冬凌草PAL基因的克隆及表達(dá)分析

黃進(jìn)勇， 張濟(jì)萌， 郭瀚師， 王 璐， 岳彩鵬， 張靖楠

(1. 鄭州大學(xué) 農(nóng)學(xué)院 河南 鄭州 450001； 2. 鄭州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 河南 鄭州 450001)

0 引言

冬凌草(Isodonrubescens)隸屬唇形科香茶菜屬,主產(chǎn)于河南濟(jì)源太行山一帶，有消炎、抑菌、抗腫瘤等多種藥用價(jià)值[1-3]。迷迭香酸是冬凌草中天然酚酸類次生代謝物[4-5]，有抑菌、抗氧化等多種生物活性[6]，在醫(yī)學(xué)方面有較高的利用價(jià)值[7]。

迷迭香酸主要通過兩條前體分別為苯丙氨酸和酪氨酸[8]的平行分支途徑進(jìn)行生物合成[9]，在以酪氨酸為起始物的途徑中，酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(tyrosine aminotransferase，TAT)是合成RA分子結(jié)構(gòu)上4-羥基苯乳酸部分的限速酶。在苯丙烷代謝支路上，以苯丙氨酸為起始物，苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase, PAL)是合成RA分子結(jié)構(gòu)上咖啡?；年P(guān)鍵酶。支路的終產(chǎn)物4-香豆酰輔酶A在迷迭香酸合成酶催化下，合成4-香豆酰-4′-羥基苯乳酸，最后，在細(xì)胞色素P450單加氧酶的CYP98亞家族羥化酶的作用下生成迷迭香酸。

迄今，PAL基因在荸薺[10]、柱花草[11]、玉米[12]、木薯[13]、枸杞[14]、陸地棉[15]中相繼被克隆，生物學(xué)功能被進(jìn)一步分析，基于其他植物關(guān)于迷迭香酸的生物合成途徑也有了基本的認(rèn)知，但冬凌草中該化合物的生物合成途徑及其關(guān)鍵酶的功能和調(diào)控機(jī)制仍未見報(bào)道。為了深入了解冬凌草中迷迭香酸的生物合成途徑及調(diào)控機(jī)理，本實(shí)驗(yàn)從冬凌草葉片中克隆得到PAL基因，并采用生物信息學(xué)的方法預(yù)測和分析該酶的基因、相應(yīng)氨基酸序列的理化性質(zhì)、系統(tǒng)演化關(guān)系等，最后采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)，分析了IrPAL在冬凌草不同組織中的表達(dá)變化情況，為進(jìn)一步對冬凌草的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

冬凌草種子由鄭州大學(xué)濟(jì)源研究院提供，在實(shí)驗(yàn)室繼代培養(yǎng)，獲得冬凌草無菌苗。取樣時(shí)摘取植株根、莖、葉于液氮速凍后凍存于-80 ℃冰箱備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

RNA提取試劑盒購自貝貝生物科技有限公司,cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaRaKa公司,凝膠回收試劑盒購自O(shè)MEGA公司。Prime STAR Max Premix(2×)酶及SYBR Green PCR Master Mix酶購自TaRaKa公司。設(shè)計(jì)的引物由生工生物工程有限公司合成。

1.3 冬凌草總RNA的提取與cDNA的合成

取冬凌草無菌苗組織加液氮研磨,根據(jù)RNA提取試劑盒說明書提取冬凌草總RNA,用超微量核酸蛋白分析儀檢測其濃度及純度，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其RNA條帶,采用TaRaKa反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成冬凌草cDNA。

1.4 冬凌草PAL基因的全長克隆

從GenBank上獲得已錄入的PAL基因全長cDNA序列,從開放閱讀框(ORF)兩端非編碼區(qū)設(shè)計(jì)一對特異性引物,PAL-F:5′-CGGTCCATTTGCGCTACTCC-3′；PAL-R:5′-GCTATACGGTGTAATTCGCG-3′。以冬凌草cDNA為模板，以PAL-F、PAL-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增條件:95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s,54 ℃復(fù)性30 s,72 ℃延伸1 min,總共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物,所得目的片段按照OMEGA試劑盒的說明書進(jìn)行切膠回收。將回收產(chǎn)物送到測序公司進(jìn)行測序。

