超聲輔助酶解大米多肽對酵母細胞活性及耐凍性的影響

李素云，覃穎泉，謝冬梅，張華，李星科，王語遲

鄭州輕工業(yè)大學食品與生物工程學院（鄭州 450002）

冷凍面團技術是應用在面食制品生產(chǎn)的新工藝，因其不僅能延長面食制品的貯藏時間，還能提高面食制品制作的方便和貯藏穩(wěn)定性，所以發(fā)展迅速。但冷凍后的面食制品會出現(xiàn)一定程度的品質變化，這是因為在冷凍過程中，酵母菌細胞內(nèi)外水分凍結成冰，冰晶生長會破壞酵母細胞膜結構，同時酵母胞內(nèi)水分變化會發(fā)生電解質濃縮效應，影響細胞的生理功能和代謝功能，直接對酵母菌造成機械傷害[1-2]，從而導致冷凍后饅頭體積變小、醒發(fā)時間延長等問題，這嚴重制約冷凍面團制品發(fā)展[3-4]。因此，對于酵母細胞耐凍性增強和活性保護成為冷凍面團研究的主要問題[5]。

前期研究表明，在相同酶解時間內(nèi)，超聲輔助酶解的大米多肽（RP）培養(yǎng)基中得到的酵母細胞量比未超聲培養(yǎng)基中得到的酵母細胞量多，證明大米多肽可以促進酵母細胞增殖，且與多肽分子量大小有關。因此試驗以葡萄糖作為碳源，在酵母培養(yǎng)基中用超聲輔助酶解制取的大米多肽、酪蛋白胨及酵母氮源作為氮源進行比較，進一步研究大米多肽對酵母增殖、發(fā)酵活性及耐凍性的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

大米多肽（RP，制備具體參數(shù)為：超聲功率密度51.8 W/L、超聲溫度50 ℃、超聲時間15 min；大米蛋白溶液濃度40 g/L，酶添加量[E]/[S]=6%，溶液溫度50 ℃、pH 8.5，酶解100 min后滅酶、上清液凍干）；酪蛋白胨；酵母氮源；葡萄糖（分析純）；安琪干酵母；酵母浸粉；蛋白胨；瓊脂粉。

1.2 主要儀器與設備

離心機；低溫冰箱；可見/紫外分光光度計；立式壓力蒸汽滅菌器；超凈工作臺；生化培養(yǎng)箱；恒溫振蕩器。

1.3 試驗方法

1.3.1 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的確定

YNB培養(yǎng)基：20 g/L葡萄糖、6.7 g/L YNB（酵母氮源基礎）、pH 5.5；大米多肽培養(yǎng)基：20 g/L葡萄糖、10～30 g/L RP（大米多肽）、pH 5.5；25 g/L CP培養(yǎng)基：20 g/L葡萄糖、25 g/L CP（酪蛋白胨）、pH 5.5；YPD培養(yǎng)基：10 g/L酵母浸粉、20 g/L葡萄糖、20 g/L蛋白胨（固體培養(yǎng)基加20 g/L瓊脂粉）。YNB培養(yǎng)基用0.22 μm濾膜過濾除菌，其他培養(yǎng)基121 ℃、15 min高溫高壓滅菌；酵母細胞培養(yǎng)在100 mL培養(yǎng)基中，安琪酵母經(jīng)2代活化后以1%接種量接菌于培養(yǎng)基，于30 ℃、120 r/min培養(yǎng)24 h。

1.3.2 酵母細胞的收集及濕質量測定

將培養(yǎng)24 h后的菌液分裝到提前稱質量并記錄好質量（m1，g）的50 mL離心管，使用離心機離心得到酵母細胞。離心條件為：轉速4 000 r/min、離心時間10 min。離心后菌液下層沉淀即為所需的酵母細胞，舍去上清液，稱定離心管質量（m2，g），m2與m1的差即為所得酵母細胞的濕質量。

1.3.3 發(fā)酵面團制備、發(fā)酵過程測定及蒸制

將離心后得到的酵母細胞與42 g去離子水、75 g面粉混合成面團，每份50 g于100 mL相同規(guī)格的小燒杯中壓平表面，一份于37 ℃直接發(fā)酵，另一份置于-18℃低溫冰箱儲存5 d，取出常溫解凍1 h后37 ℃發(fā)酵。面團發(fā)酵過程中每隔15 min用直尺測面團高度并記錄，發(fā)酵結束后，將發(fā)酵面團于沸水入鍋蒸20 min，結束5 min后開鍋取出放涼，從中間切開觀察剖面。

