yǎng)價值非常高，屬于人類膳食中尤為重要的蛋白來源之一。而大豆蛋白水解物的加工性能和營養(yǎng)特性對比大豆蛋白擁有明顯的優(yōu)勢，進(jìn)而呈現(xiàn)出非常廣闊的應(yīng)用前景，現(xiàn)如今，在營養(yǎng)保健、療效和速溶飲料等食品中得以廣泛運用。除此之外，大豆蛋白水解物中的部分大豆多肽的生理和營養(yǎng)功能獲得了人們的高度認(rèn)可[1]。

但是，大豆蛋白酶在水解為低分子肽與胨時，將會無法避免的將會產(chǎn)生很多不良味道，尤其是苦味?？辔兜某霈F(xiàn)影響了食物中大豆蛋白水解物的具體應(yīng)用，主要是因為水解物的苦味會造成產(chǎn)品出現(xiàn)味道缺陷。從二十世紀(jì)中期至今，陸續(xù)有許多關(guān)于大豆蛋白水解物中苦肽及其降低或是消除的研究報道，且時至今日依舊在不斷的研究中。本文對苦味肽的呈味理論進(jìn)行了論述，在此背景下，針對消除大豆蛋白水解物苦味的方式進(jìn)行了探討。

1 大豆蛋白水解的主要方法

1.1 酸、堿水解法

在適宜溫度下，酸堿法是利用酸、堿等化學(xué)試劑讓蛋白質(zhì)分子的肽鏈斷裂產(chǎn)生眾多小分子的物質(zhì)?？梢驗閴A法水解消旋了過多的氨基酸，沒有了生物利用價值，所以，不適宜利用；而酸法一般會利用硫酸、鹽酸等強(qiáng)酸在高溫狀態(tài)下發(fā)生反應(yīng)，并且反應(yīng)十分強(qiáng)烈，設(shè)備會受到嚴(yán)重的腐蝕，水解非常徹底，通常會生成氨基酸混合物，與此同時，在高溫狀態(tài)下，色氨酸被徹底破壞，現(xiàn)已逐漸被淘汰使用。

1.2 酶水解法

對于酶法水解大豆蛋白的研究，最開始是利用酶進(jìn)行蛋白質(zhì)的降解，提高其分子內(nèi)部或是分子之間的交聯(lián)度或是連接特殊功能基團(tuán)，改善蛋白質(zhì)的功能，獲取較好的加工特性。

隨著酶制劑工業(yè)與食品工業(yè)的飛速發(fā)展，人們逐漸了解到，通過酶法改性，不但反應(yīng)條件十分溫和，產(chǎn)品顏色較淺，可靠安全，而且水解產(chǎn)物在味道、工藝、營養(yǎng)等多個方面都比酸、堿水解法存在明顯優(yōu)勢。因此，人們的注意力集中在了蛋白水解產(chǎn)物多肽方面。美國與日本在大豆蛋白酶解工藝與酶解過程的感官特點、功能特點、改善營養(yǎng)價值的研究中獲得重大突破以后，很多發(fā)展中國家也在陸續(xù)針對功能性大豆多肽開展研究?？梢驗槊附馕锎嬗锌辔兜?，嚴(yán)重影響了其在食品工業(yè)中的實際應(yīng)用。

2 大豆蛋白水解物呈苦味機(jī)制

通常，天然蛋白質(zhì)的疏水性基團(tuán)均在蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)內(nèi)部，不會出現(xiàn)苦味。但是，蛋白質(zhì)水解為小分子多肽的過程會暴露出疏水性氨基酸殘基，此氨基酸殘基刺激舌頭味蕾，就會讓人們感受到苦味。因此，蛋白質(zhì)中含有越高的疏水性氨基酸，水解過程中就會出現(xiàn)更多苦肽。

蛋白酶作用于大豆蛋白分子，切斷內(nèi)部的肽鍵，生成小分子肽段。在這些小分子肽段的末端會攜帶氨基酸分子，這些氨基酸分為親水氨基酸（Asp，Glu，Arg，Lys，His，Ser，Thr） 和疏 水 氨 基 酸（Gly，Ala，Pro，Tyr，Val，Met，Ile，Leu，Phe，Cys）。攜帶疏水氨基酸的多肽感官評價為苦味，被稱為苦味肽。這就是大豆蛋白一些酶解產(chǎn)物呈苦味的原因。

研究表明：疏水性氨基酸由于肽鍵的形成居于肽鏈非端基位置時，表現(xiàn)出的苦味最大，當(dāng)它居于C、N端時苦味較低，以游離氨基酸的形式存在時苦味最低[2]。

表1 多肽的氨基酸殘基的疏水度值

3 大豆蛋白水解物的苦味脫除方法

3.1 選擇性分離法

根據(jù)苦味物質(zhì)的疏水性，采用乙醇抽提或疏水性樹脂吸咐，式去除苦味的一種方法。此外，還有報道采用丁醇和水共沸混合物來脫除大豆蛋白水解物中的苦肽，丁醇相選擇性富集了苦肽，從而達(dá)得一定的脫苦效果。該法脫苦有效、操作簡單、成本低，但是會不同程度地造成蛋白氮損失。

3.2 掩蓋法

可采用環(huán)狀糊精、多磷酸鹽、谷氨酸、天門冬氨酸等物質(zhì)來掩蓋苦肽的苦味。其中，環(huán)狀糊精具有較佳的掩蓋苦味的效果，因為它能包絡(luò)苦肽的疏水性基團(tuán)并形成絡(luò)合物，然而達(dá)得一定的脫苦效果，但是所需要的環(huán)狀糊精的量是很大的。

