毛細管電泳分析中手性化合物的定性檢測

陳麗霞, 趙志毅, 劉明霞, 李向軍*

(1. 中國科學院大學化學科學學院, 北京 100049;2. 北京分子科學國家實驗室, 北京大學化學與分子工程學院, 北京 100871)

毛細管電泳(CE)是20世紀80年代初發(fā)展起來的一類以高壓電場為驅(qū)動力,毛細管為分離通道的新型分離分析技術,主要依靠各樣品組分淌度和分配行為上的差異實現(xiàn)分離,是現(xiàn)代微柱分離和經(jīng)典電泳技術相結(jié)合的產(chǎn)物。與傳統(tǒng)色譜分離技術相比,CE具有分離效率高、分析速度快、樣品用量少、分離模式靈活多樣等特點,尤其在進樣量上,CE可達nL乃至fL級,比高相液相色譜(HPLC)等至少降低了3個數(shù)量級?；谶@些優(yōu)勢,CE被廣泛應用到環(huán)境、生物、食品、醫(yī)藥等多個研究領域[1-4]。

一個物體不能與其鏡像相重合的特性被稱為手性,具有這種特征的分子則為手性分子,手性現(xiàn)象廣泛存在于自然界與生命體中。手性分子在非手性環(huán)境中理化性質(zhì)基本一致,在手性環(huán)境中其生理活性卻往往存在重大差異。基于此特性,將手性對映體分離并進行鑒定已成為分析領域一大研究熱點,而CE憑借眾多優(yōu)勢在分離過程中被廣泛使用[5-8]。劉明霞等[9]已從手性拆分劑的選擇和提高CE分離度的角度,對手性化合物的CE分離進行了綜述。本文則從CE中手性化合物的定性檢測方式角度,總結(jié)近年來CE手性化合物的分析進展。

1 依賴標準品的毛細管電泳分析

在CE分析,包括色譜分析中,未知樣品中待測物的定性通常采用比較標準品遷移時間或標準加入法完成。檢測可利用常見的紫外-可見(UV-vis)檢測器通過毛細管窗口直接檢測,也可通過熒光、電化學、質(zhì)譜、核磁等其他檢測器進行檢測。不同檢測模式對樣品性質(zhì)、前處理手段的要求不一,隨之形成的圖譜、適用范圍及定性檢測方式也各有不同。

1.1 光學檢測

光學檢測包括UV、激光誘導熒光(LIF)、化學發(fā)光(CL)等多種檢測方式,其中UV檢測器以性能穩(wěn)定、結(jié)構簡單、性價比高等優(yōu)勢在CE中應用最為廣泛,是商品化CE固定的檢測器之一。馮濤等[10]在220 nm波長下利用CE-UV成功分離并檢測手性藥物美托洛爾的對映體峰,通過與光學純單一對映體標準品的遷移時間對照,確認了對映體峰的出峰順序及位置。Pasquini課題組[11,12]先后以2-羥丙基-丙基環(huán)糊精和2,6-二-氧-甲基-β-環(huán)糊精為手性拆分劑,利用CE-UV在92份茶葉中完成了對兒茶素、甲基黃嘌呤和茶氨酸等成分的手性分離,并根據(jù)遷移時間完成了定性分析。Yao等[13]在210 nm的目標波長下,利用環(huán)糊精改性電動色譜快速分離測定大鼠眼眶靜脈血漿中苯那敏對映體,同時結(jié)合大體積樣品進樣極性反轉(zhuǎn)掃集(LVSS-PS)和陽離子選擇性耗盡進樣掃集(CSEI-PS)兩種樣品在線預富集方法,大大提高了實驗靈敏度,而對映體出峰順序和遷移時間不發(fā)生改變。不足之處是該檢測器只適用于有紫外吸收信號的樣品,無紫外吸收的情況下需對樣品進行衍生化前處理,且毛細管內(nèi)徑窄、檢測光程短,導致CE-UV檢出限高,無法滿足樣品痕量檢測需求。針對該問題,有研究者開發(fā)了多種特殊形狀的檢測池以增大毛細管的光程。Moring等[14]利用一種由石英球透鏡改造的新型Z形池,將毛細管的光通量增強了3 mm,使儀器的信噪比和分辨率等都提高了至少一個數(shù)量級,更好地實現(xiàn)了物質(zhì)的定性分析。

