酶解與超聲波輔助提取白藜蘆醇工藝優(yōu)化及其含量的HPLC測(cè)定

周亞明 林水森

摘 ? ? ?要：建立超聲波輔助酶法提取葡萄皮渣中白藜蘆醇的有效工藝及其含量的HPLC測(cè)定方法，采用單因素實(shí)驗(yàn)和L9（34）正交試驗(yàn)確定從葡萄皮渣中提取白藜蘆醇的最佳工藝，并采用高效液相色譜法測(cè)定其白藜蘆醇含量。結(jié)果表明：酶解與超聲波輔助提取白藜蘆醇的最佳工藝條件為酶解溫度55 ℃，超聲波處理時(shí)間30 min，料液比為1∶35，提取時(shí)間為4 h，提取溫度75 ℃。提取物的白藜蘆醇平均含量為0.968 5±0.025 mg/g。優(yōu)選的制備工藝可行、穩(wěn)定，檢測(cè)方法快速、簡(jiǎn)便，適用于葡萄皮渣中白藜蘆醇的提取和分析。

關(guān) ?鍵 ?詞：白藜蘆醇;超聲波;葡萄皮渣;提取工藝

中圖分類(lèi)號(hào)：R284 ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A ? ? ? 文章編號(hào)： 1671-0460（2020）05-0846-05

Abstract： An effective extraction process of resveratrol by ultrasonic assisted enzymatic method was established as well as the determination method of the content by HPLC. The extraction process of resveratrol from grape pomace was optimized by single factor experiment and L9（34） orthogonal design test. The content of resveratrol was determined by HPLC. The results showed that optimal extraction process was as follow： the temperature of enzymatic hydrolysis 55 ℃， the time of ultrasonic treatment 6 min， the ratio of material to liquid 1∶35， the time of extraction 4 h， and the temperature of extraction 75 ℃.The average resveratrol content of extract was 0.968 5±0.025 mg/g. The optimum preparation process was suitable for the extraction of resveratrol from grape pomace，which was feasible and stable. The rapid and simple concentration test method was also suitable for quantitative analysis of resveratrol in grape pomace.

Key words： Resveratrol; Ultrasound extraction; Grape skin residue; Extracting process

最近幾年以來(lái)，白藜蘆醇因其多種多樣的活性及特點(diǎn)，開(kāi)始在國(guó)內(nèi)臨床中通過(guò)實(shí)驗(yàn)提取，并在各個(gè)相關(guān)領(lǐng)域當(dāng)中廣泛應(yīng)用[1]。因此，研究提取白藜蘆醇的有效方法具有十分重要的臨床及社會(huì)意

義[2]。我國(guó)具有十分豐富的葡萄資源，絕大部分都應(yīng)用在釀酒當(dāng)中，而釀酒所剩下的大量葡萄皮渣則被當(dāng)作飼料應(yīng)用[3-4]。目前，提取白藜蘆醇的主要方法有酶法、超臨界萃取法、超聲波法、熱水浸提法及有機(jī)溶劑法等[5]。但兩種及兩種以上方法聯(lián)用進(jìn)行提取的報(bào)道較少。酶法當(dāng)中的纖維素酶可以使纖維發(fā)生水解，使植物的細(xì)胞壁受到損壞，將細(xì)胞當(dāng)中的內(nèi)容物充分地釋放出來(lái)，更利于提取相關(guān)有效成分[6-7]。超聲波法[8]通過(guò)超聲波的破碎作用來(lái)充分溶出相關(guān)生物活性的物質(zhì)。因此，本文擬通過(guò)超聲波輔助酶法從葡萄皮渣中提取白藜蘆醇，采用單因素分析和正交實(shí)驗(yàn)，以其提取效果為基礎(chǔ)建立最優(yōu)的提取工藝，同時(shí)采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定所提取白藜蘆醇的含量。本實(shí)驗(yàn)的目的在于建立有效的從葡萄皮渣中提取白藜蘆醇的工藝并測(cè)定其含量，有效拓展葡萄皮渣的應(yīng)用，從中獲得良好的經(jīng)濟(jì)效益。

1 ?實(shí)驗(yàn)部分

1.1 ?實(shí)驗(yàn)儀器

Agilent 1220高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫）;色譜柱：Agilent TC-C18（250×4.6 mm，5 μm） ;FA1224S電子天平（德國(guó)賽多利斯）;超純水純化系統(tǒng)（南京易普易達(dá)）;超聲清洗器（昆山超聲）;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛(ài)朗儀器）;超聲波萃取儀（寧波新芝生物）;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 ?實(shí)驗(yàn)材料及試劑

