毛細(xì)管電泳結(jié)合電噴霧質(zhì)譜分析人類癌基因c-myb四鏈體核酸與活性天然產(chǎn)物的相互作用

王雙雙, 楊云鶴, 凡珊珊, 李卉卉1,*, David D. Y. CHEN

(1. 南京師范大學(xué)常州創(chuàng)新發(fā)展研究院, 江蘇 常州 213022; 2. 生物醫(yī)藥功能材料國家地方聯(lián)合工程研究中心,江蘇省生物醫(yī)藥功能材料協(xié)同創(chuàng)新中心, 南京師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院, 江蘇 南京 210023;3. Department of Chemistry, University of British Columbia, Vancouver, BC V6T 1Z1, Canada)

人類癌基因c-myb與在禽白血病病毒中發(fā)現(xiàn)的癌基因V-mybs同源,其編碼的轉(zhuǎn)錄因子在造血系統(tǒng)和胃腸系統(tǒng)的細(xì)胞增殖分化和生長過程中起重要的調(diào)節(jié)作用[1-3]。近些年的研究發(fā)現(xiàn),癌基因c-myb可通過維持細(xì)胞增殖和阻止細(xì)胞終止分化,來影響白血病的發(fā)生[4]。生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)表明,在結(jié)直腸癌、肝癌、子宮癌和腺樣囊性癌等組織中,癌基因c-myb存在過度表達(dá)[5-7]。因此,c-myb已成為結(jié)直腸癌、白血病、乳腺癌等癌癥疾病潛在的治療靶點(diǎn)[8]。生物信息學(xué)研究表明,c-myb啟動(dòng)子區(qū)包含多個(gè)GGA重復(fù)序列,可能折疊形成G-四鏈體(G4)(見圖1)。作為一類特殊的“非經(jīng)典”二級(jí)結(jié)構(gòu),G4通常位于一些與基因轉(zhuǎn)錄復(fù)制和疾病的產(chǎn)生等有關(guān)的區(qū)域,尤其在癌基因啟動(dòng)子區(qū)含量豐富[9-12]。最近的體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),c-myb啟動(dòng)子區(qū)存在一個(gè)新的調(diào)控元件,G4識(shí)別分子通過穩(wěn)定其結(jié)構(gòu)來調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[13-15]。由此可見,c-myb啟動(dòng)子區(qū)形成的G4對(duì)c-myb功能的調(diào)控起重要作用,篩選其結(jié)合分子并明確相互作用機(jī)制極有必要。

圖 1 G4 DNA和篩選出的3種天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Structures of the G-quadruplex (G4) DNA and three screened natural product molecules

目前用于研究G4 DNA與小分子相互作用的方法有很多,包括表面等離子共振(SPR)[16]、等溫量熱滴定(ITC)[17]、熒光光譜[18]和圓二色譜(CD)[19]等。毛細(xì)管電泳(CE)具有分離模式多、分離效率高、樣品用量少、檢出限低等特點(diǎn),尤其在模擬生理環(huán)境來維持生物分子活性方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì),已成功用于生物分子相互作用分析[20-22]。毛細(xì)管前沿分析(CE-FA)通過往毛細(xì)管中進(jìn)一段體積相對(duì)較大(約100 nL)的主客體混合樣品,在遷移過程中形成平臺(tái)峰,通過未結(jié)合客體分子的峰高變化來確定其結(jié)合常數(shù)[23,24]。CE-FA適用于結(jié)合前后遷移率變化不大的主體分子,測量的平臺(tái)峰高不受遷移率的影響,且能夠獲得結(jié)合計(jì)量比,因此在生物分子相互作用領(lǐng)域更有應(yīng)用前景[25]。壓力輔助毛細(xì)管前沿分析(PACE-FA)則是在電泳過程中施加一個(gè)與分析物遷移同向的壓力,在保證結(jié)果準(zhǔn)確度的前提下,能夠大大加快分析速度[26,27]。電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)可快速解析結(jié)合分子與靶點(diǎn)的親合力和化學(xué)計(jì)量關(guān)系,已成為研究分子間非共價(jià)復(fù)合物的有力工具[28]。質(zhì)譜檢測的真空氣相環(huán)境導(dǎo)致對(duì)自由溶液狀態(tài)下的分子間親合力分析存在一定偏差。因此,利用ESI-MS可實(shí)現(xiàn)DNA結(jié)合分子的快速篩選[29]。

