基于網(wǎng)絡藥理學與分子對接探討黃芪桂枝五物湯治療大動脈炎的作用機制

汪佳麗 徐少華 付 琦 劉 濤

廣西中醫(yī)藥大學附屬國際壯醫(yī)醫(yī)院心胸血管外科，廣西南寧 530201

大動脈炎（takayasu arteritis，TA）是一種慢性肉芽腫性血管炎，主要累及主動脈及其主要分支，如頸動脈、椎動脈、頭臂動脈、鎖骨下動脈等動脈[1]，主要癥狀包括關節(jié)和肌肉疼痛、全身不適、發(fā)燒、盜汗。約10%患者表現(xiàn)為血管炎癥狀，如胸背部、頸部疼痛、腹痛等[2]。其治療方法包括藥物和手術治療，藥物治療分為誘導緩解期和維持期，治療藥物主要包括糖皮質激素（glucocorticoid，GC）以及非GC類免疫抑制劑。在誘導緩解期，主要的治療方法是將GC與免疫抑制劑聯(lián)合使用；在維持期，將GC逐漸減量維持，但未詳細說明具體劑量[3]。

中醫(yī)將TA歸于“血痹”“瘀證”“無脈癥”等范圍，黃芪桂枝五物湯出于《金匱要略》，為東漢醫(yī)家張仲景所著[4]；《金匱要略·血痹虛勞病脈證并治第六》篇述：“血痹陰陽俱微，寸口關上微，尺中小緊，外證身體不仁，如風痹狀，黃芪桂枝五物湯主之?！逼洳C為氣血虛弱，腠理不固，外受風寒，陽氣受阻，血行不暢[5]。臨床研究表明，黃芪桂枝五物湯對于緩解TA的相關癥狀具備獨特效用[6]，但其作用機制暫不明確。本研究探討了黃芪桂枝五物湯治療TA的作用機制，為黃芪桂枝五物湯的應用提供了參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 方劑靶點 用TCMSP數(shù)據(jù)庫對黃芪桂枝五物湯中組成進行檢索，以口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、藥物相似性（drug likeness，DL）≥0.18為條件，獲得活性成分預測其靶點，再利于UniProt數(shù)據(jù)庫，獲得黃芪桂枝五物湯藥物基因集。

1.1.2 TA疾病靶點 利用GeneCards數(shù)據(jù)庫搜索TA疾病相關靶點，得到疾病相關基因集。

1.2 方法

1.2.1 “藥物-成分-靶點”可視化網(wǎng)絡 將1.1.1和1.1.2中數(shù)據(jù)導入CytoScape軟件，通過“藥物-成分-靶點”可視化展示。

1.2.2 蛋白相互作用網(wǎng)絡 STRING數(shù)據(jù)庫由交集基因導入，得到蛋白質-蛋白質相互作用（proteinprotein interaction，PPI）網(wǎng)絡并利用CytoScape軟件可視化展示。

1.2.3 基因本體（gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析 將交集基因導入DAVID數(shù)據(jù)庫行GO與KEGG富集分析，選取前20個條目使用微生信氣泡圖展示。

1.2.4 分子對接 以度中心性（degree centrality，DC）值排列，選取排名前4的活性成分和基因行分子對接，計算結合能；運用AutoDockTools將兩者對接，利用PyMol軟件對結果可視化。

2 結果

2.1 活性成分

黃芪桂枝五物湯共76個活性化學成分，部分見表1。

表1 黃芪桂枝五物湯活性藥物成分

2.2 交集基因

UniProt數(shù)據(jù)庫由464個黃芪桂枝五物湯藥效靶點導入，得到160個預測靶點對應基因，GeneCards數(shù)據(jù)庫搜索TA共726個靶點基因，運用Venny取交集基因，得到44個黃芪桂枝五物湯治療TA的預測靶點，見圖1。

圖1 黃芪桂枝五物湯治療TA預測靶點圖

2.3 藥物-成分-靶點網(wǎng)絡

利用CytoScape軟件構建“藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡可視化，見圖2。根據(jù)DC值排序，排列較前為quercetin、kaempferol、beta-sitosterol等，數(shù)值各為208、69、59。證明上述為黃芪桂枝五物湯治療TA的主要活性成分，發(fā)揮著重要作用。

2.4 PPI網(wǎng)絡

將交集基因導入STRING數(shù)據(jù)庫構建PPI網(wǎng)絡圖，見圖3。將STRING數(shù)據(jù)庫得到的文件導入CytoScape軟件，篩選核心蛋白，見圖4。白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、白蛋白（albumin，ALB）、血管內皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）等為篩選出的核心蛋白，在整個網(wǎng)絡中起著關鍵作用。

圖3 PPI網(wǎng)絡

圖4 PPI可視化

2.5 GO與KEGG富集分析

使用DAVID數(shù)據(jù)庫對交集基因行富集分析，GO富集分析得到GO條目共402個，其中340個生物過程（biological process，BP）；28個細胞組分（cellular component，CC）；34個分子功能（molecular function，MF）。KEGG通路富集得出105條通路。利用P值排序，選取前20個條目運用微生信工具以氣泡圖可視化，見圖5。結果顯示，黃芪桂枝五物湯對TA的治療主要涉及白介素-17（interleukin-17，IL-17）信號通路、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）信號通路、核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）信號通路等，可能通過對炎癥反應、細胞凋亡過程的負調節(jié)、脂多糖的反應等發(fā)揮治療作用。

