越鞠甘麥大棗湯對產(chǎn)后抑郁小鼠海馬SIRT1-ERK1/2信號通路的影響

肖曉霞 陳暢 夏寶妹 陶偉偉

南京中醫(yī)藥大學1第一臨床醫(yī)學院，4基礎醫(yī)學院（南京210023）；2南京中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院（南京210001）；3南京特殊教育師范學院康復科學學院（南京210023）

產(chǎn)后抑郁癥（postpartum depression，PPD）是分娩最常見和致殘的并發(fā)癥之一，其發(fā)病率在高收入國家為6.9%～12.9%，低中等收入國家達到20%以上［1］。約20%的患者出現(xiàn)自殺念頭，其引起的產(chǎn)婦自殺是導致孕產(chǎn)婦死亡的主要原因［1-2］，給產(chǎn)婦、家庭及社會帶來嚴重危害。因此，研究PPD 的發(fā)病機制以及藥物防治具有重要的臨床意義。

哺乳動物sirtuins（SIRT1-7）是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）依賴性脫酰酶，參與衰老、炎癥、能量代謝、細胞分化、應激反應等多種細胞過程的調節(jié)［3-4］。sirtuins具有不同的亞細胞定位和酶活性。其中，沉默信息調節(jié)因子1（silent information regulator 1，SIRT1）表現(xiàn)出NAD 依賴性脫乙酰酶活性，可使多種底物去乙?；?。研究［5-7］表明SIRT1 在抑郁癥的發(fā)病中發(fā)揮重要作用，但其在PPD 的發(fā)病機制中鮮有研究。細胞外信號調節(jié)激酶（extracellular signalregulated kinase，ERK）—核糖體S6 蛋白激酶（ribosomal S6 kinase，RSK）—轉錄因子環(huán)磷酸腺苷反應元件結合蛋白（cyclic adenosine monophosphate response element binding protein，CREB）信號通路是將細胞外刺激信號從細胞表面受體傳導至細胞核的重要信號轉導途徑之一，其在神經(jīng)系統(tǒng)相關性疾病中被廣泛研究。研究［8］發(fā)現(xiàn)ERK信號參與了SIRT1 介導的神經(jīng)保護作用，兩者協(xié)同發(fā)揮神經(jīng)保護作用。但在PPD 中ERK 信號是否參與了SIRT1 介導的抗抑郁作用，尚未見到相關報道。

氟西汀、丙咪嗪等傳統(tǒng)抗抑郁藥會導致患者出現(xiàn)頭痛、惡心、口干等不良反應［9］，且治療周期長、費用高，臨床上患者治愈率往往不高。與西藥治療相比，中藥具有整體調節(jié)、副作用小、價格低廉等優(yōu)勢，近年來已成為PPD 新藥研發(fā)的熱點。其中，越鞠甘麥大棗湯由“統(tǒng)治六郁”的越鞠丸合甘麥大棗湯劃裁而來，在實踐中療效確鑿［10］，但其相關基礎研究較少。本實驗在構建PPD 動物模型的基礎上，以SIRT1-ERK1/2 信號通路為切入點，探討在PPD 模型中是否存在該信號通路的異常，以及越鞠甘麥大棗湯能否通過該通路發(fā)揮抗抑郁作用，以期為PPD 的臨床治療提供新思路和研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物Balb/c 雌性小鼠40 只，6～8 周齡，體質量20～22 g，購買于青龍山動物中心，動物合格證：SCXK（蘇）2016-0010。

1.2 藥物及試劑實驗藥材購自南京中醫(yī)藥大學國醫(yī)堂門診。越鞠甘麥大棗湯組方：神曲100 g、香附100 g、梔子100 g、淮小麥250 g、蒼術100 g、川芎100 g、大棗375 g、炙甘草125 g。上述藥物加8 倍量水浸泡30 min，煎煮1 h，收集藥液，加6 倍量水2 次煎煮，合并兩次藥液，65 ℃旋蒸濃縮至藥物終濃度為8.3 g/kg；艾司西酞普蘭（美侖，批號：MB1290）；抗體：SIRT1（Affinity，貨號：DF6033）、ERK（CST，貨號：9102）、P-ERK（CST，貨號：4376）、P90RSK（Affnity，貨號：AF4777）、CREB（proteintech，貨號：12208-1-AP）、GAPDH（proteintech，貨號：60004-1-Ig）；蛋白Marker（良緯科技，貨號：Y007）；ECL 發(fā)光液（Affinity，貨號：KF001）。

1.3 主要儀器動物行為分析系統(tǒng)（Any-maze，USA）；蛋白電泳及轉膜儀（Bio-Rad，USA）；凝膠成像及分析系統(tǒng)（Tannon-5200，上海天能）。

