不同波長(zhǎng)變化HPLC法同時(shí)測(cè)定護(hù)肝片中主要成分含量分析

李 巖，李本淳，張成穎，王 彤

（1.白城市食品藥品檢驗(yàn)所，吉林 白城 137000；2.四平市食品藥品檢驗(yàn)所，吉林 四平 136000； 3.大連市婦女兒童醫(yī)療中心，遼寧 大連 116037；4.吉林省白城市實(shí)驗(yàn)高級(jí)中學(xué)，吉林 白城 137000）

在慢性肝炎、早期肝硬化治療對(duì)策中，護(hù)肝片因所具健脾消食、疏肝解郁功用以及降低轉(zhuǎn)氨酶功效而為主選中藥方制劑[1]。護(hù)肝片組方為板藍(lán)根313 g、柴胡313 g、豬膽粉20 g、茵陳313 g、五味子168 g、綠豆168 g，但目前《中國(guó)藥典》2015年版僅限五味子醇甲含量測(cè)定，對(duì)復(fù)方質(zhì)量難以做出全面客觀評(píng)價(jià)[2]。文獻(xiàn)報(bào)道在護(hù)肝片質(zhì)控方面，護(hù)肝片高效液相色譜分析法（HPLC）建立及多成分含量測(cè)定為之提供了新的思路[3]。本文采用雙波長(zhǎng)HPLC法開(kāi)展護(hù)肝片主要成分定量研究，為進(jìn)一步提高護(hù)肝片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，保證質(zhì)量可控。

1 儀器與試藥

Agilent 1100高效液相色譜儀、HH-2型恒溫水浴鍋、CPA 225D精密電子分析天平、HS2060超聲波清洗器、SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵、SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵。

護(hù)肝片：屬糖衣片制劑，片心凈重0.35 g；對(duì)照品：統(tǒng)一自中國(guó)食品藥品檢定研究院購(gòu)進(jìn)，依次取純度為94.9%、96.8%、99.9%、99.5%、99.0%的牡荊苷（批號(hào)111687-201704）、綠原酸（批號(hào)110753-201817）、五味子醇甲（批號(hào)110857-201714）、五味子甲素（批號(hào)110764-201714）以及五味子乙素（批號(hào)110765-201512）；購(gòu)Fisher公司乙腈為色譜純，取磷酸為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 對(duì)照品溶液

依次對(duì)上述對(duì)照品精準(zhǔn)稱取，加甲醇溶解，制成每 ml含牡荊苷、綠原酸、五味子醇甲、五味子甲素以及五味子乙素各0.04、0.04、0.13、0.038、0.04 mg混合溶液，于冰箱內(nèi)冷藏備用。

2.1.2 供試品溶液

對(duì)護(hù)肝片予以適量稱取，研磨成細(xì)粉狀，對(duì)其進(jìn)行精密稱定0.35 g，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇20 ml，稱定重量，超聲處理（功率60 W，頻率40 kHz）30分鐘，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)。取續(xù)濾液，即得。

2.2 色譜條件

研究所用為ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm， 5 μm），甲醇(A)-0.2%磷酸溶液(B)為流動(dòng)相，梯度洗脫（20～30 min為45%～85%A，11～20 min為35%～45%A，10～11 min為5%～35%A，0～10 min，5%A）；流速 1.0 mL/min，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)取兩種，即0～20 min 340 nm和20.01～40 min 254 nm，進(jìn)樣量20 μL。

2.3 線性關(guān)系考察

精密量取對(duì)照品溶液，加50%甲醇，經(jīng)1倍、2倍、 4倍、8倍、16倍稀釋，自所得系列濃度溶液中各取20 μL進(jìn)樣，展開(kāi)峰面積測(cè)定。結(jié)果顯示各自濃度范圍內(nèi)5種成分線性關(guān)系良好，γ≥0.9999。

2.4 精密度試驗(yàn)