1.5 冬凌草PAL基因的生物信息學(xué)分析

使用在線分析工具Blast對序列進(jìn)行同源性分析；使用NCBI的ORF finder查找PAL基因的開放閱讀框,得到編碼的氨基酸序列；利用ProtParam對PAL蛋白質(zhì)序列的氨基酸組成、等電點(diǎn)及親疏水性等進(jìn)行分析；利用Tmhmm 2.0檢測PAL蛋白質(zhì)是否編碼跨膜蛋白區(qū)；應(yīng)用SignalP4.1在線分析PAL蛋白是否具備信號肽序列；利用ExPaSy中的psipred分析蛋白序列的二級結(jié)構(gòu)；使用SWISS-MODEL對PAL蛋白進(jìn)行三級結(jié)構(gòu)建模；使用DNAMAN6.0軟件進(jìn)行同源性分析；利用MEGA6.0軟件構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.6 冬凌草PAL基因的組織特異性表達(dá)分析

以冬凌草的根、莖、葉的cDNA為模板，以β-actin為內(nèi)參，進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，檢測PAL基因在不同組織中的表達(dá)情況。內(nèi)參引物β-actin-F：TGGTGTCAGGTTGGGATGG；β-actin-R：CGTGAGAAGAACAGGGTGCT。目標(biāo)基因引物PAL-F：CGGTCCATTTGCGCTACTCC；PAL-R：CGGTCCATTTGCGCTACTCC。10 μL反應(yīng)體系：RNase Free dH2O 3 μL；正反向引物均為0.5 μL；SYBR Green PCR Master Mix 5 μL；最后加入cDNA模板1 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s；56 ℃ 20 s；40個循環(huán)。

2 結(jié)果與分析

2.1 冬凌草總RNA的檢測

使用超微量核酸蛋白分析儀檢測冬凌草無菌苗總RNA的A 260/A 280值為2.02，且峰形完整明顯。如圖1所示，經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測可以看出,總RNA的純度較高,可以清晰地看到rRNA的3條條帶(28SrRNA,18SrRNA,5SrRNA),說明所提RNA完整性較好,可以用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)操作。

圖1 冬凌草RNA凝膠電泳檢測Figure 1 Detection of Isodon rubescens by RNA gel electrophoresis

2.2 冬凌草PAL基因的檢測

如圖2所示，以冬凌草cDNA為模板，根據(jù)所設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后,將回收產(chǎn)物送至生工生物工程公司進(jìn)行測序，測得特異性條帶長度為1 116 bp。通過 BLAST 程序檢索,該序列與丹參、黃芩的同源性較高,分別為82%、83%,與枸杞,番茄的同源性分別達(dá)到79%、77%。

圖2 冬凌草PAL基因序列擴(kuò)增產(chǎn)物Figure 2 Amplification products of PAL of Isodon rubescens

2.3 冬凌草PAL基因的生物信息分析

經(jīng)過ORF Finder 檢測,該序列含有一個大小為522 bp的完整的開放閱讀框,編碼為173個氨基酸,開放閱讀框位于337～858 bp 區(qū)域,序列內(nèi)含有非編碼區(qū)。利用Expasy 在線工具對序列進(jìn)行理化性質(zhì)分析,分子的原子組成為 C1107、H1804、N324、O340、S11,總原子數(shù)為3 586,相對分子質(zhì)量為25.45 kD,理論等電點(diǎn)為9.01,帶負(fù)電的氨基酸(Asp+Glu)有20個,帶正電的氨基酸(Arg+Lys)有25個,不穩(wěn)定系數(shù)是43.26,推測其為非穩(wěn)定蛋白,平均親水性為-0.240。