1.4 模型制備及越鞠甘麥大棗湯給藥40 只雌性Balb/c 小鼠隨機分為對照組、模型組、艾司西酞普蘭組和越鞠甘麥大棗湯組，每組10 只。除對照組，應激母鼠每天給予束縛刺激6 h（11：00～17：00）聯(lián)合每周2 次24 h 光照刺激。應激6 周后，對照組和應激小鼠均與正常雄性Balb/c 小鼠合籠交配。小鼠分娩3 周后，對照組和模型組按10 mL/（kg·d）劑量生理鹽水灌胃，艾司西酞普蘭組按20 mg/（kg·d）劑量腹腔注射，越鞠甘麥大棗湯組按8.3 g/（kg·d）劑量灌胃，給藥2 周，進行糖水偏好和強迫游泳測試，以小鼠糖水偏好降低和強迫游泳不動時間增加為判斷造模成功的主要依據(jù)。

1.5 指標檢測

1.5.1 糖水偏好測試造模前，每只小鼠給予兩瓶2% 蔗糖溶液適應3 d。測試前24 h，小鼠單籠飼養(yǎng)，禁食禁水，每只小鼠給予2%蔗糖溶液和純水各1 瓶，1 h 后交換蔗糖溶液和純水瓶的位置，記錄小鼠2 h 內蔗糖溶液和純水的消耗量。蔗糖消耗百分比計算公式為：蔗糖消耗%=［（蔗糖消耗量）/（蔗糖消耗量+純水消耗量）］×100%。

1.5.2 強迫游泳測試將小鼠置于水深約為15 cm的圓柱體玻璃容器（直徑18 cm，高25 cm）中，調整水溫為24～26 ℃，每只小鼠共游泳6 min。Anymaze 軟件記錄小鼠活動，并分析最后4 min 的不動時間。

1.5.3 蛋白免疫印跡法檢測蛋白表達水平小鼠處死后在冰上取出海馬組織，提取蛋白并測定濃度。10% SDS-PAGE 膠上樣，電泳分離，濕轉將蛋白轉移至聚偏二氟乙烯膜上，5%牛奶室溫封閉1 h。分別用SIRT1、ERK1/2、P-ERK1/2、P90RSK、CREB 一抗孵育，4 ℃過夜。TBST 漂洗3 × 10 min。二抗室溫孵育1 h，TBST 漂洗3 × 10 min。暗室中ECL 發(fā)光液顯影，采集各條帶及其內參的灰度值，得到各樣本蛋白的灰度比值。

1.6 統(tǒng)計學方法符合正態(tài)分布數(shù)據(jù)均用（）表示，應用GraphPad Prism 7 統(tǒng)計分析軟件對多組間數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，Post Hoc Test 選用LSD 方法，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 越鞠甘麥大棗湯對PPD 小鼠抑郁樣行為的影響

2.1.1 越鞠甘麥大棗湯增加PPD 小鼠糖水偏好

與對照組（Con）相比，模型組（Mod）小鼠的糖水偏好下降（P＜0.05）；與模型組相比，越鞠甘麥大棗湯（YG）和艾司西酞普蘭（Es）給藥均能明顯增加小鼠的糖水偏好（P＜0.05）。見圖1。

圖1 各組小鼠的糖水偏好Fig.1 The sucrose preference of mice in each group

2.1.2 越鞠甘麥大棗湯減少PPD 小鼠強迫游泳不動時間與對照組相比，模型組小鼠強迫游泳測試的不動時間增加（P＜0.01）；與模型組相比，越鞠甘麥大棗湯和艾司西酞普蘭給藥均能降低小鼠的不動時間（P＜0.05）。見圖2。

圖2 各組小鼠的強迫游泳不動時間Fig.2 Immobility time of mice in each group in forced swimming test

2.1.3 越鞠甘麥大棗湯增加PPD小鼠體質量與對照組相比，模型組小鼠的體質量減少（P＜0.05）；與模型組相比，越鞠甘麥大棗湯和艾司西酞普蘭均能增加小鼠的體質量（P＜0.05）。見圖3。

圖3 各組小鼠的體質量Fig.3 The body weight of mice in each group

2.2 越鞠甘麥大棗湯對PPD 小鼠海馬SIRT1-ERK1/2 信號相關蛋白表達的影響與對照組相比，模型組小鼠海馬中SIRT1（圖4A）、P-ERK1/2（圖4B）、P90RSK（圖4C）及CREB（圖4D）的表達均降低（P＜0.05），ERK 表達無明顯變化（P＞0.05），P-ERK/ERK 降低（P＜0.05）。與模型組相比，越鞠甘麥大棗湯增加小鼠海馬SIRT1、P-ERK/ERK、P90RSK 及CERB 的表達（P＜0.05），與艾司西酞普蘭作用相似（P＜0.05）。

