丹參莖葉中酚酸類及黃酮類成分的提取純化方法研究

刁保忠，靳維榮，周德剛

（聊城市人民醫(yī)院制劑科，山東 聊城 252000）

丹參是唇形科鼠尾草屬植物，性苦，微寒，歸心、肝經(jīng)，功效以祛瘀止痛、活血通經(jīng)等為主，是當下治療心血管疾病的傳統(tǒng)中藥之一?，F(xiàn)代藥理學研究指出，丹參的有效成分以酚酸類及黃酮類為主，酚酸類是一類含有酚羥基的有機酸類化合物，屬于丹參莖葉與丹參藥用部位類似的成分[1]。本次研究基于前人研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，將丹參莖葉內(nèi)酚酸類及黃酮類成分設(shè)為研究對象，對其提取純化工藝作出如下研究。

1 儀器與試劑

Agilent 1200型液相色譜儀，Agilent TC C18色譜柱與保護柱；玻璃層析柱。藥用乙醇，

高純水（自制），丹參素鈉等。丹參取自天士力商洛GAP種植基地。樣品在48℃條件下熱風烘干，干燥后經(jīng)粉碎處理后過40目篩，于常溫下密封干燥、保存以備用。

2 方 法

2.1 檢測丹參莖葉酚酮類成分

（1）確定色譜條件：色譜柱是Agilent TC C18；柱溫、流動相、流動相、體積流量、進樣量依次為35℃，乙腈-0.1%甲酸水溶液、0.4 ml/min、2 μL。用于檢測波長280 nm（丹酚酸類）與254 nm（黃酮類）。

（2）制取對照品溶液：精確稱取丹參素、原兒茶酸、蘆丁、異槲皮苷，放置于棕色量瓶內(nèi)，加入90%甲醇以制備含丹參素0.155 mg/mL、原兒茶酸0.115 mg/mL、蘆丁 0.123 mg/mL、異槲皮苷 0.122 mg/mL的混合對照品溶液。

（3）制取供試品溶液：具體是取適量溶液，定容處理到相應(yīng)容積，充分混合，濾過，12500 r/min離心處理12 min，提取上層清液，采用0.22 μm微孔濾膜濾過處理后即可獲得。

（4）考察線性關(guān)系：提取混合對照組溶液，分別稀釋到2、10、100倍，用0.22 μm微孔濾膜濾過處理，依照“（1）”中的色譜條件依次分析，將對照樣品的質(zhì)量濃度、峰面積分別設(shè)為橫坐標（X）、縱坐標（Y），勾畫標準曲線，進行線性回歸分析，計算出相應(yīng)的回歸方程。

（5）精密性試驗：量取混合對照品溶液持續(xù)進樣5次，記錄各對照品對應(yīng)的色譜峰峰面積。若各對照品色譜峰峰面積的RSD均＜1.34%，則提示儀器精密性優(yōu)良。

2.2 研究丹參莖葉的提取純化工藝

（1）考察提取方法：①超聲提?。喝〉⑶o葉藥材適量，粉碎處理后過40目篩，精確量取5 g粉末，采用料液比為1∶8、乙醇超聲（300 W，50 kHz）連續(xù)提取2次，每次對應(yīng)的提取時間均為30 min，檢測指標成分的含量。②乙醇回流：取材適量，粉碎后依然過40目篩，稱取5 g粉末，料液比為18，乙醇回流進行2次提取，每次對應(yīng)的提取時間為60min，定量檢測。結(jié)果表明，在指標成分提取率比較上，進行單因素與正交試驗考察。

（2）提取時間：取材適量，粉碎處理后過40目篩，稱取粉末5 g，利用60%乙醇，料液比1:8，提取1次，考察不同的提取時間點（1.0、1.5、2.0、2.5 h）對提起成分總量形成的影響。結(jié)果提示，伴隨時間的推延，丹參莖葉酚酸類及黃酮類成分含量有上升趨勢，且在2.0 h時達到峰值，隨后有降低趨勢。提取時間為1.0、1.5、2.0、2.5 h時，黃酮類成分含量分別為3.95、4.06、3.98、3.82，酚酸類依次為36.47、36.83、39.60、37.76，總量分別為40.44、40.88、43.58、41.61（單位㎎/g）。因為丹酚酸B穩(wěn)定性偏差，不適合長時間加熱，故而選擇1.0、2.0 h進行正交試驗。

（3）提取頻次：伴隨提取頻次的增加，成分總量有不斷上升的趨勢，提取3次后總量不再上升。

（4）正交試驗：取材適量，粉碎后過40目篩，精確量取6份藥材，每份均5 g，依照L9（34）正交試驗表進行試驗。依照單因素試驗結(jié)果，選擇乙醇體積分數(shù)（A）、提取時間（C）及提取頻次（D）3個因素，考察最優(yōu)的提取工藝條件。試驗結(jié)果表明，各因素作用主次為D＞C＞A。見表1。

表1 L9（34）正交試驗設(shè)計與直觀分析

2.3 純化工藝

利用靜態(tài)吸附法，篩選出丹參莖葉純化對應(yīng)的最適樹脂。精確量取 D101、HDP-100、X-5、AB-8濕樹脂各1.0 g，分別放置在50 mL三角燒瓶內(nèi)，依次加入最佳工藝參莖葉濃縮提取液（10 mL），混合搖勻。對靜態(tài)飽和吸附的樹脂進行過濾處理，加入10ml 50%乙醇，再次混合搖勻，檢測吸液內(nèi)黃酮類與酚酸類成分量，測算各樹脂對應(yīng)的解吸率。結(jié)果表明，X-5、AB-8兩者的吸附效果無顯著差異。

用AB-8 型大孔吸附樹脂予以純化，40%乙醇洗脫，洗脫用量為3BV是最佳純化工藝，酚酸類及黃酮類成分總純度能達到42.17%

3 結(jié)束語

采用AB-8型大孔吸附樹脂予以純化，40%乙醇洗脫，洗脫用量為3BV是最佳純化工藝[2]，酚酸類及黃酮類成分總純度能達到42.17%。由此可見，選擇最優(yōu)提取工藝，能提高丹參莖葉酚酮的提取純化效率，為資源開發(fā)提供支撐。