葡萄皮渣（由購(gòu)自大潤(rùn)發(fā)超市的葡萄制得）：葡萄取皮，將葡萄皮干燥粉碎后，使用60目篩進(jìn)行過(guò)篩;纖維素酶（酶活力：500 000 U/g，浙江一諾生物科技有限公司）;白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品（sigma公司）;甲醇、無(wú)水乙醇、冰醋酸：購(gòu)自廣州西隴化工有限公司，均為分析純;超純水為實(shí)驗(yàn)室自制所得。

1.3 ?實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 ?白藜蘆醇提取物制備

（1）白藜蘆醇提取物制備流程

稱(chēng)取1 g葡萄皮粉于100 mL錐形瓶，加入適量纖維素酶及水進(jìn)行酶解。pH = 5，酶解時(shí)間 1.5 h，酶解溫度55 ℃。酶解后按料液比1∶35加入80%乙醇，將超聲波的功率設(shè)置為400 W，超聲波處理30 min，超聲波處理后于75 ℃提取4 h。采用6 000 r/min離心提取液15 min，取上層清液減壓蒸餾，得白藜蘆醇提取物。

（2）白藜蘆醇制備工藝篩選

應(yīng)用單因素優(yōu)選法，分別篩選出酶解溫度、超聲波處理時(shí)間、料液比、提取時(shí)間、提取溫度。

酶解溫度：取粉末適量，添加1.5 mg/g的纖維素酶，pH = 5，酶解時(shí)間 1.5 h，設(shè)置酶解溫度分別為45、50、55、60、65 ℃，而后按照制備流程提取白藜蘆醇。

超聲波處理時(shí)間：超聲波功率設(shè)置為400 W，處理時(shí)間分別設(shè)置為10、20、30、40、50 min，按制備流程進(jìn)行提取。

料液比：設(shè)置料液比為1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶49，按制備流程進(jìn)行提取。

提取時(shí)間：設(shè)置提取時(shí)間為2.5、3、3.5、4、4.5 h，按制備流程進(jìn)行提取。

提取溫度：設(shè)置提取溫度為60、65、70、75、80 ℃，按制備流程進(jìn)行提取。

根據(jù)提取所得白藜蘆醇含量篩選出適宜的酶解溫度、超聲波處理時(shí)間、料液比、提取時(shí)間及提取溫度。單因素實(shí)驗(yàn)中，白藜蘆醇含量測(cè)定采用紫外分光光度法，Y=0.694 2X-0.031 5，R 2=0.994 2，線性范圍為3.95 ～ 17.71 μg/mL。

（3）提取工藝優(yōu)化

采用L9 （ 34 ） 表進(jìn)行正交試驗(yàn)，因素水平見(jiàn)表 1，評(píng)價(jià)指標(biāo)為提取物中白藜蘆醇的含量，以此優(yōu)化從葡萄皮渣中提取白藜蘆醇的工藝。

（4）不同提取方法的比較

為進(jìn)一步考察超聲波對(duì)從葡萄皮渣中提取白藜蘆醇的效果，在上述實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用4種不同的提取方法，比較其所提取的白藜蘆醇含量。

方法1：稱(chēng)取葡萄皮粉，按料液比1∶35加入80%乙醇，于75 ℃提取4 h。

方法2：稱(chēng)取葡萄皮粉，加入纖維素酶及水適量進(jìn)行酶解。pH=5，酶解時(shí)間1.5 h，酶解溫度55 ℃。酶解后按料液比1∶35加入80%乙醇，于75 ℃提取4 h。

方法3：稱(chēng)取葡萄皮粉，按料液比1∶35加入80%乙醇，超聲波的功率400 W，超聲波處理30 min，超聲波處理后于75 ℃提取4 h。

方法4：稱(chēng)取葡萄皮粉，加入纖維素酶及水適量進(jìn)行酶解。pH=5，酶解時(shí)間1.5 h，酶解溫度55 ℃。酶解后按料液比1∶35加入80%乙醇，超聲波功率400 W，超聲波處理30 min，超聲波處理后于75 ℃提取4 h。

1.3.2 ?白藜蘆醇含量的HPLC測(cè)定

（1）色譜條件

色譜柱：Agilent TC-C18（250×4.6 mm，5μm）;流動(dòng)相為1%甲醇-1%冰醋酸（35∶65）;進(jìn)樣量為20 μL;流速為1.0 mL/min;柱溫為35 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)為305 nm。

（2）工作曲線的建立

對(duì)照品溶液的制備：精密稱(chēng)取白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇配制成濃度為5.000 mg/mL的對(duì)照品溶液。精密量取對(duì)照品溶液，分別制成濃度為0.002 5、0.005、0.012 5、0.025 0、0.050 mg/mL的對(duì)照品溶液。