1.3.4 生長曲線的測定

為了解不同氮源培養(yǎng)基對酵母增殖的影響，將經(jīng)2代活化后的酵母菌液以1%接種量接菌于100 mL培養(yǎng)基中，在30 ℃下以120 r/min搖床培養(yǎng)。分別在0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，24，27，30，33和36 h時取樣，用可見/紫外分光光度計測定菌液吸光度，測定波長600 nm。以生長時間為橫坐標，菌液吸光度為縱坐標，繪制生長曲線。

1.3.5 酵母細胞存活率的測定

培養(yǎng)結束后用稀釋涂布平板法對所得菌液進行平板培養(yǎng)計數(shù)，同時將菌液置于-18 ℃低溫冰箱儲存5 d，取出解凍1 h后用同樣的方法進行平板培養(yǎng)計數(shù)，得到冷凍前后培養(yǎng)液中酵母細胞濃度，計算存活率。

存活率=lg（冷凍后培養(yǎng)液中酵母細胞濃度）/lg（未冷凍時培養(yǎng)液中酵母細胞濃度）×100% （1）

2 結果與分析

2.1 不同氮源培養(yǎng)基對酵母細胞增殖的影響

由前期研究可知，培養(yǎng)基中添加25 g/L大米多肽可以獲得較好的培養(yǎng)效果。因此以25 g/L氮源濃度研究其對酵母細胞增殖影響，所以試驗培養(yǎng)基濃度均為25 g/L。表1為不同氮源培養(yǎng)基培養(yǎng)酵母細胞離心后得到的酵母細胞濕質量。由表1可知，大米培養(yǎng)基離心后得到的酵母細胞最多，有1.35 g；其次是CP培養(yǎng)基，離心出1.26 g酵母細胞；最后是YNB培養(yǎng)基和空白對照組。從表1的數(shù)據(jù)可證明大米多肽對于酵母細胞的增殖有促進作用。

表1 不同氮源培養(yǎng)基中得到的酵母濕質量

2.2 不同氮源培養(yǎng)基培養(yǎng)酵母的生長曲線

以25 g/L氮源濃度研究其對酵母細胞培養(yǎng)過程的影響，OD600nm值的大小和菌液中的細胞密度呈正比，具體結果見圖1。結果表明，CP作為氮源的培養(yǎng)基在0～5 h和其他氮源培養(yǎng)基內(nèi)的酵母數(shù)量差別不大，但是于10～24 h菌液的OD600nm值增加比YNB、CP的快，且酵母的對數(shù)期時間較長。因此大米多肽作為氮源培養(yǎng)基最終得到更多酵母細胞，證明大米多肽能促進酵母細胞增殖。

圖1 不同氮源培養(yǎng)基中酵母細胞的生長曲線

2.3 大米多肽培養(yǎng)基對面團中酵母細胞發(fā)酵活性的影響

在相同大小的燒杯中，通過測量面團的發(fā)酵高度的增長表示面團中酵母細胞的發(fā)酵力。圖2為3種不同氮源的培養(yǎng)基所得酵母發(fā)酵面團高度。

由圖2可知，與CP和YNB培養(yǎng)基中所得酵母細胞發(fā)酵的面團能力相比，RP培養(yǎng)基中所得酵母細胞發(fā)酵的面團最先達到發(fā)酵終點，約120 min，且此時面團增長高度約是YNB面團的1.02倍、CP面團的1.7倍，表明以大米多肽作為培養(yǎng)基氮源培養(yǎng)酵母細胞在面團中具有更好發(fā)酵力。

對于冷凍面團，由圖2可以看出，大米多肽培養(yǎng)基面團能更快進入發(fā)酵狀態(tài)，發(fā)酵力保持仍然很好，210 min時大米多肽培養(yǎng)基面團增長高度約是YNB培養(yǎng)基面團的2.9倍，是CP培養(yǎng)基面團的9.6倍。因此大米多肽培養(yǎng)得到的酵母細胞在冷凍后的發(fā)酵面團中也能夠較好地保持發(fā)酵力。

