開管毛細管電色譜分析3種解熱鎮(zhèn)痛藥物

劉麗麗, 喬 娟, 張紅醫(yī), 齊 莉*

(1. 中國科學(xué)院化學(xué)研究所活體分析化學(xué)院重點實驗室, 北京 100190; 2. 中國科學(xué)院大學(xué)化學(xué)科學(xué)學(xué)院,北京 100049; 3. 河北大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院, 河北 保定 071002)

解熱鎮(zhèn)痛藥兼有解熱鎮(zhèn)痛作用,是一類作用于中樞系統(tǒng)的非甾體抗炎藥物,其有效成分包括4-氨基安替比林(4-AA)、氨基比林(AP)、非那西汀(PH)等[1,2],但由于其潛在的副作用,已不再單獨一味藥使用,因此準確監(jiān)測并控制體液中的解熱鎮(zhèn)痛藥含量對于疾病的有效治療及藥物的安全使用極其重要。

常用的解熱鎮(zhèn)痛類藥物分離分析方法包括高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法及毛細管電泳法等[1-3]。近年來,基于毛細管電泳法所呈現(xiàn)的分離效率高、樣品用量少等優(yōu)點,人們常用膠束電動毛細管色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法來分離分析具有結(jié)構(gòu)相似且呈現(xiàn)中性的藥物[4]。此分離模式雖然可以彌補毛細管區(qū)帶電泳較難分離中性物質(zhì)的不足,且能顯著改善分離效率,但采用膠束電動毛細管色譜法需要在電泳運行緩沖溶液中添加大量的表面活性劑,這不僅會污染質(zhì)譜離子源,也會降低被分析物的電離效率及抑制檢測信號[5],進而導(dǎo)致毛細管電泳與質(zhì)譜的聯(lián)用嚴重受限。

開管毛細管電色譜(OT-CEC)是以管壁涂覆固定相的毛細管為分離柱,并根據(jù)被分析物與固定相之間的相互作用及其電場中有效電泳淌度的不同而進行分離[6,7]。OT-CEC是一種分離中性化合物的有效方法,通過改變毛細管表面涂覆的固定相就可改善分離效率和調(diào)控電滲流(EOF)方向[8],如殼聚糖基質(zhì)材料的涂層毛細管在pH 1.8～12.0范圍內(nèi)會表現(xiàn)出兩親性質(zhì),通過改變OT-CEC緩沖液的pH值至其低于4.5,使涂層毛細管表面帶正電并基此反轉(zhuǎn)EOF方向[9]; Zhu等[5]合成制備了聚十一烷基硫酸鈉,在毛細管內(nèi)壁構(gòu)建了聚十一烷基硫酸鈉/聚二烯丙基二甲基氯化銨雙涂層,成功實現(xiàn)了5種抗癲癇藥物(氯硝安定、氟硝安定等)的OT-CEC分離;Xu等[10]采用開環(huán)反應(yīng)將聚甲基丙烯酸縮水甘油酯鍵合在毛細管表面并以賴氨酸后修飾該涂層管,發(fā)現(xiàn)所構(gòu)建的OT-CEC體系能極大提高被分析物的分離效率;Tang等[11]在毛細管表面鍵合了超交聯(lián)聚合物,使用含20%乙腈的5.0 mmol/L硼砂-氫氧化鈉(pH 9.5)作為緩沖溶液并采用OT-CEC策略,成功分離了酮洛芬類藥物;Olsson等[12]將親和素共價鍵合于毛細管表面,以含5%(v/v)甲醇的10.0 mmol/L乙酸銨-乙酸(pH 5.8)作為緩沖溶液,開展了治療消化道疾病藥物(如奧美拉唑等)的OT-CEC分離分析研究。綜上可知,在OT-CEC體系中不需添加表面活性劑,通過調(diào)控被分析物與毛細管涂層固定相之間的相互作用就能改善藥物的OT-CEC分離效率[13-17],也能調(diào)控EOF的方向。但這些已報道的工作,在聚合物涂層的合成制備中存在操作復(fù)雜、耗時,及為了獲得藥物的OT-CEC高效分離效率需添加有機溶劑的缺點[5,11,12]。因此,為解決上述難題,不僅需要發(fā)展兩親性嵌段聚合物的簡單制備方法,還需要進一步以其作為毛細管涂層來開展解熱鎮(zhèn)痛藥物的綠色OT-CEC分離分析研究。