LIF檢測器屬于熒光檢測器的一種,該類檢測器檢測通常采用輻射強度大、帶寬窄、空間相干性強的激光作為激發(fā)源,光源與信號強度之間良好的線性關系及低背景、高信噪比等優(yōu)勢也使其成為眾多CE檢測器中靈敏度最高的一種檢測方式。LIF檢測有單維熒光和多維熒光兩種檢測方式,后者又由波長分辨、時間分辨和偏振熒光檢測等模式構成,可大大提高信噪比與靈敏度,為物質(zhì)的定性定量分析提供了全面的信息。李風雷[15]將5種手性氨基酸試劑分為兩組,利用常規(guī)柱前衍生紫外檢測和CE-LIF分別進行了分離檢測,根據(jù)遷移時間定性的同時也驗證了CE-LIF檢測方法的優(yōu)越性;Kirschner等[16]以磺化-β-環(huán)糊精為手性分離劑,建立并優(yōu)化了CE-LIF手性拆分氰基[f]異吲哚(CBI)衍生物的方法,分離成功后對照標準品的遷移時間實現(xiàn)定性;Creamer等[17-19]以?；悄懰猁}鈉(STC)和γ-環(huán)糊精為雙手性選擇劑,5-羧基熒光素琥珀酰亞胺酯(CFSE)為衍生劑,利用膠束電動毛細管色譜-激光誘導熒光檢測器(MEKC-LIF)分離鑒定了數(shù)十種天然手性氨基酸,并進一步將該方法應用于航空研究。目前,LIF檢測器的檢出限可低至10-9～10-13mol/L,靈敏度也已達到單細胞水平,充分滿足了生物、環(huán)境等領域痕量檢測的需求。不足之處是該檢測器價格比較昂貴且樣品需要有熒光信號,否則需要用異硫氰酸熒光素(FITC)[20]、4-氟-7-硝基-2, 1,3-苯并氧雜惡二唑(NBD-F)[21]和3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTS)[22]等試劑進行衍生化,過程比較煩瑣。

除了這兩種檢測器,光學類檢測器還包括CL檢測器[23]、拉曼光譜檢測器[24]、傅立葉轉(zhuǎn)換紅外光譜檢測器[25]等,該類檢測器大多采用比較標準品遷移時間的方法實現(xiàn)未知樣品定性。針對手性樣品不同的性質(zhì)和發(fā)光信號,利用CE進行分離分析時,可選擇合適的檢測器。由于適用范圍廣、檢測類型多樣且操作簡單,光學檢測器在CE檢測中應用最為廣泛。