3 討論

研究表明，情緒和焦慮病史是導致母親產(chǎn)后出現(xiàn)抑郁癥狀的高危因素［1］，抑郁動物表現(xiàn)出自發(fā)活動總路程減少、糖水偏好降低、強迫游泳不動時間增加等抑郁行為［11-12］。其中，反應快感缺失的糖水偏好降低和反應行為絕望的強迫游泳不動時間增加是抑郁動物的核心癥狀。本研究選取了糖水偏好測試和強迫游泳實驗作為判斷造模成功與否的主要依據(jù)，并根據(jù)前期實驗基礎建立產(chǎn)前應激誘導的PPD 模型［13］。本研究結果表明，模型組小鼠表現(xiàn)出糖水偏好降低，強迫游泳不動時間增加，體質量減少等抑郁樣行為，提示造模成功。越鞠甘麥大棗湯和艾司西酞普蘭給藥均能增加小鼠糖水偏好，降低小鼠強迫游泳不動時間并增加小鼠的體質量，表明越鞠甘麥大棗湯與艾司西酞普蘭均表現(xiàn)出抗抑郁治療作用。

圖4 各組小鼠海馬中SIRT1-ERK1/2 信號通路相關蛋白表達水平Fig.4 Expression level of SIRT1-ERK1/2 signaling pathway related proteins in the hippocampus of mice in each group

SIRT1 最初被鑒定為組蛋白脫乙?；?，在海馬、丘腦、小腦和大腦皮層中高表達［14］。SIRT1 參與神經(jīng)元存活的調節(jié)，具有神經(jīng)保護作用。在神經(jīng)生長過程中，SIRT1 參與神經(jīng)元軸突生長、樹突分枝［6，15］，并調節(jié)海馬突觸可塑性和突觸形成［16］。有研究認為，SIRT1 的抑制參與了抑郁癥的發(fā)病過程。LIU 等［17］研究發(fā)現(xiàn)慢性不可預測輕度應激降低雄性C57BL/6 小鼠海馬SIRT1mRNA 的表達水平。LEI 等［18］發(fā)現(xiàn)SIRT1 內側前額葉皮層特異性敲除誘導小鼠出現(xiàn)抑郁樣行為，而SIRT1 激活劑SRT2104 可逆轉小鼠的快感缺失和行為絕望。

目前研究［19］認為，ERK 途徑參與了SIRT1 介導的神經(jīng)保護作用。ERK 作為絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）家族成員之一，參與神經(jīng)元存活和神經(jīng)保護的轉導途徑［8，20］。SIRT1 激活增強ERK 活化，協(xié)同發(fā)揮神經(jīng)保護作用［21］。此外，ERK 信號激活后作用于其直接底物RSK，兩者協(xié)同作用共同入核，促進下游轉錄因子CREB 活化以調節(jié)基因轉錄，參與多種生物學效應的形成過程［22-23］。不同造模方式誘導的抑郁動物模型中，ERK1/2-CREB 信號顯著下調，而抗抑郁藥可激活ERK1/2-CREB 信號通路，增加磷酸化ERK1/2的表達水平［24-26］。在本研究中，PPD模型組小鼠海馬SIRT1、P-ERK/ERK、P90RSK、CREB 等蛋白的表達均明顯降低，而越鞠甘麥大棗湯給藥能顯著上調相關蛋白的表達，提示孕前慢性應激誘導小鼠出現(xiàn)產(chǎn)后抑郁癥狀，其發(fā)病機制可能與小鼠海馬SIRT1-ERK1/2 信號系統(tǒng)被抑制有關，中藥可能通過激活SIRT1-ERK1/2 信號通路，增強神經(jīng)元存活能力，提高神經(jīng)保護作用及改善神經(jīng)可塑性從而產(chǎn)生抗抑郁作用。學者研究發(fā)現(xiàn)5-羥色胺再攝取抑制劑西酞普蘭可上調人神經(jīng)祖細胞SIRT1 表達，臨床實驗結果表明西酞普蘭可逆轉重度抑郁癥患者血液樣本中SIRT1 mRAN 的表達降低［27］。在本研究中，艾司西酞普蘭表現(xiàn)出相似的上調SIRT1 等蛋白表達的作用。然而臨床上艾司西酞普蘭治療的患者易出現(xiàn)腹瀉、失眠等不良反應［28］，而中藥在臨床治療中副作用少，安全性高，或許能為PPD 的藥物研發(fā)提供新的選擇和方向。

綜上所述，本研究表明越鞠甘麥大棗湯能改善PPD 小鼠的抑郁樣行為，且其可能是通過激活海馬SIRT1-ERK1/2 信號發(fā)揮作用的。本研究首次提出SIRT1 參與了PPD 的發(fā)病過程且中藥可通過影響相關蛋白表達而發(fā)揮抗抑郁作用，為臨床防治PPD 提供了新的研究思路。但本實驗只是初步探討了越鞠甘麥大棗湯影響小鼠海馬相關蛋白的表達，未對其具體的作用機制需要進一步的探討。在接下來的研究中，將采用SIRT1 基因敲除和過表達或使用相應拮抗劑的方式來研究SIRT1在PPD 發(fā)病機制中發(fā)揮的作用以及藥物的治療機制。