在本工作中,采用活性/可控自由基可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移(RAFT)聚合方法,合成制備得到了兩親性嵌段聚合物,聚(苯乙烯-甲基丙烯酸縮水甘油酯)(P(St-GMA)),將其涂覆到毛細管內(nèi)壁,采用乙酸鈉-乙酸作為電泳運行緩沖液(不需添加任何有機溶劑和表面活性劑),構(gòu)建了解熱鎮(zhèn)痛藥物的OT-CEC分離分析新體系,還探討了嵌段聚合物的聚合時間、涂層聚合物濃度及緩沖液pH等因素對P(St-GMA)自組裝行為及對解熱鎮(zhèn)痛藥物OT-CEC分離度(Rs)及遷移時間的影響,成功實現(xiàn)了血樣中3種解熱鎮(zhèn)痛藥物的快速高效分離,為設(shè)計制備更多功能性嵌段聚合物及其在藥物OT-CEC中的綠色分析應(yīng)用研究提供了新思路和新啟示。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

CL1020毛細管電泳分析儀、254 nm紫外檢測器(華陽利民有限公司,中國);石英玻璃毛細管(75 μm (i.d.)×60.0 cm(總長)×50.0 cm(有效長))(河北永年銳灃色譜器件有限公司,中國); HW-2000色譜工作站(南京千譜軟件有限公司,中國); Milli-Q純水儀(Millipore公司,美國)。

4-AA(疏水常數(shù)logP=0.81)、AP(logP=0.99)購自Acros公司(美國); PH(logP=1.58)購自上海梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司;GMA、偶氮二異丁腈(AIBN)、St和二硫代苯甲酸芐酯(BDTB)購自Sigma-Aldrich公司(美國);N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、硫脲、乙酸鈉(NaAc)、乙酸銨(NH4Ac)、乙酸(HAc)、十二烷基苯磺酸鈉(SDBS)、磷酸氫二鉀(K2HPO4)、磷酸二氫鈉(NaH2PO4)、乙腈、甲醇、乙醇、丙酮及其他試劑均為分析純。SD大鼠血清樣品由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供。

1.2 嵌段聚合物涂層管的制備

采用RAFT聚合法,以St及GMA為單體、AIBN為引發(fā)劑、BDTB為鏈轉(zhuǎn)移劑合成了嵌段聚合物P(St-GMA),具體操作步驟如文獻[14,15]所述。通過凝膠滲透色譜(GPC)分析,獲知P(St-GMA)的相對分子質(zhì)量為18.8 kDa。

裸毛細管分別用1.0 mol/L NaOH溶液、純水及甲醇各清洗10 min后,3 h內(nèi)將1.0 mL含50.0 mg/mL P(St-GMA)的DMF溶液慢速流經(jīng)毛細管,聚合物涂層管于25 ℃干燥12 h后,再放入50 ℃烘箱中烘干2 d,備用。

1.3 樣品前處理

用緩沖液配制3種藥物(0.2 mg/L)的儲備液,于4 ℃冰箱保存,備用。取60.0 μL鼠血清樣品與200.0 μL乙腈混合,于25 ℃離心20 min(12 000 r/min)[18];取上清液,用N2吹干,于-18 ℃冰箱中冷藏保存,備用。以2.0 mg/mL硫脲作為考察EOF的標記物。

1.4 分析條件

進樣前,涂層毛細管用純水及緩沖溶液各沖洗10 min,樣品通過高差方式進樣(15.0 cm, 8 s)。OT-CEC分離電壓為+15.0 kV,電泳緩沖液為50.0 mmol/L NaAc-HAc (pH 5.7), 0.45 μm濾膜過濾,備用。Rs1為AP與4-AA之間的分離度;Rs2為4-AA與PH之間的分離度。

圖 1 (a)P(St-GMA)的FT-IR圖譜和(b)裸毛細管及(c、d)涂層毛細管的SEM圖Fig. 1 (a) FT-IR of P(St-GMA) and SEM images of (b) bare capillary and (c, d) coated capillaryP(St-GMA): poly(styrene-co-glycidyl methacrylate); SEM: scanning electronic microscopy.

