阿卡斑病毒qRT-PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用

孟錦昕，李楠，何于雯，王靜林

(云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224)

阿卡斑病毒(Akabane virus，AKAV)屬布尼亞病毒科(Bunyaviridae)正布尼亞病毒屬(Orthobunyavirus)辛波(Simbu)病毒血清群中的一個(gè)亞群，為單股負(fù)鏈分節(jié)段RNA病毒[1，2]。AKAV引起的赤羽病是造成牛、羊等動(dòng)物流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎、畸形胎、木乃伊胎的一種蟲媒傳染病，對(duì)我國(guó)養(yǎng)牛業(yè)和養(yǎng)羊業(yè)危害較大，一旦暴發(fā)流行將會(huì)給畜牧業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[3]。

目前，已有很多AKAV診斷方法的研究報(bào)道，如病原學(xué)檢查的電鏡法[4]；抗體篩查的微量血清中和試驗(yàn)方法[5]、ELISA方法[6，7]、膠體金免疫層析試紙條[8]；核酸檢測(cè)的RT-PCR方法[9]、套式RT-PCR方法[10]、SYBR Green I 實(shí)時(shí)熒光 PCR 方法[11]、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)檢測(cè)方法[12]。這些方法為AKAV的檢測(cè)搭建了重要平臺(tái)，但隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，核酸檢測(cè)方法必將成為病毒檢測(cè)的一個(gè)重要發(fā)展方向，而實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)以其快速、敏感、高通量等優(yōu)勢(shì)已大量應(yīng)用于疫病的檢測(cè)中。已有報(bào)道以色列針對(duì)辛波血清群S片段建立了可以檢測(cè)AKAV的real-time RT-PCR方法，但沒有針對(duì)云南省流行的地方毒株的檢測(cè)方法。本研究的目的是建立AKAV的 qRT-PCR 檢測(cè)方法，為AKAV的檢測(cè)提供新的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及毒株信息

病毒RNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司、One Step PrimeScriptTM RT-PCR Kit(Perfect Real Time)購(gòu)自TaKaRa公司。AKAV毒株分離自師宗縣庫(kù)蠓，編號(hào)55，經(jīng)全基因序列測(cè)定和病毒中和試驗(yàn)鑒定，毒株保存于本實(shí)驗(yàn)室-80 ℃液氮冰箱。藍(lán)舌病病毒(Bluetongue virus，BTV)、辛德畢斯病毒(Sindbis virus，SINV)、Cat Que 病毒(Cat Que virus，CQV)、皮通病毒(Peaton virus，PEAV)由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 引物、探針的設(shè)計(jì)與合成

對(duì)云南省流行AKAV毒株的S片段序列進(jìn)行分析，設(shè)計(jì)引物和探針，探針其5′端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)，3′端標(biāo)記非熒光淬滅基團(tuán)。所設(shè)計(jì)的引物和探針既要保證特異性和高效性，又要避免與其他辛波血清群病毒的交叉反應(yīng)。引物和探針由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

AKAV-S-F：GCAGGGTATGTGGCATTTATC

AKAV-S-R：AGATCGACACTTGGTTGTGGC

AKAV-S-P：5′FAM-TTCCTCAACCAGAAGAAGGCCAAGAT-TAMRA3′

1.3 病毒標(biāo)準(zhǔn)品的制備

取編號(hào)為55的AKAV毒株在金黃地鼠腎細(xì)胞(Baby hamster kidney cell，BHK-21)上復(fù)壯，待80%細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變(Cytopathic effect，CPE)時(shí)收毒，將細(xì)胞-80 ℃凍融2次，3 000 r/min離心20 min，上清液每管0.5 mL分裝，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

取一管病毒液冰上化凍后在96孔板上作10-1～10-8稀釋，每個(gè)稀釋度作8孔，每孔病毒懸液為100 μL，加入BHK-21細(xì)胞懸液100 μL(1×106個(gè)細(xì)胞/mL)，每塊板設(shè)8孔細(xì)胞對(duì)照。置37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，從72～168 h逐日觀察記錄CPE。用Karber方法計(jì)算細(xì)胞半數(shù)感染量(TCID50)。用細(xì)胞生長(zhǎng)液稀釋成100 TCID50/50 μL的病毒工作液作為病毒標(biāo)準(zhǔn)品。