本文選擇癌基因c-myb轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)下游+17的一段富G序列S1,該序列緊鄰轉(zhuǎn)錄因子MAZ、RXR/VDR等特異性結(jié)合位點(diǎn)。我們嘗試將PACE-FA和ESI-MS結(jié)合,首先利用ESI-MS對(duì)結(jié)合G4 DNA的活性天然產(chǎn)物進(jìn)行快速篩選,再進(jìn)一步利用PACE-FA確定其結(jié)合的特異性及溶液相的結(jié)合常數(shù),從而建立分析c-myb G4 DNA與天然產(chǎn)物分子相互作用的最適方法,也為G4靶點(diǎn)藥物先導(dǎo)結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)提供一定的理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

PA800 plus毛細(xì)管電泳制藥分析系統(tǒng)(美國Beckman公司),配置PDA檢測器,熔融石英毛細(xì)管(內(nèi)徑75 μm,美國Polymicro公司); Orbitrap FusionTMLumosTMTribridTM三合一質(zhì)譜儀(美國ThermoFisher Scientific公司); Chirascan圓二色譜儀(英國Applied Photophysics公司)。

HPLC純化的癌基因c-myb寡聚核苷酸序列(S1:5′-GGAGGAGGAGGAGAAGGAGGAGGAGGA,Mr=8 666.70)購自上海生工生物工程有限公司。天然產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)品購于上海同田生物技術(shù)有限公司。實(shí)驗(yàn)所用甲醇(CH3OH),二甲亞砜(DMSO)、醋酸銨(NH4OAc),氯化鉀(KCl)和Tris-HCl均為分析純(南京晚晴化玻儀器有限公司)。實(shí)驗(yàn)用水為超純水(18.2 MΩ·cm),由Milli-Q超純水系統(tǒng)制備(美國Millipore公司)。CE實(shí)驗(yàn)中所需溶液使用前均由0.22 μm濾膜過濾。

1.2 溶液的配制

加水將S1 DNA干粉溶解,稀釋得到濃度為100 μmol/L的DNA儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確稱取天然產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)品,用少量CH3OH溶解,再加入超純水,稀釋得到濃度1 mmol/L的天然產(chǎn)物儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確稱取NH4OAc固體,溶解于超純水中,得到濃度為100 mmol/L的NH4OAc儲(chǔ)備液。

1.2.1CD溶液的配制

Tris-HCl緩沖溶液的配制:準(zhǔn)確稱取Tris和KCl,用超純水配制成30 mmol/L Tris溶液(KCl濃度按照具體要求),再用HCl調(diào)至pH=7.4。

DNA樣品溶液的配制:用含有不同濃度KCl的30 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH=7.4)稀釋DNA儲(chǔ)備液至5 μmol/L。在S1 DNA儲(chǔ)備液中加入一定量NH4OAc儲(chǔ)備液,再用超純水稀釋至DNA濃度為5 μmol/L, NH4OAc濃度為25 mmol/L。溶液靜置30 min后,加熱至90 ℃,恒溫10 min,緩慢冷卻至室溫。

1.2.2ESI-MS溶液的配制

DNA樣品溶液的配制:把S1 DNA儲(chǔ)備液用超純水直接稀釋至5 μmol/L,或加入一定量NH4OAc儲(chǔ)備液,再用超純水稀釋至DNA濃度為5 μmol/L、NH4OAc濃度為25 mmol/L的樣品溶液,靜置30 min。

DNA與天然產(chǎn)物混合溶液的配制:將S1 DNA儲(chǔ)備液與天然產(chǎn)物儲(chǔ)備液按不同比例混合,加入一定量NH4OAc儲(chǔ)備液,再用超純水稀釋至DNA濃度為5 μmol/L、NH4OAc濃度為25 mmol/L的混合樣品溶液,靜置30 min。

