UHPLC法測(cè)定不同產(chǎn)地雷公藤飲片中雷公藤甲素和紅素的含量*

葛丹丹，高家榮，鮑學(xué)梅，楊滿琴，徐 倩，蘇 毅

(1 安徽中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230061；2 安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230061；3 安徽中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230061)

藥用雷公藤飲片系衛(wèi)矛科植物雷公藤(TripterygiumwilfordiiHook.f.)的干燥根皮。性：苦，有大毒。其主要功效有活血通絡(luò)、祛風(fēng)除濕、消腫定痛等[1]?，F(xiàn)代研究表明雷公藤在治療風(fēng)濕及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、抗腫瘤、糖尿病性腎病的腎臟保護(hù)[2-4]等方面具有確切療效。雷公藤甲素與雷公藤紅素是雷公藤有效成分。雷公藤甲素可通過抑制糖尿病大鼠腎組織RANTES的過度表達(dá)，從而改善腎間質(zhì)的纖維化和腎小球功能[5]；亦可誘導(dǎo)急性T淋巴細(xì)胞性白血病的細(xì)胞凋亡而治療白血病[6]；同時(shí)，雷公藤甲素可抑制小鼠乳腺癌細(xì)胞4T1的增殖，此抗增殖作用與其降低ERα、ERβ的磷酸化密切相關(guān)[7]。雷公藤紅素對(duì)腦缺血后血管和細(xì)胞重生具有保護(hù)作用[8]；也可治療諸如卵巢癌[9]等腫瘤。對(duì)高糖誘導(dǎo)的大鼠糖尿病心肌病的心肌H9C2細(xì)胞具有抑制作用從而發(fā)揮對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用[10]。目前，雷公藤飲片在諸多方面已經(jīng)得到非常廣泛的應(yīng)用，但在市場(chǎng)上不同來源、產(chǎn)地、加工及儲(chǔ)存方法等的差異導(dǎo)致飲片的質(zhì)量亦有所不同，進(jìn)而影響其臨床療效。因此，本研究運(yùn)用UHPLC技術(shù)對(duì)不同產(chǎn)地雷公藤飲片中雷公藤甲素和雷公藤紅素的含量進(jìn)行測(cè)定，以期為進(jìn)一步研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀 器

1290 InfinityⅡUHPLC 色譜儀，Agilent Technologies；DK-S24電熱恒溫水浴鍋，上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；BP211D型十萬(wàn)分之一天平，德國(guó)Sartorius公司；XFB-200 高速中藥粉碎機(jī)，中國(guó)吉首市中州制藥機(jī)械廠。

1.2 試 藥

雷公藤甲素對(duì)照品(批號(hào)：111567，純度為99.8%)，中國(guó)食品藥品檢定研究院；雷公藤紅素對(duì)照品(批號(hào)：111946，純度為97.0%)，中國(guó)食品藥品檢定研究院。乙腈為色譜純，水為超純水，其他均為分析純。

雷公藤飲片分別購(gòu)自湖北、廣東等地，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院鮑學(xué)梅主任鑒定為衛(wèi)矛科雷公藤(TripterygiumwilfordiiHook.f.)的根。來源見表1。

表1 雷公藤飲片來源

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性

色譜柱：Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm ×100 nm，1.7 μm)；流動(dòng)相：乙腈(B)-0.1%磷酸水(A)，梯度洗脫：0～2 min，95% B；2～12 min，88%B；12～17 min，85%B；17～26 min，76%B；26～44 min，40%B；44～49 min，20%B；49～55 min，5%B；55～56 min，95%B。流速：0.5 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；柱溫：25 ℃。在此色譜條件下，雷公藤甲素與雷公藤紅素與其他色譜峰均可達(dá)到有效分離，雷公藤甲素的理論塔板數(shù)為58328，雷公藤紅素的理論塔板數(shù)為609362，均符合要求。雷公藤甲素與雷公藤紅素的分離度>1.5，符合《中國(guó)藥典》中的規(guī)定。空白溶劑對(duì)含量測(cè)定無(wú)干擾，如圖1所示。其中，雷公藤甲素為1號(hào)峰、雷公藤紅素為2號(hào)峰。

圖1 UHPLC色譜圖

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱取雷公藤甲素及雷公藤紅素對(duì)照品適量置于10 mL的量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別制得質(zhì)量濃度為0.115 mg/mL和0.137 mg/mL的雷公藤甲素與雷公藤紅素對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備

取各產(chǎn)地雷公藤飲片，干燥后打成粉(過三號(hào)篩)。取藥材粉末10 g至錐形瓶中，加甲醇-乙腈(1∶2，V/V)150 mL水浴回流提取2 h，再次稱定質(zhì)量，補(bǔ)足減失的質(zhì)量。過濾，取濾液濃縮近干。加甲醇20 mL使溶解，過SPE中性氧化鋁柱，用二氯甲烷-甲醇(7∶3)50 mL洗脫，收集洗脫液濃縮至干，用甲醇溶解并稀釋定容至10 mL容量瓶中，作為供試品溶液。進(jìn)樣前過0.22 μm微孔濾膜。