1.2 質(zhì)譜、核磁檢測

CE-MS結(jié)合了CE分離速度快、樣品用量少與MS高特異性、高靈敏度的優(yōu)勢,在一次分析中能同時得到樣品的遷移時間、相對分子質(zhì)量和離子碎片等定性信息,大大拓寬了二者本身的適用范圍。在沒有標準品的情況下,非手性物質(zhì)可以通過CE-MS測定未知物相對分子質(zhì)量等信息來完成定性檢測,但由于手性分子相對分子質(zhì)量完全相同,故質(zhì)譜法在手性領域的應用通常也需依賴標準品,同時需要結(jié)合相對分子質(zhì)量之外的其他信息。具體方法包括將其中一個對映異構體選擇性地標記上同位素原子,通過質(zhì)譜檢測提供質(zhì)量差異實現(xiàn)準確定性的主客體關聯(lián)法[26,27];或是基于不同分子碰撞截面,根據(jù)離子大小、形狀差異實現(xiàn)手性小分子分離鑒定的離子遷移質(zhì)譜法[28,29]。其中,碰撞誘導非對映體解離法是近些年發(fā)展起來的一種快速高效的手性質(zhì)譜分析方法,添加手性配體形成非對映異構體復合物是該分析方法的關鍵[30],根據(jù)數(shù)據(jù)分析方法的不同,該法又可分為動力學方法(KM)、固定配體動力學法和手性識別比法(CR)。Yu課題組[31]將具有手性選擇性的色氨酸、脯氨酸等對映體小分子,與雙核銅配體結(jié)合形成四聚體離子,建立了用于手性氨基酸分離鑒定的行波離子遷移質(zhì)譜法。研究發(fā)現(xiàn),色氨酸和組氨酸具有更好的對映選擇性。Nagy等[32]通過合成NiⅡ/L-Asp/5’GMP和CuⅡ/L-Ser/5’GMP兩種固定配體組合,結(jié)合碰撞誘導離解串聯(lián)質(zhì)譜法完成了12個戊糖異構體的完全鑒定和絕對構型測定。Karthikraj等[33]在ESI+條件下成功合成銅離子絡合物的三聚體,與碘代氨基酸結(jié)合分離鑒定10種對映體藥物的同時,采用反應動力學法和CR法還分別得到了10種藥物的手性分化參考值。此外,CE-MS還有多種儀器聯(lián)用方式。Schultz等[34]利用分流技術將CE與MS連接后,在全掃描條件下成功分離并檢測到fmol級的20種手性氨基酸,利用得到的樣品信息對其分別定性,并將該方法用于血液分析,準確鑒定了苯丙酮尿癥和酪氨酸血癥類的代謝類疾病。Svidrnoch等[35]以萬古霉素作為手性拆分劑,應用毛細管電泳-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術實現(xiàn)了藥物中D,L-2-羥基戊二酸對映體的直接手性拆分,得到的電泳遷移時間及碎片離子質(zhì)荷比等信息為分離后對映體定性提供了保證。而Sanchez-Hernandez等[36]以環(huán)糊精為手性選擇物,通過優(yōu)化兩種毛細管電泳-串聯(lián)質(zhì)譜方法,測定了不同水解蛋白肥料中所含游離氨基酸的外消旋度,并由此識別了除半胱氨酸外所有蛋白質(zhì)氨基酸。He課題組[37]首次將手性膠束電動色譜(CMEKC)與大氣壓光電離質(zhì)譜(APPI-MS)實行在線耦合,并以此完成了4種光引發(fā)劑的對映體分離和在線定性檢測。CE-MS在環(huán)境、醫(yī)藥、生物等領域應用較為廣泛,但由于MS的定性檢測同樣需要標準品進行比較對照[38,39],且MS價格昂貴、操作復雜,一定程度上限制了該類檢測器的使用與發(fā)展。

與CE-MS類似,CE與核磁共振波譜(NMR)結(jié)合,在保證高效分離效果的同時,也提供了手性樣品的對映體結(jié)構等準確信息。Béni等[40]以環(huán)糊精為手性拆分劑、甲苯磺?；偷せ酋Ｂ葹樽贤庋苌噭?在4種pH條件下成功分離得到神經(jīng)藥物普瑞巴林的R-異構體,并利用二維旋轉(zhuǎn)坐標系NOE核磁(2D ROESY NMR)技術得到異構體衍生物的核磁氫譜,結(jié)合電泳圖的遷移時間完成了手性樣品的定性分析。Kwon等[41]將琥珀酰聚糖單體(M1、M2、M3)作為手性添加劑,通過CE和13C NMR譜實現(xiàn)了對兒茶素的手性分離鑒定,結(jié)果表明,CE和NMR譜圖中琥珀酰聚糖的琥珀酸取代基是分離鑒定手性兒茶素的決定性因素。該類方法高效準確,但用到的核磁共振儀器體積龐大、價格昂貴、維護成本高,應用范圍較局限[42]。