1.4 反應(yīng)條件的優(yōu)化

提取病毒標(biāo)準(zhǔn)品的RNA，使用本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的引物和探針進(jìn)行擴(kuò)增，確定最佳退火溫度。擴(kuò)增體系：2×One Step RT-PCR Buffer Ⅲ 10 μL，TaKaRa Ex Taq HS 0.4 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ 0.4 μL，Rox Reference Dye Ⅱ 0.4 μL，Rnase-free ddH2O 0.4 μL，引物和探針各0.4 μL，加入RNA 2 μL，共20 μL。擴(kuò)增程序：42 ℃反轉(zhuǎn)錄5 min，95 ℃預(yù)變性10 s，95 ℃變性5 s、退火(56 ℃、58 ℃、60 ℃、62 ℃)34 s，45個(gè)循環(huán)。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將病毒標(biāo)準(zhǔn)品做10 倍梯度稀釋，稀釋濃度為100～10-7，共8個(gè)稀釋度，用病毒RNA提取試劑盒分別提取RNA，用優(yōu)化的qRT-PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，通過收集的熒光曲線判定Ct值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得回歸方程。

1.6 靈敏度與特異性試驗(yàn)

靈敏度試驗(yàn)：提取稀釋濃度為100～10-10的病毒標(biāo)準(zhǔn)品RNA，共11個(gè)稀釋度，采用優(yōu)化后的擴(kuò)增程序進(jìn)行擴(kuò)增，確定AKAV qRT-PCR 檢測(cè)方法可以檢測(cè)到的病毒標(biāo)準(zhǔn)品最低稀釋度，驗(yàn)證其靈敏度。

特異性試驗(yàn)：選擇布尼亞病毒屬辛波血清群的CQV和PEAV、甲病毒屬的SINV、呼腸孤病毒科環(huán)狀病毒屬的BTV，提取這些病毒的RNA，同樣的方法提取病毒標(biāo)準(zhǔn)品RNA，同時(shí)進(jìn)行AKAV qRT-PCR檢測(cè)，檢驗(yàn)其特異性。

1.7 不同分離毒株及田間樣本檢測(cè)

應(yīng)用建立的AKAV qRT-PCR方法檢測(cè)2013年、2014年從師宗縣采集的庫(kù)蠓、黃牛血液、山羊血液中分離到的5株AKAV；檢測(cè)2014年師宗縣采集的黃牛血液樣品280份和山羊血液樣品140份。

2 結(jié)果

2.1 病毒標(biāo)準(zhǔn)品

編號(hào)55的AKAV樣品的TCID50效價(jià)為10-4.25，將分裝的病毒液做177.83倍稀釋后，得到含量為100 TCID50/50 μL的病毒標(biāo)準(zhǔn)品。

2.2 退火溫度的優(yōu)化

將AKAV qRT-PCR退火溫度分別設(shè)置為56 ℃、58 ℃、60 ℃、62 ℃，在60 ℃退火時(shí)，擴(kuò)增曲線最好，擴(kuò)增Ct值最低，因此，確定AKAV qRT-PCR檢測(cè)方法最佳退火溫度為60℃。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別提取稀釋濃度為100～10-7的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照病毒液RNA，共8個(gè)稀釋度，編號(hào)1-8，進(jìn)行AKAV qRT-PCR檢測(cè)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。以稀釋度編號(hào)為x軸，以Ct 值為y軸進(jìn)行回歸曲線的繪制，得到AKAV qRT-PCR檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。相關(guān)系數(shù)(R2)為0.9976，回歸方程為y=3.6488x+7.5179(圖1)。說明所建立的AKAV qRT-PCR檢測(cè)方法具有良好的線性關(guān)系。

圖1 AKAV qRT-PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 靈敏度與特異性

AKAV qRT-PCR方法能檢測(cè)到10-8倍稀釋的病毒標(biāo)準(zhǔn)品，表明該方法具有良好的檢測(cè)靈敏度(圖2)。以CQV、PEAV、SINV、BTV的病毒RNA為模板，和AKAV標(biāo)準(zhǔn)品RNA同時(shí)進(jìn)行AKAV qRT-PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示對(duì)CQV、PEAV、SINV、BTV的核酸檢測(cè)結(jié)果均為陰性，表明該方法具有一定的特異性(圖3)。