2 結(jié)果與討論

2.1 嵌段聚合物涂層管的制備及表征

P(St-GMA)的傅里葉變換紅外光譜(見圖1a)展示了苯環(huán)上有-CH2-振動吸收特征峰(2 922 cm-1)、C=O振動吸收特征峰(1 600 cm-1和1 732 cm-1)、C=C雙鍵特征吸收峰(1 450 cm-1和1 492 cm-1)及C-H的面外彎曲振動吸收峰(698 cm-1)[14],表明嵌段聚合物合成成功。從掃描電子顯微鏡(SEM)圖中可觀察到在毛細管內(nèi)壁形成了明顯與裸毛細管(見圖1b)不同的涂層表面(見圖1c和圖1d),表明涂層毛細管已成功制備。

裸毛細管的EOF值為5.6×10-4cm2/(V·s),嵌段聚合物涂層管的EOF值為4.0×10-4cm2/(V·s)。結(jié)果表明:涂層管可有效抑制EOF,并會影響被分析物的OT-CEC分離度及其遷移時間。連續(xù)進樣10次測定EOF值,其相對標準偏差(RSD)<2.0%,表明該涂層管具有良好的穩(wěn)定性。

圖 2 (a)聚合時間、(b)聚合物含量、(c)緩沖溶液種類、(d)有機溶劑添加劑、(e)緩沖液pH值、(f)NaAc濃度對藥物OT-CEC分離度的影響和(g)緩沖液pH和(h)NaAc濃度對涂層管EOF的影響(n=3)Fig. 2 Effect of (a) polymerization time, (b) contents of P(St-GMA), (c) buffer types, (d) organic solvent additives,(e) pH values of buffer, (f) concentrations of NaAc on the resolutions (Rs) and (g) pH values of buffer and (h) concentrations of NaAc on the electroosmotic flow (EOF) of coated capillary (n=3) Rs1: resolution between antipyrine (AP) and 4-aminoantipyrine (4-AA); Rs2: resolution between 4-AA and phenacetin (PH); Buffer 1: K2HPO4-NaH2PO4; Buffer 2: NH4Ac-HAc; Buffer 3: NaAc-HAc; ACN: acetonitrile; MeOH: methanol; DMK: acetone; EtOH: ethanol.

2.2 OT-CEC分離條件優(yōu)化

實驗首先考察了不同聚合時間所制備的P(St-GMA)對3種解熱鎮(zhèn)痛藥物Rs的影響。如圖2a顯示,使用聚合時間為3 h的涂層管時,這3種解熱鎮(zhèn)痛藥物的遷移時間<10 min,但4-AA與AP不能基線分離(Rs1<1.5),而增加聚合時間可顯著提升藥物的OT-CEC分離度(Rs1>1.5、Rs2>1.5),但當聚合時間從3 h增加至24 h時,這3種解熱鎮(zhèn)痛藥物的OT-CEC遷移時間也隨之延長至23 min。隨著P(St-GMA)含量從30.0 mg/mL升高至70.0 mg/mL,被分析物與聚合物涂層之間的相互作用亦隨之增強,并顯著改善了這3種解熱鎮(zhèn)痛藥物的OT-CEC分離度(見圖2b),但被分析物的遷移時間亦從<10 min延長至40 min。綜合考慮,能在最短的遷移時間內(nèi)達到最佳分離的目的,最終選擇12 h為最佳聚合時間,并以50.0 mg/mL聚合物涂覆的毛細管來開展后續(xù)的OT-CEC分離分析研究。