按照上述色譜條件對(duì)精密量取供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣 6次，測(cè)定五種成分峰面積RSD均＜3%，證實(shí)儀器精密度 良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液放置于室溫下，0、6、12、18、24 h進(jìn)樣分析，所測(cè)定各成分峰面積RSD＜3%，表明供試品待測(cè)成分在24 h內(nèi)可保持良好穩(wěn)定性。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

以同樣方法平行備份同一批次供試品溶液，按照上述色譜條件分析，護(hù)肝片各成分峰面積RSD＜3%，證實(shí)方法重復(fù)性良好。

2.7 樣品含量測(cè)定結(jié)果

按照供試品溶液制備方法對(duì)研究所取不同批號(hào)護(hù)肝片進(jìn)行制備，并經(jīng)上述色譜條件開(kāi)展進(jìn)樣測(cè)定，對(duì)5種成分含量予以外標(biāo)法計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 護(hù)肝片中5種含量測(cè)定結(jié)果（mg/片，n=3）

3 討 論

對(duì)于提取溶劑的選擇，主要考慮到綠原酸、五味子醇甲等均于甲醇溶解，在對(duì)不同濃度的甲醇溶液（50%、75%、100%）實(shí)施試驗(yàn)后，證實(shí)50%甲醇提取情況下，各成分所獲峰形均表現(xiàn)良好，且綠原酸峰形為最高。而在對(duì)溶劑用量、超聲時(shí)間對(duì)結(jié)果的影響考察中，發(fā)現(xiàn)20 mL、 30 min為最佳值。

甲醇作為流動(dòng)相于試驗(yàn)中獲得良好峰形，并對(duì)0.05%、0.1%、0.3%及0.2%磷酸濃度予以比較，結(jié)果0.05%時(shí)峰形最差，0.2%峰形最好。此外，在pH≥1偏酸性環(huán)境下，ZORBAX SB-C18柱有較好耐受性，試驗(yàn)用0.2%磷酸水溶液pH值在1.95左右，因此該色譜柱完全可滿足要求。在對(duì)柱溫的選擇過(guò)程中，考察了25、30及35℃色譜圖，色譜峰保留時(shí)間伴隨溫度上升而呈縮短顯示，30℃時(shí)峰形良好，故確定此溫度。對(duì)混合對(duì)照品應(yīng)用PDA檢測(cè)器進(jìn)行190～400 nm波長(zhǎng)掃描，顯示在0～20 min檢測(cè)波長(zhǎng)為340 nm、20.01～40 min 254 nm為最佳。

4 小 結(jié)

護(hù)肝片對(duì)肝細(xì)胞保護(hù)及轉(zhuǎn)氨酶降低具顯著作用，機(jī)制為通過(guò)對(duì)受損肝細(xì)胞SOD、GSH活性的增強(qiáng)，使MDA產(chǎn)生受到抑制，進(jìn)而保護(hù)細(xì)胞器與酶結(jié)構(gòu)功能，提高肝細(xì)胞抗氧化能力[4-5]。但藥效物質(zhì)基礎(chǔ)尚不確定且機(jī)制不清楚，對(duì)質(zhì)量的控制標(biāo)準(zhǔn)較為單一，故對(duì)臨床療效的提高存在一定局限。為健全護(hù)肝片質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，本文對(duì)其主要成分含量予以不同波長(zhǎng)HPLC法測(cè)定，結(jié)果顯示不同批次護(hù)肝片中所含五味子醇甲經(jīng)測(cè)定均在0.28 mg以上，符合《中國(guó)藥典》所規(guī)定，但不同批次間各成分含量有一定程度不同，提示不同批號(hào)所選用中藥原材料質(zhì)量或有差異。經(jīng)系統(tǒng)且全面的數(shù)據(jù)評(píng)價(jià)、分析及處理方法，可為后續(xù)護(hù)肝片的質(zhì)控提供可行性參考與理論依據(jù)，且方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，同時(shí)有利于生產(chǎn)廠家更為高效和合理的對(duì)藥品質(zhì)量把控。