注：從左至右依次代表稀釋濃度為100-10-8的病毒標(biāo)準(zhǔn)品曲線，1-45代表循環(huán)數(shù)。

注：1-45代表循環(huán)數(shù)。

2.5 分離毒株與田間樣本的檢測(cè)結(jié)果

對(duì)云南省師宗縣不同來源分離到的5株AKAV毒株進(jìn)行qRT-PCR 的檢測(cè)結(jié)果顯示，建立的AKAV qRT-PCR 檢測(cè)方法對(duì)細(xì)胞分離毒株檢測(cè)的Ct 值在11.40～13.49(表1)。通過對(duì)2014年師宗縣采集的420份肝素抗凝血進(jìn)行AKAV qRT-PCR檢測(cè)，僅有5月20日的5號(hào)黃牛編號(hào)為09312的血樣為AKAV核酸陽(yáng)性，Ct值為30(圖4)，且編號(hào)為09312的血樣與病毒分離結(jié)果一致。

表1 AKAV分離毒株的信息及病毒核酸qRT-PCR 檢測(cè)結(jié)果

注：P.陽(yáng)性對(duì)照；N.陰性對(duì)照；1-45.循環(huán)數(shù)。

3 討論

阿卡斑在我國(guó)被列為二類傳染病，也是從國(guó)外進(jìn)口牛、羊必檢的七種疫病之一。我國(guó)阿卡斑流行病學(xué)調(diào)查和病毒分離證實(shí)，AKAV在我國(guó)廣泛存在且流行嚴(yán)重。據(jù)報(bào)道，2013—2016年AKAV引起廣西30%的竹鼠發(fā)病，死亡率高達(dá)100%[13]，2018年AKAV引起上海市某奶牛場(chǎng)20頭母牛發(fā)生流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎[14]，越來越多的AKAV分離和流行病例報(bào)道讓我們不能忽視AKAV。建立云南省流行AKAV毒株的快速檢測(cè)技術(shù)，對(duì)云南省AKAV的疫病診斷及防控具有重要意義。

目前建立的AKAV核酸檢測(cè)技術(shù)大多都要經(jīng)核酸的提取與純化、PCR 反應(yīng)或套式PCR反應(yīng)、電泳、酶切、測(cè)序等才能得到檢測(cè)結(jié)果，人為操作步驟多，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，易污染和產(chǎn)生誤差。因此，本研究選擇云南省流行AKAV毒株S片段設(shè)計(jì)引物和探針，建立了AKAV qRT-PCR檢測(cè)方法。本方法通過對(duì)反應(yīng)條件的優(yōu)化，使擴(kuò)增曲線達(dá)到最優(yōu)；為保證試驗(yàn)更準(zhǔn)確合理，本研究對(duì)所用云南省地方AKAV毒株進(jìn)行毒價(jià)測(cè)定，制備病毒標(biāo)準(zhǔn)品，保證每次試驗(yàn)使用的病毒含量一致，讓測(cè)定結(jié)果更準(zhǔn)確合理，從而達(dá)到了在分子拷貝水平上的定量；通過梯度稀釋病毒標(biāo)準(zhǔn)品，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性關(guān)系較好；試驗(yàn)結(jié)果顯示，本研究建立的qRT-PCR 方法最低可檢測(cè)到10-8倍稀釋的病毒標(biāo)準(zhǔn)品，且同屬病毒以及其他蟲媒病毒核酸均無(wú)擴(kuò)增信號(hào)產(chǎn)生，具有良好的靈敏度和特異性。對(duì)分離毒株和田間血液樣品的檢測(cè)結(jié)果顯示，本方法不僅能檢測(cè)病毒核酸含量高的AKAV分離毒株，也能檢測(cè)病毒核酸含量較低的血液樣本，本方法既是檢測(cè)病毒早期感染的手段，也是病毒分離的指路燈。

綜上，本實(shí)驗(yàn)室建立AKAV qRT-PCR方法是一種快速準(zhǔn)確、靈敏度高、特異性好的高通量檢測(cè)方法。此方法對(duì)云南省阿卡斑病的早期診斷、批量檢測(cè)、毒株分離有著重要意義，為云南省口岸檢疫提供了一種有效的檢測(cè)手段。