其次,實驗考察了3種不同的緩沖液對解熱鎮(zhèn)痛藥物分離度的影響(見圖2c)。結(jié)果發(fā)現(xiàn):以K2HPO4-NaH2PO4作為OT-CEC的緩沖溶液時,4-AA與PH不能基線分離(Rs2<1.5);采用NH4Ac-HAc和NaAc-HAc作為緩沖溶液時,雖然可實現(xiàn)被測藥物的基線分離(Rs1>1.5、Rs2>1.5),但以NH4Ac-HAc為緩沖溶液時,這3種藥物的遷移時間(20 min)要長于以NaAc-HAc為緩沖溶液的分析體系(12 min)。依據(jù)有機溶劑極性的不同,進一步考察了4種常用有機溶劑[17]對被測藥物OT-CEC分離度及遷移時間的影響。如圖2d所示,當在NaAc-HAc緩沖液中添加15.0%(v/v)丙酮時,4-AA與PH完全不能分離;而以添加了15.0%(v/v)乙腈、15.0%(v/v)甲醇及15.0%(v/v)乙醇的NaAc-HAc作為緩沖溶液,均能實現(xiàn)這3種藥物的基線分離(Rs1>1.5、Rs2>1.5),但它們的遷移時間卻從不含有機溶劑體系的12 min大幅延長至25 min。結(jié)果表明:乙腈、甲醇及乙醇這3種有機溶劑添加劑有利于嵌段聚合物在溶液中形成膠束結(jié)構(gòu)[17],并能顯著增加被分析物的分離度,但會導(dǎo)致其遷移時間大幅延長。為實現(xiàn)高效、快速及綠色分離,最終以不添加任何有機溶劑的NaAc-HAc為緩沖溶液來開展解熱鎮(zhèn)痛藥物的OT-CEC分離分析研究。

據(jù)文獻報道[10,12],緩沖液pH對毛細管內(nèi)壁的電荷分布及被分析物的分離效率有顯著影響。由于解熱鎮(zhèn)痛藥物的pKa值接近5.0[19],因此實驗考察了不同緩沖液pH值(5.5～6.8)對解熱鎮(zhèn)痛藥物分離度及遷移時間的影響[12,19]。如圖2e顯示,在緩沖液pH為5.5～6.0時,3種被分析物均可實現(xiàn)OT-CEC基線分離(Rs1>1.5、Rs2>1.5),而pH為5.7時,藥物的遷移時間最短,這要歸功于藥物在低pH緩沖液中的部分解離及其與聚合物膠束的相互作用;而當緩沖液pH值增加至6.8時,被分析物的遷移時間略微減小(<10 min),但只能部分分離AP與4-AA(Rs1<1.5),且完全不能分離4-AA與PH(Rs2=0)。實驗進一步考察了緩沖液中NaAc的濃度(10.0～70.0 mmol/L)對藥物分離度的影響(見圖2f)。結(jié)果發(fā)現(xiàn):當NaAc濃度從10.0 mmol/L增至30.0 mmol/L時,被分析物的Rs明顯增加;當其濃度從30.0 mmol/L繼續(xù)增至70.0 mmol/L時,藥物的遷移時間從14 min大幅縮短至<10 min,而4-AA與PH的分離度在50.0 mmol/L NaAc緩沖液中達到最大值(Rs2=2.3)?；?為在最短的遷移時間內(nèi)獲得最佳Rs值,最終選擇了50.0 mmol/L NaAc-HAc(pH 5.7)進行后續(xù)OT-CEC研究。

圖 3 3種藥物的(a)裸管毛細管區(qū)帶電泳圖、(b)裸管膠束電動毛細管色譜圖和(c)OT-CEC譜圖Fig. 3 (a) Bare tube capillary zone electrophoresis, (b) bare tube micelle electrokinetic capillary chromatogram and (c) OT-CEC electropherogram of the three drugs1. AP (100.0 μmol/L); 2. 4-AA (100.0 μmol/L); 3. PH (80.0 μmol/L).

如圖2g及圖2h顯示,緩沖液pH(5.5～6.8)及NaAc濃度(10.0～70.0 mmol/L)的改變僅對涂層管的EOF值產(chǎn)生微小的影響,表明該涂層管具有良好的EOF抑制效果,因此,被分析物的OT-CEC分離度及其遷移時間主要取決于其與涂層管表面的嵌段聚合物的相互作用力(包括親疏水作用及氫鍵作用)。