3.3 超濾法

超濾分離主要是依據(jù)于分子量的大小，而大豆蛋白水解物中的苦肽分子量一般比不苦的多肽要小得多，利用超濾可以實現(xiàn)脫除苦肽的目的。有較多研究人員已成功運用超濾來脫除苦肽，疏水苦肽的脫除幾乎不影響分離物的蛋白質(zhì)效率比（PER），這點非常重要，因大多呈苦味的氨基酸也是人體必需的，而此類氨基酸的脫除會導(dǎo)致PER顯著降低。然而，該法也存在許多問題，如對超濾膜的要求較高、制造成本較高等。

3.4 酶法

對于蛋白質(zhì)水解酶，根據(jù)作用位點來講，可以分成內(nèi)肽酶和外肽酶。內(nèi)肽酶主要是作用在肽鏈中間的肽鍵，這類酶的水解結(jié)果主要是將多肽降解為許多小肽與氨基酸。外肽酶的作用與其并不相同，其可以讓肽鏈末端的肽鍵水解，外肽酶分成氨肽酶與羧肽酶，他們分別從肽鏈的氨末端與羧末端逐漸水解游離出氨基酸。

相關(guān)研究顯示，大部分苦肽都含有很多的疏水性氨基酸，并且疏水性氨基酸通常處于苦肽的末端，若是切除這種疏水性氨基酸，苦肽的苦味就會顯著降低，游離出的疏水氨基酸苦味也會遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于苦肽，這也是利用外切多肽酶脫除蛋白質(zhì)水解物苦味的基礎(chǔ)[3]。

4 羧肽酶在大豆蛋白水解中的脫苦作用

4.1 羧肽酶的分類

按來源可分為植物羧肽酶、動物羧肽酶和微生物羧肽酶。植物羧肽酶一般是小麥羧肽酶。動物羧肽酶主要存在于豬、牛等的胰臟中，數(shù)量非常有限，價格昂貴，使其的應(yīng)用受到限制。微生物羧肽酶即使用微生物發(fā)酵法得到的羧肽酶，與前兩種相比，具有非常廣闊的應(yīng)用前景。目前已有報道的可產(chǎn)生羧肽酶的微生物有黑曲霉、紅曲霉、米曲霉與毛霉等。

按水解氨基酸的性質(zhì)，羧肽酶可以分為羧肽酶A和羧肽酶B。羧肽酶A可水解由芳香族和中性脂肪族氨基酸形成的羧基末端，比如Tyr、Phe、Ala等。羧肽酶B主要水解堿性氨基酸形成的羧基末端，如Lys、Arg等。

4.2 羧肽酶脫苦作用機(jī)制

苦肽的苦味不僅與其疏水度有關(guān)，而且與氨基酸排序順序和多肽空間結(jié)構(gòu)有關(guān)。Ishibashi[4]等人研究了含有Leu、phe、Tyr等疏水性氨基酸組成的多肽的苦味與此類氨基酸順序的相互關(guān)系，指出此類氨基酸存在于多肽的C-末端時，苦肽的苦味更強(qiáng)，同時推測此情況適合于絕大部分疏水性氨基酸殘基。

較早之前，Aria等[5]利用黑曲霉（Asergillius）的羧肽酶對大豆蛋白水解物進(jìn)行處理之后發(fā)現(xiàn)，其中存在的多肽苦味有所降低，根據(jù)推測，對水解物中的苦肽實施脫苦處理起到了作用。然后，Umetsu等[6]利用小麥的羧肽酶處理酪蛋白水解物，能夠發(fā)現(xiàn)游離的氨基酸明顯增多，其苦味降低，而釋出的氨基酸大部分是疏水性氨基酸（Δf＞61 698 kJ/mol），由此可見，羧肽酶具備適當(dāng)?shù)目嚯目辔睹摮Ч?。不僅如此，部分霉菌來源的蛋白酶也具備適當(dāng)?shù)聂入拿富钚訹7]。日本學(xué)者M(jìn)asaaki Yasuda[8]研究了紅曲羧肽酶對胃蛋白酶水解物的脫苦作用。測定了只使用胃蛋白酶和使用紅曲羧肽酶與胃蛋白酶組成的復(fù)合酶水解大豆蛋白所產(chǎn)生的親水性和疏水性游離氨基酸的比例，結(jié)果發(fā)現(xiàn)前者為1∶1，而后者為1∶2?？梢娂t曲羧肽酶對疏水性氨基酸具有較高的選擇性，對大豆蛋白水解物具有脫苦效果。

5 結(jié)語

我國作為大豆重要的生產(chǎn)國之一，大豆的產(chǎn)量大約占世界整體產(chǎn)量的10%。大豆多肽作為大豆蛋白質(zhì)水解物，可有效改善原料中蛋白的理化特點，不僅如此，還可以為產(chǎn)品賦予特殊的生理活性（相比于大豆蛋白，具備非常高的吸收率，可以迅速提供能量、推動微生物生長、推動脂肪代謝與降低過敏原等）。但由內(nèi)肽酶水解得到的大豆多肽最大的缺陷就是帶有一種令人難以接受的苦味，從而影響了其在食品工業(yè)中的應(yīng)用。

苦味肽的呈苦原因就是肽鏈C-末端或N-末端末端攜帶疏水性氨基酸，而且這些疏水性氨基酸存在于C-末端時苦味更為明顯。羧肽酶作為一種外肽酶，具有廣泛作用位點，可以水解大多數(shù)疏水氨基酸，從而抑制和逆轉(zhuǎn)內(nèi)肽酶水解大豆蛋白時產(chǎn)生的苦味。

微生物羧肽酶作為羧肽酶的來源之一，與植物羧肽酶和動物羧肽酶相比生產(chǎn)成本較低、產(chǎn)量更高，具有非常廣闊市場和應(yīng)用前景。