1.3 電化學檢測

根據(jù)分離模式不同,CE可歸結(jié)為多種類型,如毛細管區(qū)帶電泳(CZE)、毛細管等速電泳(CITP)、MEKC等,電化學檢測(ED)多與CZE模式聯(lián)用。ED主要包括安培檢測、電容檢測和電位檢測3種,其中電位檢測由于靈敏度低，應用較少。安培檢測由于靈敏度與選擇性較好,在CE手性檢測中應用較多。Wallingford和Ewing[43]最開始用碳纖維電極作為工作電極,Fang課題組[44,45]在此基礎上嘗試用銅電極、鎳電極等成功測定了多羥基抗生素、單糖等手性分子的電離常數(shù),并利用遷移時間實現(xiàn)了樣品的定性分析。電導檢測中的電容耦合非接觸電導檢測器(C4D)具有結(jié)構簡單、成本低廉、電極不易污染等優(yōu)點,廣泛應用于手性分析,近些年發(fā)展較為迅速。Tuma等[46]應用CE-C4D快速檢測了飲料、食品和食品添加劑中的葡萄糖和果糖等手性糖類化合物,通過逐步添加標準溶液,觀察峰面積變化實現(xiàn)了多種樣品的定性。Pormsila等[47]以萬古霉素作手性拆分劑,利用CE-C4D分離鑒定了5種α-羥基酸陰離子和兩種α氨基酸對映體,并進一步在牛奶和酸奶中檢測出乳酸對映體。陳麗等[48]同樣應用CE-C4D分離檢測技術,在檸檬酸-Zn2+體系的電泳運行液中實現(xiàn)了異亮氨酸對映體的手性分離,通過對照標準品確認對映體出峰順序的同時,對其手性識別機理也作了初步探討。Costa等[49]將CE-C4D與CE-UV結(jié)合,在樣品無需衍生化的前提下通過對照標準品的遷移時間,實現(xiàn)了藥物中手性精氨酸、抗壞血酸和天冬氨酸的同時定性。CE-ED克服了毛細管檢測光程短、靈敏度低等缺陷,在電活性物質(zhì)檢測、微流控芯片分析等領域應用廣泛,不足之處是重現(xiàn)性較差,電信號不夠穩(wěn)定。

2 不依賴標準品的毛細管電泳分析

對于色譜分析來講,缺乏標準品時,可通過制備色譜獲得單一純品后進行進一步分析或采用液相色譜-圓二色光譜(LC-CD)聯(lián)用實現(xiàn)手性化合物對映體的定性分析[50,51],但由于毛細管進樣量極少,單一對映體的標準品很難用CE制備得到。在對映體標準品缺乏的前提下,利用CE實現(xiàn)手性物質(zhì)分離定性的方法主要有酶消解和抗體添加法、計算法等。

2.1 酶消解和抗體添加法

酶消解法是指在被測樣品中加入相應的降解酶或氧化酶,通過觀察峰面積的變化實現(xiàn)物質(zhì)定性,該方法對手性和非手性物質(zhì)均適用。Grimshaw等[52]利用睪丸透明質(zhì)酸酶將人膝關節(jié)滑膜液中的聚合透明質(zhì)酸水解成四糖,以歐乃派克造影劑為內(nèi)標,通過CE測得的色譜峰實現(xiàn)了透明質(zhì)酸的定性和基礎定量分析。同樣針對透明質(zhì)酸,Hayase課題組[53]發(fā)現(xiàn)，將不同相對分子質(zhì)量的支鏈淀粉作為緩沖液中的添加劑后,支鏈淀粉的濃度和相對分子質(zhì)量均影響透明質(zhì)酸樣品的遷移時間,并根據(jù)樣品相對分子質(zhì)量的范圍會造成色譜峰不同程度的展寬,對不同相對分子質(zhì)量的透明質(zhì)酸進行確認。人體中所含氨基酸大多為手性氨基酸,Patel等[54]在單個神經(jīng)細胞提取液中添加了D-天冬氨酸的氧化酶,通過觀察目標峰面積的變化,實現(xiàn)了物質(zhì)的定性和構型的確認。此類方法主要根據(jù)目標物的對應酶進行判斷,準確性很高,但由于大多物質(zhì)不易獲得專一消解酶,其應用范圍較局限。