1.2.3CE溶液的配制

CE背景緩沖溶液(BGE)的配制:將NH4OAc儲(chǔ)備液用超純水稀釋,即得到含有不同濃度NH4OAc的BGE溶液。

DNA樣品溶液的配制:用含有不同濃度NH4OAc的BGE溶液稀釋DNA儲(chǔ)備液,再加入0.5%(體積分?jǐn)?shù))的DMSO作為EOF標(biāo)記物,得到用于CE檢測的濃度為5 μmol/L DNA樣品溶液。

1.2.4PACE-FA溶液的配制

BGE溶液的配制:將NH4OAc儲(chǔ)備液用超純水稀釋,即得到25 mmol/L NH4OAc的BGE溶液。

天然產(chǎn)物樣品溶液的配制:將天然產(chǎn)物儲(chǔ)備液用25 mmol/L NH4OAc的BGE溶液稀釋,得到天然產(chǎn)物濃度分別為5、10、20、50、100、250 μmol/L的樣品溶液。

DNA與天然產(chǎn)物混合溶液的配制:將S1 DNA儲(chǔ)備液與天然產(chǎn)物儲(chǔ)備液按不同比例混合,再用25 mmol/L NH4OAc的BGE溶液稀釋至DNA濃度為5 μmol/L,靜置30 min。

1.3 實(shí)驗(yàn)條件

1.3.1CD實(shí)驗(yàn)

掃描范圍350～220 nm,溫度20 ℃,掃描速度為60 nm/min,所有的DNA樣品濃度均為5 μmol/L,比色皿內(nèi)徑1 mm。每次樣品進(jìn)樣前,均采用背景溶液進(jìn)行基線校準(zhǔn)。每份樣品溶液分別掃描3次,結(jié)果取平均值。

1.3.2ESI-MS實(shí)驗(yàn)

為了獲得穩(wěn)定的離子化效率,樣品溶液在檢測前,加入25%(v/v)CH3OH混合后進(jìn)樣。電噴霧電壓-2.7 kV,離子傳輸管的溫度130 ℃,樣品的流速2.0 μL/min。負(fù)離子模式,掃描范圍m/z500～2 500。數(shù)據(jù)的采集和處理使用Thermo Finnigan公司的Xcalibur軟件完成。

為了比較天然產(chǎn)物分子對(duì)G4 DNA的親合力大小,引入半定量參數(shù)IRa,通過公式(1)計(jì)算[30]:

(1)

其中,Li表示天然產(chǎn)物分子(i=1, 2, 3),Ir[Q]m-表示未結(jié)合的G4 DNA離子峰的相對(duì)強(qiáng)度,Ir[Q+nLi]m-表示復(fù)合物離子峰的相對(duì)強(qiáng)度(n=1, 2;m=5, 6)。

1.3.3CE實(shí)驗(yàn)

熔融石英毛細(xì)管總長38 cm,有效長度30 cm。新毛細(xì)管在使用前依次用0.1 mol/L NaOH沖洗10 min,超純水沖洗10 min, BGE沖洗10 min。當(dāng)使用電壓分離時(shí),進(jìn)樣條件為3.4 kPa、5.0 s,電泳條件為15 kV、10 min;檢測波長為214 nm(檢測DMSO)和254 nm(檢測DNA);柱溫20 ℃。每次進(jìn)樣前用BGE沖洗毛細(xì)管5 min;實(shí)驗(yàn)中的電滲流標(biāo)記物為中性物質(zhì)DMSO。每個(gè)樣品重復(fù)測定3次,取平均值。

根據(jù)公式(2)可以計(jì)算出DNA的凈遷移率:

μDNA=μapp-μeof

(2)

其中,μDNA為DNA的凈遷移率,μapp為DNA的表觀遷移率,μeof為電滲流的遷移率,即DMSO的遷移率。

1.3.4PACE-FA實(shí)驗(yàn)