按1.3.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄相應(yīng)色譜峰峰面積，以對(duì)照品質(zhì)量（μg）為橫坐標(biāo)，相應(yīng)峰面積值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y=9 154.7X+13.514，r=0.987 5，白藜蘆醇含量在26 ～ 5 320 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

（3）精密度試驗(yàn)

取上述濃度為0.012 5 mg/mL的對(duì)照品溶液，按照1.3.2項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄相應(yīng)色譜峰峰面積，計(jì)算白藜蘆醇峰面積的RSD。

（4）穩(wěn)定性試驗(yàn)

取白藜蘆醇提取物溶液，并用微孔濾膜過(guò)濾（孔徑0.45 μm），分別于制備后0、1、2、4、6、8 h在1.3.2項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，記錄相應(yīng)色譜峰峰面積，計(jì)算樣品白藜蘆醇峰面積的RSD。

（5）重復(fù)性試驗(yàn)

取白藜蘆醇提取物，制備成6份樣品溶液，按1.3.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄相應(yīng)色譜峰峰面積，計(jì)算樣品中白藜蘆醇的平均含量及其RSD。

（6）加樣回收實(shí)驗(yàn)

取同一批次制備的白藜蘆醇提取物，制備成相應(yīng)的6份溶液，每份精密加入對(duì)照品貯備液0.1 mL，微孔濾膜過(guò)濾（孔徑0.45 μm），按1.3.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄相應(yīng)色譜峰峰面積，計(jì)算平均回收率及其RSD。

（7）樣品含量測(cè)定

取不同批次制備的白藜蘆醇提取物適量，制備成相應(yīng)的溶液，按1.3.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，每批次樣品平行測(cè)定兩次，記錄相應(yīng)色譜峰峰面積，計(jì)算樣品含量。

2 ?結(jié)果與討論

2.1 ?白藜蘆醇制備工藝篩選

白藜蘆醇制備工藝篩選結(jié)果見(jiàn)表2。酶解溫度對(duì)纖維素酶的酶活性和酶促反應(yīng)速度有很大的影響。

從表2中可以得知，酶解溫度在55 ℃時(shí)，白藜蘆醇的提取含量最高，為0.79 mg/g，大于55 ℃之后，提取含量逐漸降低。 超聲波處理時(shí)間在30 min時(shí)，白藜蘆醇的提取含量為0.78 mg/g，為最大值。料液比為1∶40時(shí)，白藜蘆醇的提取含量最高，但料液比1∶30和1∶35的提取含量與1∶40所得的提取含量相差不大。提取時(shí)間為4 h時(shí)，白藜蘆醇的提取含量為0.78 mg/g，提取時(shí)間延長(zhǎng)，提取含量反而降低。提取溫度為75 ℃時(shí)，白藜蘆醇的提取含量最高，為0.81 mg/g。通過(guò)單因素優(yōu)選法，初步確定酶解溫度為55 ℃，超聲波處理時(shí)間為30 min，料液比為1∶35，提取時(shí)間為4 h，提取溫度為75 ℃。

2.2 ?提取工藝的正交優(yōu)化

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取酶解溫度（A）、超聲波處理時(shí)間（B）、料液比（C）、提取時(shí)間（D）作為考察因素進(jìn)行正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，以白藜蘆醇含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，結(jié)果見(jiàn)表3。通過(guò)表3和表4可知，影響提取工藝的因素依次為料液比、提取時(shí)間、超聲處理時(shí)間及酶解溫度。

料液比對(duì)從葡萄皮渣中提取白藜蘆醇的影響最為顯著，其次是提取時(shí)間，超聲處理時(shí)間及酶解溫度對(duì)提取工藝的影響不明顯。通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，從葡萄皮渣中提取白藜蘆醇的最佳工藝組合為A1B2C2D2，綜合單因素實(shí)驗(yàn)，最后確定提取最佳工藝為酶解溫度55 ℃，超聲波處理時(shí)間30 min，料液比為1∶35，提取時(shí)間為4 h，提取溫度75 ℃。為驗(yàn)證工藝的可行性和穩(wěn)定性，在上述條件下，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，提取制備了3份白藜蘆醇提取物，其白藜蘆醇含量平均值為1.018 mg/g，RSD為1.19%。

2.3 ?不同提取方法的比較

不同提取方法提取葡萄皮渣中白藜蘆醇的結(jié)果見(jiàn)表5。

從表5可知，加入纖維素酶及采用超聲波輔助均可提高白藜蘆醇的提取含量，超聲波輔助的提取增量作用大于加入纖維素酶，而兩種共同作用可以更為有效地提高提取含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明超聲波對(duì)從葡萄皮渣中提取白藜蘆醇是有效的。

2.4 ?白藜蘆醇含量的HPLC測(cè)定

2.4.1 ?精密度實(shí)驗(yàn)