除酶外,抗體或其他蛋白質(zhì)的結(jié)合作用同樣適用于部分物質(zhì)的定性分析。Sun課題組[55]以右旋糖酐作為牛血清蛋白(BSA)的緩沖液添加劑,通過調(diào)節(jié)右旋糖酐濃度控制BSA對樣品結(jié)合力的強弱,用毛細管親和電泳(ACE)分離了布洛芬、亞葉酸、亮氨酸和戊氨酸等手性物質(zhì),并指認了其對映體峰。Marie等[56]利用糖基化終產(chǎn)物(AGEs)特定的抗體,通過CZE與MS聯(lián)用分離鑒定了天然、氧化類和糖化類人血清白蛋白(HSA)。此外,Lurie等[57]以2,6-吡啶二甲酸為顯色試劑,建立了海洛因中葡萄糖、乳糖、蔗糖、肌醇和甘露醇的CE定性分析方法。這類方法的弊端是適用范圍都較局限,所以在不依賴標準物的前提下,尋找新的CE中手性物質(zhì)定性方法十分必要。

2.2 計算法

CD是手性光學技術中具有代表性的一種方法,其原理是利用手性化合物對左旋和右旋圓偏振光的吸收系數(shù)差異,測定二者吸收系數(shù)之差隨波長變化所形成的光譜圖,是手性化合物分析的重要方法[58]。在色譜分析中,通過色譜分離后再進行CD測定,或直接采用色譜-CD聯(lián)用技術,可對手性物質(zhì)對映體進行分析,但由于CE分析所需樣品量極小,通過CE方法無法制備得到足夠量的樣品用于CD分析,同時CE中管徑小,光程短,目前尚未見到商品化的CE-CD聯(lián)用儀器。這使得在CE分析中,尤其對缺乏標準品且來源珍稀的手性對映體來說,CE樣品用量少的特點并沒有得到充分利用。

圖 1 CE結(jié)合CD對三羥基天冬氨酸4種對映異構體實現(xiàn)峰確認[61]Fig. 1 Identification of four enantiomers of trihydroxy aspartic acid identified by CE binding circular dichroism (CD)[61]EHA: erythro-3-hydroxyaspartate; THA: threo-3-hydroxyaspartate; FMOC-Cl: 9-fluorenylmethyl chloroformate.

圖 2 CE結(jié)合CD分離分析非消旋對映體混合物方法的流程圖Fig. 2 Flow chart of method for separation and analysis of non-racemic enantiomer mixtures by CE and CDDFT: density functional theory; TDDFT: time-dependent density functional theory; ECD: electronic circular dichroism.

近年來,量子化學(QM)計算法發(fā)展迅猛,特別是含時密度泛函理論(TDDFT)這種契合了計算時間與精度的計算方法的出現(xiàn),使得CD結(jié)合理論計算成為確定手性物質(zhì)絕對構型的一種常用方法[59,60]。該方法通過對手性化合物的兩種對映異構體進行CD計算,對比實驗值與兩種可能的對映異構體CD圖譜的相似性,確定手性化合物的絕對構型。Liu等[61]以β-環(huán)糊精為手性拆分劑,9-芴甲基氯甲酸酯(FMOC-Cl)為衍生劑,通過CE-MS建立了雙手性神經(jīng)遞質(zhì)分子3-羥基天冬氨酸4種立體異構體的分離方法,并利用理論計算結(jié)合實驗圓二色譜的方法對4種異構體的色譜峰實現(xiàn)了峰確認(見圖1)。同年該課題組[62]在此基礎上明確了CE-CD分離分析流程(見圖2),建立了不依賴光學純標準品,CE結(jié)合CD分離鑒別對映體的方法,并以色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、丙氨酸、布洛芬、萘普生等7種手性化合物為例,驗證了該方法的可靠性。

3 結(jié)論

目前,利用CE技術進行手性分離已成為一種常用手段,除新的手性拆分劑和分離模式層出不窮外,手性對映體出峰順序的確認及物質(zhì)定性等方面的研究也日益受到關注。以往發(fā)表的工作通常均需借助光學純的單一對映體標準品實現(xiàn)定性;缺少標準品時,受體-配體等分子間作用力可為對映體提供選擇性,但此類方法適用范圍較局限。針對該問題,借助量子化學譜圖模擬,將CE與CD結(jié)合,既可彌補單一實驗分析的不足,更能深入探究手性分離機理、實現(xiàn)手性物質(zhì)的準確快速定性。在以后的工作中,這種研究思路也將受到更多分析化學工作者的青睞。