考慮到部分天然產(chǎn)物在溶液相帶正電荷,使用裸管毛細(xì)管易發(fā)生吸附,這里選擇中性羥丙基纖維素(HPC)涂層毛細(xì)管(總長58 cm,有效長度50 cm)[31,32]。涂層毛細(xì)管使用前用BGE沖洗20 min。進(jìn)樣條件為3.4 kPa、90.0 s,電泳條件為15 kV+6.9 kPa、7 min(丁溴東莨菪堿和荷葉堿), -15 kV+6.9 kPa、7 min(土荊皮乙酸)。檢測波長:200 nm(丁溴東莨菪堿)、210 nm(荷葉堿)、254 nm(土荊皮乙酸);柱溫20 ℃。每次進(jìn)樣前用BGE沖洗毛細(xì)管5 min;每個(gè)樣品重復(fù)測定3次,取平均值。

PACE-FA是將一段體積相對(duì)較大的主客體預(yù)先混合樣品溶液注入BGE中進(jìn)行電泳分離。對(duì)于主體(H)和客體(L)1∶1結(jié)合的相互作用體系而言:

K=[HL]/([H][L])

(3)

公式(3)中,K表示結(jié)合常數(shù),[HL]、[H]和[L]分別表示1∶1結(jié)合的復(fù)合物、未結(jié)合的主體和未結(jié)合的配體濃度。

定義結(jié)合計(jì)量比(I)為每個(gè)主體分子結(jié)合的客體分子數(shù)目[33]:

(4)

其中,下標(biāo)b、f和t分別表示物質(zhì)在混合溶液中已結(jié)合的、未結(jié)合的以及總的濃度。在PACE-FA實(shí)驗(yàn)中,主體的濃度[H]t保持不變,改變客體的濃度[L]t。電泳曲線中的平臺(tái)峰高度與未結(jié)合的客體濃度[L]f相對(duì)應(yīng),可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定[L]f。再對(duì)I-[L]f進(jìn)行非線性擬合,確定結(jié)合常數(shù)K。

圖 2 不同S1 DNA (5 μmol/L)溶液的CD譜圖Fig. 2 CD spectra for S1 DNA (5μmol/L) in different solutions a. 30 mmol/L Tris-HCl (pH 7.4) with 10-50 mmol/L KCl; b. 10 mmol/L KCl, 30 mmol/L Tris-HCl (pH=7.4), and 25 mmol/L ammonium acetate (NH4OAc).

2 結(jié)果與討論

2.1 c-myb癌基因G4 DNA的形成

圖 3 5 μmol/L S1 DNA的ESI-MS圖Fig. 3 ESI-MS spectra for 5 μmol/L S1 DNAa. in water; b. in 25 mmol/L NH4OAc.

圖 4 S1 DNA與不同天然產(chǎn)物混合(物質(zhì)的量之比1∶4, 25 mmol/L NH4OAc)后的ESI-MS譜圖Fig. 4 ESI-MS spectra of the S1 DNA binding with natural products (amount of substance ratio of 1∶4 at 25 mmol/L NH4OAc) a. scopolamine butylbromide; b. nuciferine; c. pseudolaric acid B.

2.2 與G4 DNA結(jié)合的天然產(chǎn)物的快速篩選

建立了基于ESI-MS技術(shù)的快速篩選方法,從數(shù)十種天然產(chǎn)物中尋找與靶點(diǎn)DNA存在結(jié)合的小分子。將S1 DNA與天然產(chǎn)物按不同比例混合,對(duì)得到的ESI-MS譜圖進(jìn)行解析。圖4是S1 DNA與天然產(chǎn)物以摩爾比為1∶4混合后的ESI-MS譜圖。加入丁溴東莨菪堿(L1)后,S1 DNA的ESI-MS譜圖雖然仍以m/z為1 742.24的G4 DNA離子峰[Q1]5-為基峰,但出現(xiàn)明顯的1∶1結(jié)合的復(fù)合物離子峰([Q1+L1]5-和[Q1+L1]6-,m/z分別為1 814.07和1 511.24)。其中,復(fù)合物離子峰[Q1+L1]5-(m/z1 814.07)的相對(duì)豐度達(dá)到70.0%,并且還出現(xiàn)了丁溴東莨菪堿的二聚體離子峰[2L1]-(m/z896.56)。S1 DNA與荷葉堿(L2)混合后,其1∶1結(jié)合的復(fù)合物離子峰([Q1+L2]5-,m/z1 799.57)的相對(duì)強(qiáng)度達(dá)到59.8%。而S1 DNA與土荊皮乙酸(L3)混合后,出現(xiàn)1∶1和1∶2結(jié)合的復(fù)合物離子峰([Q1+L3]5-和[Q1+2L3]5-,m/z分別為1 828.19和1 914.09),相對(duì)強(qiáng)度分別為87.3%和19.5%。譜圖中也出現(xiàn)了土荊皮乙酸的二聚體離子峰[2L3]-(m/z1 451.75)。

