森登-4微生物限度檢查方法適用性試驗

劉楊 劉建明 李甜

摘要：目的，建立蒙藥制劑森登一4的微生物限度檢驗方法。方法：按《中國藥典》2015年版四部非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查法：控制菌檢查法進行適用性試驗。結(jié)果：供試品5種試驗菌回收比在0.5～2之間，控制菌均能正常檢出。

關(guān)鍵詞：森登-4;微生物限度;適用性試驗

本文參考相關(guān)文獻，根據(jù)制劑中成分的抑菌作用強度不同，采用了平皿法（稀釋法）建立森登-4相應(yīng)的微生物限度檢查方法，經(jīng)方法適用性試驗證實該方法簡易有效。

一、實驗材料

1.樣品名稱

森登-4，批號：20180228、20181101、20190412具由新疆維吾爾自治區(qū)博爾塔拉蒙古自治州蒙醫(yī)醫(yī)院生產(chǎn)。

2.儀器SPX-150生化培養(yǎng)箱（江蘇揚州慧科電子有限公司）;GHP-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱（江蘇揚州慧科電子有限公司）;BHC-1300 Ⅱ A2生物安全柜（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）DHG-9245A電熱鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）PL602-L型電子天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）;GI54TW全自動高壓滅菌鍋（致微（廈門）儀器有限公司）;JLQ-S1菌落計數(shù)器（無錫縣金城儀器廠）;BHW-IV型電熱恒溫水浴鍋（北京市醫(yī)療設(shè)備廠）;JFC勻漿儀（漯河市金田試驗設(shè)備研究所）。

3.培養(yǎng)基及稀釋液

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（批號1704142）、胰酪大峨胨液體培養(yǎng)基（批號1703082）、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（批號150824）、腸道菌增菌液體培養(yǎng)基（批號170216）、紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（批號150818）、麥康凱液體培養(yǎng)基（批號161228）、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（批號150907）、pH7.0氯化鈉-蛋白胨水（批號20190129）

4.菌種

枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]、金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、銅綠假單胞菌[CMCC（B）10104]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉菌[CMCC（F）98003]、以上培養(yǎng)基和菌種均由中國食品藥品檢定研究院提供工作菌株為第3代。

二、菌液及供試液制備

1.菌液制備

取經(jīng)35℃培養(yǎng)18-24小時的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽抱桿菌胰酪大豆胨液體培養(yǎng)物，用0.9%無菌氯化鈉溶液制成含菌數(shù)不大于10000cfu/ml的菌懸液;取經(jīng)35℃培養(yǎng)18-24小時的大腸艾希氏菌、銅綠假單胞菌胰酪大豆胨液體培養(yǎng)物，用0.9%無菌氯化鈉溶液制成含菌數(shù)不大于100cfu/ml的菌懸液;取經(jīng)25℃培養(yǎng)2-3天的白色念珠菌沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)物，用0.9%無菌氯化鈉溶液制成含菌數(shù)不大于10000cfu/ml的菌懸液;取經(jīng)25℃培養(yǎng)5-7天黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物加入3～5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將抱子洗脫，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成含菌數(shù)不大于10000cfu/ml的孢子懸液。

2.供試液制備

取樣品10g，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，混勻，制成1：10的供試液;取1：10的供試液10ml，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至50ml，制成1：50的供試液。

三、需氧菌總數(shù)和霉菌及酵母菌總數(shù)計數(shù)檢查方法適用性

供試液分別加入上述5種代表性實驗菌株，再加15-20ml規(guī)定的瓊脂培養(yǎng)基待凝固后，置規(guī)定溫度培養(yǎng)24-72小時，觀察結(jié)果，平板計數(shù)，測定回收比值。

測定結(jié)果顯示：該供試品用1：10的供試品按平皿法對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌有明顯抑制作用，回收比值小于0.5，采用1：50的供試品按平皿法對規(guī)定的菌株無明顯抑制作用，回收比值在0.5～2之間，該供試品需氧菌總數(shù)計數(shù)可采用1：50供試液按平皿法測定，霉菌及酵母菌總數(shù)計數(shù)可采用1：10供試液按平皿法測定。

四、控制菌檢查方法適用性

1.適用性試驗

大腸艾希氏菌取1：10的供試液10ml，加入大腸埃希菌菌液1ml，加入100ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，混勻，置35℃培養(yǎng)18小時，取上述培養(yǎng)物1ml接種至100ml麥康凱液體培養(yǎng)基中，42℃培養(yǎng)24小時。取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上35℃培養(yǎng)18小時，麥康凱瓊脂培養(yǎng)基應(yīng)能檢出大腸艾希氏菌反應(yīng)特征。

耐膽鹽革蘭陰性菌取樣品1：10供試液100ml，置25℃培養(yǎng)2小時，取上述培養(yǎng)物10ml，加大腸埃希菌菌液、銅綠假單胞菌菌液各1ml，搖勻，接種至100ml腸道菌增菌液體培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng)24小時后，分別劃線接種于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂平板上，35℃培養(yǎng)18小時，紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂平板上應(yīng)能檢出耐膽鹽革蘭陰性菌的反應(yīng)特征。

2.上述結(jié)果表明，本品的控制菌檢查方法為：大腸艾希氏菌，取樣品1：10供試液10ml接種至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基用量100ml;耐膽鹽革蘭陰性菌，取25℃培養(yǎng)2小時樣品1：10供試液10ml，接種至腸道菌增菌液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基用量100ml。

五、結(jié)論

按《中國藥典》2015年版四部微生物限度檢查法、控制菌檢查法進行三次獨立適用性試驗，5種試驗菌回收比在0.5～2之間，控制菌均能正常檢出。

參考文獻：

[1]中國藥典通則四部[M].北京：醫(yī)藥衛(wèi)生出版社.

[2]中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準蒙藥分冊[M].衛(wèi)生部藥典委員會.

[3]5種蒙藥醫(yī)院制劑微生物限度檢查方法建立及探討[J].食品安全質(zhì)量檢測學報.