2.3 線性關(guān)系考察

精密吸取配制好的對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，將其稀釋到一定濃度，用甲醇配制7個(gè)濃度梯度的對(duì)照品溶液，按上述“2.1項(xiàng)”色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜峰面積，以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)(X)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸分析，得雷公藤甲素的回歸方程為：Y=807211X-40938(R2=0.9994)；雷公藤紅素的回歸方程為：Y=939678X-54915(R2=0.9991)。雷公藤甲素與雷公藤紅素的線性范圍分別為0.23～115 μg/mL、0.137～27.4 μg/mL。

2.4 精密度試驗(yàn)

分別精密吸取上述對(duì)照品溶液，照“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，測(cè)定色譜峰面積，結(jié)果雷公藤甲素的RSD為1.67%，雷公藤紅素的RSD為2.53%。符合精密度要求，表明儀器精密度良好。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

稱取湖北產(chǎn)雷公藤藥材粉末6份，每份10 g，按上述供試品溶液制備方法制備，按“2.1項(xiàng)”下色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)定色譜峰面積并計(jì)算各樣品含量。結(jié)果，雷公藤甲素含量的RSD為1.34%；雷公藤紅素含量的RSD為2.26%。表明本方法的重復(fù)性良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱取湖北產(chǎn)同一批雷公藤飲片，按上述“2.2”項(xiàng)下條件制備供試品，分別于0、2、4、8、12、24 h后，照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積。計(jì)算雷公藤甲素和雷公藤紅素RSD分別為2.15%和3.24%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

取湖北產(chǎn)雷公藤藥材粉末6份，每份10 g，精密稱定，分別精確加入與雷公藤藥材含量等量的雷公藤甲素對(duì)照品0.5130 mg和雷公藤紅素對(duì)照品0.5850 mg，按上述“2.2”項(xiàng)下條件制備供試品溶液，再按上述“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算平均加樣回收率。結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.8 樣品含量測(cè)定

分別取湖北、福建、云南、廣東四個(gè)產(chǎn)地雷公藤藥材粉末各3份，每份約10 g，照上述供試品溶液制備方法制備供試品，按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含量。結(jié)果見表3。

表3 不同產(chǎn)地雷公藤藥材中雷公藤甲素和雷公藤紅素的含量

3 結(jié) 論

3.1 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)對(duì)甲醇、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、甲醇-乙腈(1∶1)等不同提取溶劑及水液回流、超聲等提取方法，提取時(shí)間，提取次數(shù)等進(jìn)行了考察，最終選擇甲醇-乙腈(1∶2)作為提取溶劑，提取時(shí)間2 h。由于雷公藤飲片中所含化學(xué)成分非常復(fù)雜且雷公藤甲素和雷公藤紅素的含量相對(duì)較少，因此在樣品處理過程中對(duì)其進(jìn)行分離、純化和富集。在參考沈秋林等[11]對(duì)雷公藤甲素提取方法的基礎(chǔ)上考察了中性氧化鋁柱與硅膠柱對(duì)分離的影響后發(fā)現(xiàn)使用硅膠柱雷公藤甲素與紅素的分離效率低。因此，最終選擇使用中性氧化鋁柱對(duì)樣品進(jìn)行分離與富集。在洗脫過程中，二氯甲烷、二氯甲烷-甲醇(10∶1)、二氯甲烷-甲醇(9∶1)等進(jìn)行洗脫，洗脫速度慢，最終使用了二氯甲烷-甲醇(7∶3)作為洗脫液，洗脫速度快。

3.2 不同產(chǎn)地樣品含量分析

對(duì)福建等四個(gè)產(chǎn)地的雷公藤飲片進(jìn)行了含量測(cè)定后發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地的飲片中雷公藤甲素和雷公藤紅素的含量差別較大，且同一產(chǎn)地的飲片中雷公藤甲素和紅素含量亦存在明顯差異。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，雷公藤甲素在云南和湖北產(chǎn)的雷公藤飲片中含量較高，而福建、廣東產(chǎn)的飲片含量較低。雷公藤紅素則在湖北、廣東產(chǎn)的飲片中含量較高，而在云南和福建產(chǎn)的飲片則含量低。在同一產(chǎn)地飲片中，云南產(chǎn)飲片中雷公藤甲素和紅素含量差異最為顯著。

本研究通過對(duì)雷公藤甲素和雷公藤紅素兩種物質(zhì)進(jìn)行含量測(cè)定，發(fā)現(xiàn)市售不同產(chǎn)地的雷公藤飲片的質(zhì)量存在差異。然而，由于中藥雷公藤所含物質(zhì)復(fù)雜[12-14]且本實(shí)驗(yàn)所采集的雷公藤飲片的產(chǎn)地有限等問題，因此，需通過進(jìn)一步研究來綜合評(píng)價(jià)各產(chǎn)地雷公藤飲片的質(zhì)量。