為了進(jìn)一步比較這些天然產(chǎn)物分子對(duì)S1 G4 DNA的親合力大小,計(jì)算得到相應(yīng)的IRa值。結(jié)果表明,當(dāng)S1 DNA與天然產(chǎn)物按1∶4的物質(zhì)的量之比混合,得到IRa值分別為:0.37(丁溴東莨菪堿), 0.31(荷葉堿)和0.49(土荊皮乙酸)。由公式(1)不難看出,IRa值越大,G4 DNA中與天然產(chǎn)物結(jié)合的比例就越高,說明該天然產(chǎn)物對(duì)G4 DNA的親合力就越大?？梢?親合力大小依次為土荊皮乙酸>丁溴東莨菪堿>荷葉堿。其中,丁溴東莨菪堿和荷葉堿的親合力相差并不大,且結(jié)合模式都以1∶1為主。而土荊皮乙酸的親合力明顯比丁溴東莨菪堿和荷葉堿強(qiáng),且同時(shí)存在1∶1和1∶2兩種結(jié)合。

2.3 S1 DNA在CE中的遷移行為

圖 5 (a)S1 DNA(檢測波長為254 nm)和(b)DMSO (檢測波長為214 nm)在不同濃度NH4OAc溶液中的CE曲線,以及(c)NH4OAc濃度對(duì)S1 DNA的凈遷移率的影響 Fig. 5 CE electropherograms of (a) S1 DNA detected at 254 nm and (b) DMSO detected at 214 nm in NH4OAc solutions at different concentrations, and (c) effect of the concentration of NH4OAc on the mobility of S1 DNA DMSO: dimethyl sulfoxide.

2.4 G4 DNA與天然產(chǎn)物相互作用的定量分析

雖然利用ESI-MS篩選出了3種能夠與靶點(diǎn)G4 DNA結(jié)合的天然產(chǎn)物,同時(shí)確定了它們的相對(duì)親合力與結(jié)合計(jì)量關(guān)系。但由于ESI-MS的氣相真空檢測環(huán)境與自由溶液相存在一定差異,能否與溶液相的結(jié)果保持一致尚存在疑問[39]。因此,接下來利用PACE-FA進(jìn)一步解析這些結(jié)合是否具有特異性,并確定二者的結(jié)合常數(shù)。

首先,我們配制了一系列不同濃度的天然產(chǎn)物樣品溶液(5～250 μmol/L),通過標(biāo)準(zhǔn)曲線來確定未結(jié)合的天然產(chǎn)物分子平臺(tái)峰的高度與其濃度間的關(guān)系。接著,將S1 DNA與天然產(chǎn)物分子按不同比例混合的樣品溶液注入毛細(xì)管中。在PACE-FA分離過程中,可以觀察到未結(jié)合的天然產(chǎn)物分子平臺(tái)峰,從G4 DNA及其復(fù)合物的混合樣品中被分離出來。固定S1 DNA的濃度不變(5 μmol/L),不斷改變樣品溶液中天然產(chǎn)物分子的總濃度,可以得到不同高度的天然產(chǎn)物分子平臺(tái)峰。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到[L]f,繪制出[L]b/[H]t-[L]f的關(guān)系曲線,如圖6所示。

圖 6 S1 DNA與天然產(chǎn)物結(jié)合的等溫線Fig. 6 Binding isotherms of S1 DNA with natural products