2.3 OT-CEC分離機理

如圖3a顯示,使用裸毛細管以毛細管區(qū)帶電泳分離模式不能實現(xiàn)這3種藥物的良好分離;在緩沖液中添加了50.0 mmol/L表面活性劑SDBS,以裸管膠束電動毛細管色譜分離模式可實現(xiàn)被分析物的基線分離(見圖3b);而在緩沖液中不添加SDBS及有機溶劑添加劑,采用OT-CEC分離模式,可基線分離這3種被分析物(Rs1=3.8、Rs2=2.3)(見圖3c)。值得一提的是,這3種解熱鎮(zhèn)痛藥物的OT-CEC遷移順序與膠束電動毛細管色譜的遷移順序相反。與毛細管區(qū)帶電泳分離模式(見圖3a)及膠束電動毛細管色譜分離模式相比(見圖3b),雖然被分析物PH出現(xiàn)了峰拖尾現(xiàn)象(見圖3c),但其OT-CEC遷移順序卻與藥物的疏水特性(logPAP=0.99、logP4-AA=0.81、logPPH=1.58)基本吻合,基此推測:PH同嵌段聚合物涂層之間的較強疏水相互作用[20]是導(dǎo)致此峰展寬的主因。

基于上述實驗結(jié)果及藥物的遷移順序推測,涂層管中的嵌段聚合物可以起到“類表面活性劑”的作用[17],其OT-CEC的分離機理見圖4。P(St-GMA)具有兩親性,其中的聚甲基丙烯酸縮水甘油酯(PGMA)嵌段部分具有親水性,而聚苯乙烯(PSt)嵌段部分具有強烈的疏水性。在水溶液中,P(St-GMA)易于發(fā)生自組裝并形成類表面活性劑膠團結(jié)構(gòu)。在電場力作用下,由于被分析物的有效電泳淌度不同,其與聚合物類表面活性劑膠團的相互作用(包括親疏水作用及氫鍵作用)強弱不同,使得各自的遷移時間不同,最終實現(xiàn)這3種解熱鎮(zhèn)痛藥物的高效分離。

2.4 方法學(xué)驗證

以解熱鎮(zhèn)痛藥物的峰面積為縱軸(y, μV·s),以其濃度為橫軸(x, μmol/L)繪制標準曲線,其線性相關(guān)系數(shù)(R2)≥0.995(見表1)。方法的檢出限(LOD)通過3倍信噪比(S/N=3)來確定。被分析物在涂層管的日內(nèi)、日間和柱間的遷移時間及峰面積的相對標準偏差(RSD)為0.27%～3.46%(n=3)。結(jié)果表明:該聚合物涂層管具有良好的穩(wěn)定性與重復(fù)性,所發(fā)展的OT-CEC分析方法可用于解熱鎮(zhèn)痛藥物的定量分析。

圖 4 基于P(St-GMA)涂層與藥物相互作用的OT-CEC分離機理示意圖Fig. 4 Mechanism illustration for OT-CEC analysis based on the interaction between P(St-GMA) coating and the drugs

表 1 3種藥物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍和檢出限

進一步將所構(gòu)建的OT-CEC方法用于鼠血清空白樣品(見圖5a)及添加了藥物的血清樣品的分離分析(見圖5b)。血清樣品在添加解熱鎮(zhèn)痛藥物后回收率為97.0%～104.1%(見表2)。結(jié)果表明:所建OT-CEC分析方法可用于實際血清樣品中解熱鎮(zhèn)痛藥物的定量分析。

圖 5 (a)血清空白樣品和(b)加標血清樣品的OT-CEC譜圖Fig. 5 OT-CEC electropherograms of (a) the blank serum and spiked serum sample 1. AP (100.0 μmol/L); 2. 4-AA (100.0 μmol/L); 3. PH (80.0 μmol/L).

表 2 血清樣品中3種藥物的回收率(n=3)

3 結(jié)論

以所設(shè)計及合成制備的兩親性嵌段聚合物P(St-GMA)為毛細管涂層,以NaAc-HAc為緩沖液,構(gòu)建了新型OT-CEC分析體系,實現(xiàn)了3種解熱鎮(zhèn)痛藥物的基線分離。嵌段聚合物P(St-GMA)在溶液中發(fā)生自組裝形成類表面活性劑膠團結(jié)構(gòu),顯著提高了解熱鎮(zhèn)痛藥物的分離度,還避免了使用有機溶劑所造成的環(huán)境污染。所建立的OT-CEC方法展現(xiàn)了其可通過調(diào)控被分析物與嵌段聚合物涂層之間的相互作用來實現(xiàn)高效分離的特點,這將有助于OT-CEC在實際血樣中藥物的分析應(yīng)用。