圖2 不同氮源培養(yǎng)所得酵母發(fā)酵面團高度

圖3 是不同時間面團發(fā)酵的照片記錄，可看到60 min時各個面團的發(fā)酵程度相差比較明顯，未冷凍的發(fā)酵面團隨發(fā)酵的進行高度差距逐漸減小，而以大米多肽作為培養(yǎng)基培養(yǎng)的酵母添加到面團冷凍后發(fā)酵高度始終明顯高于其他兩種面團。結合圖2，冷凍后面團發(fā)酵過程中的高度變化表明，冷凍后大米多肽培養(yǎng)基培養(yǎng)的酵母細胞在面團中能夠保持較高的發(fā)酵力，用大米多肽作為培養(yǎng)基氮源培養(yǎng)酵母細胞在面團冷凍過程中發(fā)酵力的損失較少。發(fā)酵結束面團蒸制后切面照片如圖4所示。對于未經(jīng)冷凍的面團蒸制的饅頭，大米多肽培養(yǎng)基饅頭內(nèi)部氣孔細密均勻；CP培養(yǎng)基、YNB培養(yǎng)基和空白組饅頭內(nèi)部氣孔相較之下不夠均勻，存在較多大氣孔。對于面團冷凍5 d后蒸制的饅頭，大米多肽饅頭內(nèi)部氣孔與未經(jīng)凍藏相比變化較小，但CP、YNB培養(yǎng)基和空白組饅頭內(nèi)部氣孔都變小很多，表示相應發(fā)酵力很小。

2.4 發(fā)酵面團中添加大米多肽方式對酵母細胞發(fā)酵活性的影響

大米多肽作為培養(yǎng)基氮源來培養(yǎng)酵母細胞添加在普通面團和冷凍面團中均有顯著效果，將大米多肽直接添加到面團中進行發(fā)酵，發(fā)酵面團的高度變化曲線如圖5所示。大米多肽直接添加到面粉里進行發(fā)酵，在初始階段發(fā)酵力比大米蛋白作為培養(yǎng)基的效果要好，但是120 min后大米蛋白作為培養(yǎng)基的效果要好于直接添加到面粉里的，同時冷凍后的面團具有相同趨勢。原因有可能是多肽作為培養(yǎng)基氮源培養(yǎng)得到更多酵母細胞，同時這些酵母細胞還具有更好的耐凍性，研究結果與Izawa等[6]相同。

圖3 冷凍和未冷凍面團在不同發(fā)酵時間的照片記錄（從左到右為RP，CP，YNB）

圖4 發(fā)酵結束蒸制后的照片記錄

圖5 發(fā)酵面團中添加大米多肽方式對酵母細胞發(fā)酵活性的影響

2.5 不同氮源培養(yǎng)對酵母細胞耐凍性的影響

為探究大米多肽對酵母細胞耐凍性的影響，不同培養(yǎng)基中酵母細胞冷凍前后的細胞存活率如圖6所示。RP培養(yǎng)基里的酵母存活率最高，YNB次之，CP培養(yǎng)基里的酵母存活率最低。大米多肽培養(yǎng)基培養(yǎng)的酵母細胞冷凍后存活率明顯高于CP培養(yǎng)基培養(yǎng)的酵母細胞，比CP培養(yǎng)基里的酵母細胞存活率高約34.58%，表明大米多肽對增強酵母細胞的耐凍性有一定影響，可減少冷凍導致的細胞失活。

圖6 冷凍前后不同培養(yǎng)基中的酵母細胞存活率

3 結果與討論

用不同的培養(yǎng)基培養(yǎng)酵母細胞對酵母細胞的增殖、發(fā)酵活力及耐凍性有不同影響。由試驗可得到如下結論：

1) 大米多肽對于酵母細胞的增殖有促進作用。大米多肽、CP和YNB這3種培養(yǎng)基中，大米多肽培養(yǎng)基培養(yǎng)的酵母細胞增殖最多。

2) 與酵母氮源及酪蛋白胨相比，以大米多肽作為氮源的培養(yǎng)基培養(yǎng)酵母，在普通發(fā)酵面團及冷凍發(fā)酵面團中具有更好的發(fā)酵力。

3) 在面團中直接添加大米多肽對普通發(fā)酵面團及冷凍發(fā)酵面團都沒有顯著的效果，因此大米多肽對于酵母細胞增殖影響主要作用在酵母細胞的培養(yǎng)過程而不是發(fā)酵過程。

大米多肽在酵母細胞的培養(yǎng)過程中，促進酵母細胞的增殖，使酵母細胞的耐凍性增強，改善了冷凍面團的發(fā)酵性能。大米多肽作為一種本身可食用的功能性營養(yǎng)物質應用于培養(yǎng)基，與基因手段等方法相比更加簡便高效且安全，應用于酵母細胞制備和冷凍面團中也更容易被消費者所接受，能擴大大米多肽的應用范圍。