通常,特異性的結(jié)合位點(diǎn)比非特異性的結(jié)合位點(diǎn)更優(yōu)先發(fā)生結(jié)合。當(dāng)結(jié)合分子濃度相對(duì)較低時(shí),往往以特異性結(jié)合為主,當(dāng)結(jié)合分子濃度較高時(shí),特異性結(jié)合位點(diǎn)逐漸飽和。非特異性結(jié)合往往呈線性趨勢(shì),結(jié)合程度隨濃度增大而不斷增加[40,41]。將丁溴東莨菪堿與G4 DNA結(jié)合的[L]b/[H]t與[L]f的關(guān)系作圖發(fā)現(xiàn),當(dāng)[L]f比較低時(shí),I值明顯增大,但隨著丁溴東莨菪堿的濃度增加到5.0×10-5mol/L以上,結(jié)合曲線逐漸趨于平緩,并最終呈現(xiàn)平臺(tái)趨勢(shì),說明丁溴東莨菪堿與靶點(diǎn)G4 DNA為特異性結(jié)合。G4 DNA與丁溴東莨菪堿的結(jié)合常數(shù)進(jìn)一步通過PACE-FA實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性擬合得到。當(dāng)丁溴東莨菪堿濃度遠(yuǎn)大于S1 DNA濃度時(shí),二者結(jié)合趨于飽和,結(jié)合計(jì)量比I值(即[L]b/[H]t)接近于1,說明以1∶1結(jié)合為主,這與ESI-MS譜圖結(jié)果一致。按照1∶1結(jié)合模式進(jìn)行非線性擬合,可得結(jié)合常數(shù)K為1.18×105L/mol。

對(duì)于荷葉堿而言,[L]b/[H]t-[L]f變化始終趨于線性,說明荷葉堿的結(jié)合屬于非特異性。而對(duì)于土荊皮乙酸來說,S1 DNA的加入并未降低土荊皮乙酸的平臺(tái)峰強(qiáng)度,說明二者在溶液相實(shí)際并沒有發(fā)生結(jié)合,這與ESI-MS實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在偏差。在ESI-MS譜圖中,G4 DNA與土荊皮乙酸以1∶1、1∶2比例結(jié)合的復(fù)合物離子峰的存在?？赡苁怯捎贕4 DNA與土荊皮乙酸存在疏水作用,使得復(fù)合物在ESI離子化過程中并未發(fā)生解離,同時(shí)二者帶的負(fù)電荷有利于離子化,導(dǎo)致結(jié)合峰的出現(xiàn)。而在PACE-FA實(shí)驗(yàn)中,由于G4 DNA與土荊皮乙酸都帶負(fù)電荷,靜電排斥導(dǎo)致該復(fù)合物在溶液相中不能穩(wěn)定存在。

綜合ESI-MS和PACE-FA的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見,ESI離子化和MS氣相真空環(huán)境的確會(huì)影響G4 DNA與天然產(chǎn)物分子間的非共價(jià)相互作用,導(dǎo)致不能真實(shí)反映自由溶液中的結(jié)合狀態(tài)。而PACE-FA能夠有效辨別天然產(chǎn)物分子結(jié)合的特異性與非特異性,并進(jìn)一步確定其結(jié)合常數(shù)。

3 結(jié)論

本文選擇將ESI-MS與PACE-FA相結(jié)合,研究人類癌基因啟動(dòng)子區(qū)G4 DNA與天然產(chǎn)物分子間的相互作用。首先,利用ESI-MS快速篩選出存在結(jié)合的3種天然產(chǎn)物分子,親合力順序依次為土荊皮乙酸>丁溴東莨菪堿>荷葉堿。接著,通過PACE-FA進(jìn)一步確定溶液相的結(jié)合狀態(tài)。結(jié)果表明,只有丁溴東莨菪堿對(duì)G4 DNA是特異性結(jié)合,結(jié)合比為1∶1,結(jié)合常數(shù)為1.18×105L/mol。荷葉堿的結(jié)合為非特異性,而土荊皮乙酸在溶液中并未與G4 DNA形成復(fù)合物。該組合方法準(zhǔn)確、快速地獲得了特異性結(jié)合癌基因c-myb G4 DNA的活性天然產(chǎn)物,并明確了溶液狀態(tài)下的分子作用機(jī)制,在天然藥物先導(dǎo)結(jié)構(gòu)的快速篩選,及其靶向特異性和作用機(jī)制的評(píng)價(jià)方面具有一定應(yīng)用前景。