利用ProtScale計(jì)算PAL蛋白質(zhì)的各種氨基酸的親疏水性,從整體上來看,親水性氨基酸比疏水性氨基酸多，因此可判定為親水性蛋白。利用Tmhmm 2.0檢測PAL蛋白質(zhì)是否編碼蛋白跨膜區(qū),結(jié)果并沒有發(fā)現(xiàn)跨膜結(jié)構(gòu)。利用SignalP 4.1檢測PAL蛋白質(zhì)是否編碼信號肽序列，結(jié)果顯示其不具備信號肽序列。因此該蛋白不具備膜蛋白和分泌蛋白的特征,很可能是一種游離蛋白。利用NetPhos 3.1磷酸化位點(diǎn)分析工具進(jìn)行分析,結(jié)果顯示整個多肽鏈存在25個氨基酸磷酸化位點(diǎn),其中絲氨酸23個、蘇氨酸12個、酪氨酸4個。

圖3 PAL蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Figure 3 Prediction of PAL tertiary structure

利用ExPaSy的psipred程序預(yù)測蛋白序列二級結(jié)構(gòu),結(jié)果顯示該蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要由19段α-螺旋組成,沒有β-折疊結(jié)構(gòu)。如圖3所示，運(yùn)用SWISS-MODEL工具對PAL編碼蛋白進(jìn)行三級結(jié)構(gòu)建模。根據(jù)同源建模的相關(guān)原理,在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中選擇與PAL蛋白序列一致性最高的蛋白為模板進(jìn)行同源模建,得到PAL蛋白結(jié)構(gòu)模型。與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測相符，含有大量α-螺旋和不規(guī)則卷曲。

選取與冬凌草同源性較高的羅勒、紫蘇、丹參、黃芩、番茄、枸杞，利用DNAMAN軟件分析PAL蛋白序列的同源性。如圖4所示，可見在冬凌草PAL蛋白氨基酸的56～64位點(diǎn)，與其他序列一樣含天冬氨酸聚集區(qū)，說明具有相關(guān)結(jié)構(gòu)域特征。

圖4 冬凌草PAL蛋白的同源性分析Figure 4 Homology analysis of PAL from Isodon rubescens

選取相似性較高的11種植物PAL蛋白同源序列,運(yùn)用 Mega 6.0軟件,進(jìn)行多重序列比對,構(gòu)建植物PAL基因的分子進(jìn)化樹。結(jié)果顯示, 冬凌草與唇形科植物羅勒、紫蘇、黃芩、丹參、藿香歸于一個分支，其中與羅勒、紫蘇親緣關(guān)系較近。其他雙子葉植物相思樹、枸杞、番茄、板藍(lán)根聚為一個分支。油棕與柳葉桉聚為另一大分支?？梢钥闯龆璨軵AL蛋白序列與雙子葉唇形科植物之間親緣關(guān)系更近，與單子葉植物的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.4 冬凌草PAL基因的組織特異性表達(dá)分析

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法，檢測PAL基因在冬凌草不同組織中的表達(dá)情況。PAL基因在冬凌草根中的表達(dá)量最低，葉中表達(dá)量最高，葉的表達(dá)量是莖的表達(dá)量的1.24倍，是根的表達(dá)量的2.00倍。

3 討論與結(jié)論

目前對PAL基因家族功能的多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，該基因家族具有物種多樣性，在不同物種不同條件下，參與多種生物代謝。PAL蛋白參與植物次生代謝，除了在唇形科植物丹參中參與迷迭香酸代謝外，還有在咖啡中參與綠原酸代謝積累[16]，在黃芩中參與脅迫誘導(dǎo)黃酮類化合物的合成[17]，通過次生代謝揭示鮮切荸薺黃化機(jī)理[10]、在石榴中參與花青苷合成而導(dǎo)致果實(shí)呈色與褐變[18]。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)PAL基因響應(yīng)植物的逆境脅迫，如在柱花草中響應(yīng)生物脅迫(炭疽菌侵染)與非生物脅迫(干旱和鹽脅迫)[11]、在木薯中響應(yīng)低溫脅迫[13]、玉米抗病[12]機(jī)理、陸地棉抗病[15]與枸杞對抗干旱和鹽逆境[14]的分子機(jī)理。