精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6，白藜蘆醇峰面積的RSD為0.92%（n=5），表明儀器精密度良好。

2.4.2 ?穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表7，白藜蘆醇峰面積的RSD為0.87%（n=6），表明樣品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.3 ?重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表8，白藜蘆醇峰面積的RSD為0.64%（n=6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.4 ?加樣回收實(shí)驗(yàn)

通過(guò)峰面積的測(cè)定，計(jì)算得白藜蘆醇平均加樣回收率為98.08%，RSD為1.82%（n=6）。

2.4.5 ?樣品含量測(cè)定

實(shí)際樣品含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表9。

3 ?結(jié) 論

白藜蘆醇在自然植物中廣泛存在，同時(shí)具有很高的食藥兩用價(jià)值 [9-10]。但從葡萄皮渣中提取白藜蘆醇進(jìn)行再利用的研究較少。因此，研究建立了超聲波輔助酶法 [11]提取葡萄皮渣中的白藜蘆醇，并采用HPLC[12]對(duì)提取物中的白藜蘆醇含量進(jìn)行測(cè)定，提高了檢測(cè)方法的效率和靈敏度同時(shí)進(jìn)行了質(zhì)量控制。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)、正交實(shí)驗(yàn)研究后，確定了從葡萄皮渣中提取白藜蘆醇的最佳工藝為：酶解時(shí)間1.5 h，酶解溫度55 ℃，酶解后按料液比為1∶35，超聲波處理時(shí)間30 min，超聲波處理后于75 ℃提取4 h。該工藝條件下提取所得提取物的白藜蘆醇含量為0.968 5±0.025 mg/g（n=8）。綜上所述，在葡萄皮渣中提取白藜蘆醇時(shí)，應(yīng)用超聲波輔助酶法復(fù)合處理的方法可以更加顯著地提高白藜蘆醇的提取含量，同時(shí)采用HPLC檢測(cè)含量進(jìn)行質(zhì)量控制，該工藝穩(wěn)定性高，可操作性強(qiáng)，靈敏度高，有效拓展了葡萄皮渣的應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)：

[1] 王虹玲，吳優(yōu)，于子簫，等.釀酒葡萄皮渣中白藜蘆醇的提取及抗氧化、抗腫瘤活性研究[J].中國(guó)釀造，2018，10（7）：112-116.

[2] 高原，王福玲，徐蓓蕾，等.葡萄籽中白藜蘆醇的提取及其對(duì)LO2細(xì)胞氧化損傷保護(hù)及延緩衰老作用[J].生物技術(shù)通報(bào)，2018，34（3）：225-229.

[3]Li P， Zhao Y Q， Fan G X. Quantitative analysis of alkanoate and condensed arenes in the extracts from direct coal liquefaction residue by ultrasonication-assisted solvent extraction using alcohols[J]. Energy Sources Part A Recovery Utilization & Environmental Effects， 2018， 40（10）：1266-1272.

[4] 吳佳，王燕，劉婷，等.大孔樹(shù)脂對(duì)刺葡萄酒渣中提取的白藜蘆醇的純化工藝研究[J].中國(guó)釀造，2017，36（3）：144-149.

[5] 孫詩(shī)雯，張笑笛，宋宇.葡萄中白藜蘆醇合成酶基因的克隆及其轉(zhuǎn)化黃芪研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（9）：38-41.

[6] 楊祎彬，龔澤華，裘海平，等.重組里氏木霉粗酶液提取虎杖中白藜蘆醇的研究[J].高?；瘜W(xué)工程學(xué)報(bào)，2017，31（5）：1156-1161.

[7] Pelayo， Envo， Esono， et al. Study on the Modifcation of Vacuum Residue by Ultrasonic Radiation[J]. China Petroleum Processing & Petrochemical Technology， 2017， 19（1）：114-122.

[8] 唐春偉，梁宗義，田志龍，等.正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)香加皮中總黃酮的提取工藝[J].當(dāng)代化工，2019，48（6）：1166-1169.

[9] 許麗麗，岳倩宇，卞鳳娥，等.褪黑素誘導(dǎo)sts基因表達(dá)提高葡萄白藜蘆醇含量[J].食品科學(xué)，2018，39（10）：171-178.

[10]車(chē)金鑫，師俊玲，羅光武.廣西羅城毛葡萄多酚、黃酮和白藜蘆醇的組成特性及其抗氧化活性研究[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2017，45（7）：107-114.

[11]張國(guó)濤.超聲波法提取蕎麥粉中黃酮類(lèi)化合物的工藝研究[J].當(dāng)代化工，2017，46（8）：1524-1526.

[12]許志彬，李巧琪，李婷，等.柑橘種子中檸檬苦素的提取工藝優(yōu)化及分析[J].當(dāng)代化工，2016，45（10）：2325-2327.