圖5 GO、KEGG富集分析圖

2.6 分子對接

選取排名前四的關鍵活性成分和靶點進行分子對接，見表2。表中關鍵活性成分和關鍵靶點中結合能≤-5 kJ/mol占比93.8%，預測該活性成分與靶點具有較好的結合活性，證明黃芪桂枝五物湯關鍵活性成分可對關鍵靶點的調控發(fā)揮作用。見圖6。

圖6 關鍵活性成分與關鍵靶點對接可視化

表2 關鍵活性成分與關鍵靶點對接的結合能

3 討論

網(wǎng)絡藥理學作為一門新興學科，是藥理學、分子生物學、醫(yī)學、生物信息學以及統(tǒng)計學綜合運用的結果[7]。網(wǎng)絡藥理學是一種新方法，通過了解中藥配伍多成分、多通路和治療多靶點[8]，能夠證明中藥對疾病的治療作用。網(wǎng)絡藥理學的發(fā)展始終與中醫(yī)藥研究息息相關[9]，并為中醫(yī)藥發(fā)展帶來新生機。

目前臨床對于TA的治療，主要以GC以及非GC類免疫抑制劑等藥物及手術治療為主，但其存在耐藥及其他副作用，而新興的靶向治療仍缺乏足夠的證據(jù)支持[10]。不同的是，中醫(yī)講究整體和辨證施治，在治療TA上展現(xiàn)了獨特的優(yōu)勢，如龐鶴教授[11]應用黃芪桂枝五物湯治療周圍血管疾病。

本研究表明槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、毛蕊異黃酮可能是黃芪桂枝五物湯治療TA的關鍵活性成分。槲皮素治療炎癥性疾病機制是通過抑制炎癥因子的生成和細胞基質的降解，其抗炎作用是通過調控相關炎癥信號等通路[12]。山奈酚是一種黃酮醇，被證實屬天然抗炎化合物之一，在關節(jié)炎、癌癥、心血管疾病和其他疾病的發(fā)病過程中都發(fā)揮著重要作用，并與降低炎癥相關疾病的風險密切相關[13]。β-谷甾醇可以通過降低血管內皮細胞表面的血管細胞黏附分子-1、細胞間黏附分子-1以及E-選擇素的表達水平，阻止炎性中性粒細胞的移行、浸潤從而減輕細胞炎性反應[14]。毛蕊異黃酮為一種異黃酮植物雌激素，是從中藥黃芪中提取的有效活性成分之一[15]。毛蕊異黃酮有促進血管新生、抗氧化等作用，通過轉錄學和實時定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）法，發(fā)現(xiàn)毛蕊異黃酮通過VEGF和FGF信號通路實現(xiàn)其中Src，Raf，絲裂原活化蛋白激酶激酶1/2（protein kinase 1/2，MEK1/2）和磷脂酰肌醇3酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）起著不可代替的作用[16]。

IL-6調節(jié)多種細胞的生長和分化，調節(jié)免疫反應、急性期和造血，并通過機體對感染的免疫反應發(fā)揮重要作用；TNF具有抗感染、促進機體免疫功能調節(jié)等重要作用；VEGFA的體外活性是促進動脈、靜脈和淋巴管內皮細胞的生長。

KEGG通路富集結果主要有IL-17信號通路、TNF信號通路、NF-κB信號通路等，涉及脂多糖的反應、炎癥反應、細胞凋亡過程的負調節(jié)等功能發(fā)揮治療作用。NF-κB在細胞的炎癥反應、免疫應答等過程中起著關鍵作用；IL-17是T細胞誘導的炎癥反應的早期觸發(fā)因子，并通過促進促炎細胞因子的釋放來增強炎癥反應；IL-17結合受體后，可通過MAP激酶途徑和NF-κB發(fā)揮生物效應。所以黃芪桂枝五物湯治療TA的機制可能是通過減輕血管炎癥，疏通血管，恢復血流速度，也就是“溫經益氣，和血通痹”的作用，充分闡明了中醫(yī)理論中“通則不痛”。

分子對接結果顯示結合能≤-5 kJ/mol占93.8%，證實了山奈酚、β-谷甾醇、槲皮素、毛蕊異黃酮在治療TA中的重要作用。

綜上所述，本研究借助網(wǎng)絡藥理學及分子對接技術，闡述了黃芪桂枝五物湯對TA的治療是通過槲皮素 、山奈酚、β-谷甾醇、毛蕊異黃酮等成分作用于IL-6、TNF、ALB、VEGFA等基因靶點，從而影響“IL-17信號通路、TNF信號通路、NF-κB信號通路”等通路發(fā)揮作用，為進一步研究中藥治療TA提供參考。但此課題只對其作用機制進行了初步驗證，由于數(shù)據(jù)庫收錄信息的不完整、相關數(shù)據(jù)更新滯后等因素影響，該研究存在一定的局限性，故開展實驗驗證應是下一步研究的重點。