鬼針草降血脂有效部位的篩選及其指紋圖譜的測(cè)定

范琦琦 張雪 高夢(mèng)迪

摘 ? ? ?要：研究了鬼針草不同提取部位對(duì)實(shí)驗(yàn)性高脂血癥小鼠的影響，結(jié)合指紋圖譜，優(yōu)選出鬼針草降血脂最佳提取部位。選用SPF級(jí)昆明小鼠140只，隨機(jī)選取20只作為基礎(chǔ)對(duì)照組，飼以普通飼料，其余小鼠飼以高脂飼料進(jìn)行造模，造模成功后，隨機(jī)分為6組：模型對(duì)照組、洛伐他汀對(duì)照組、鬼針草石油醚萃取物組、鬼針草氯仿萃取物組、鬼針草乙酸乙酯萃取物組和鬼針草正丁醇萃取物組， 分別給予對(duì)應(yīng)萃取部位藥物?；A(chǔ)對(duì)照組和模型對(duì)照組每日給予等體積的生理鹽水，連續(xù)30 d，檢測(cè)血清TC、TG、HDL-C及LDL-C含量，確定降血脂最佳有效部位。結(jié)果與模型對(duì)照組比較，乙酸乙酯萃取物組和正丁醇萃取物組TC和LDL-C顯著降低（P<0.01），HDL-C明顯提高（P<0.05）。鬼針草乙酸乙酯部位萃取物和正丁醇部位萃取物對(duì)降低TC和LDL-C水平、升高HDL-C水平有較好的作用，有效改善血脂水平。

關(guān) ?鍵 ?詞：鬼針草;萃取物;高脂血癥;TC;TG;HDL-C; LDL-C; HPLC

中圖分類號(hào)：R284.2 ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A ? ? ? 文章編號(hào)： 1671-0460（2020）02-0581-04

Abstract： To study the effect of different extracts of Bidens on experimental hyperlipidemic mice， combined fingerprint， the best extracted parts of Bidens to reduce blood lipid were optimized. 140 SPF Kunming mice were chosen， and then 20 mice among them were randomly selected as the base control group， which were fed with ordinary feed， and other mice were fed with high-fat feed to build the model. After building the model successfully， they were randomly divided into six groups：model control group，lovastatin control group，bidens petroleum ether extract group，bidens chloroform extract group，bidens ethyl acetate extract group and bidens n-butanol extract group，given corresponding extract of Bidens.The base control group and the model control group were given the same volume of normal saline every day for 30 days，and the contents of serum TC，TG，HDL-C and LDL-C were detected， then the most effective part to reduce blood lipid was determined. Compared with model control group，TC and LDL-C were significantly decreased while HDL-C was significantly increased in bidens ethyl acetate extract group and bidens n-butanol extract group.The ethyl acetate extract and the n-butanol extract have good effect on lowering the levels of TC and LDL-C ?and increasing the level of HDL-C，effectively improving blood lipid levels.

Key words： Bidens; Extracts; Hyperlipidemia; TC; TG; LDL-C; HDL-C; HPLC

近年來(lái)，高脂血癥的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。高脂血癥是由于多種內(nèi)外因素導(dǎo)致的人體內(nèi)脂肪代謝或轉(zhuǎn)運(yùn)異常的代謝性疾病，是引起心腦血管疾病的首要緣由[1]。目前治療高血脂的西藥主要是他汀類藥物，為有效控制高血脂癥患者的血脂指標(biāo)，降低心腦血管事件的發(fā)生率，研究和開(kāi)發(fā)中草藥作為降脂藥物成為治療高脂血癥的一個(gè)研究方向。尤其根據(jù)活性組分導(dǎo)向原則將中藥材制備成不同的提取部位，更有利于多靶點(diǎn)作用的實(shí)現(xiàn)，是中草藥作為治療高脂血癥藥物的優(yōu)點(diǎn)。

中藥鬼針草為鬼針草屬植物（Bidens）的干燥全草，為菊科一年生草本植物，味苦，性平，歸肝、肺、大腸經(jīng)，具有清熱解毒、散瘀消腫等功效[2]。鬼針草含有黃酮類、有機(jī)酸類、揮發(fā)油類、多炔類化合物等多種有效成分，具有抑菌抗炎、降血脂、降血壓、保肝護(hù)肝、抗腫瘤和抗結(jié)石等藥理作用[3]。目前，鬼針草的相關(guān)研究較為廣泛，但對(duì)于鬼針草有效成分調(diào)節(jié)血脂的報(bào)道相對(duì)較少。本實(shí)驗(yàn)采用小鼠高脂血癥模型，研究鬼針草不同部位萃取物對(duì)模型脂質(zhì)代謝的影響，確定鬼針草的最佳降脂部位。

1 ?實(shí)驗(yàn)部分

1.1 ?實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

購(gòu)于濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司的雄性SPF級(jí)昆明小鼠140只，體重（20±2）g。

1.2 ?高脂飼料

成分為普通飼料78.8%、豬油10%、蛋黃粉10%、膽固醇1%和膽鹽0.2%。

1.3 ?藥品及試劑盒

鬼針草采購(gòu)于濟(jì)南漱玉平民大藥房;洛伐他汀膠囊，揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號(hào)：18072261;總膽固醇（T-CHO）測(cè)試盒，南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20181128;甘油三酯（TG）測(cè)試盒，南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20181127;低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）測(cè)試盒，南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20181124;高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）測(cè)試盒，南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20181127。

1.4 ?儀器及設(shè)備

細(xì)胞成像多功能檢測(cè)系統(tǒng)（酶標(biāo)儀）：Bio Tek Cytation5;高效液相色譜儀：Agilent高效液相色譜儀。

2 ?測(cè)定血脂指標(biāo)與建立指紋圖譜

2.1 ?鬼針草萃取物的制備

精密稱取鬼針草藥材1.8 kg，用12倍量80%乙醇回流提取2 h，提取2次。鬼針草提取液經(jīng)減壓回收乙醇后，分別用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、水飽和的正丁醇萃取四次，各有機(jī)層合并減壓回收溶劑后分別得石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取部位，減壓干燥后得干燥粉末。

2.2 ?建模

SPF小鼠140只，以普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)分為基礎(chǔ)對(duì)照組20只和模型組120只。基礎(chǔ)對(duì)照組飼以普通飼料，模型組飼以高脂飼料，連續(xù)喂養(yǎng)3周后摘眼球取血，測(cè)得模型組血清TC、TG明顯升高，HDL-C明顯降低，則造模成功。

2.3 ?實(shí)驗(yàn)分組及給藥

造模成功后，將模型組中的高脂血癥小鼠隨機(jī)分為模型對(duì)照組、洛伐他汀組、石油醚萃取物組、二氯甲烷萃取物組、乙酸乙酯萃取物組和正丁醇萃取物組，除洛伐他汀組每日給予藥物洛伐他汀2 mg·kg-1外，其余組每日給予各萃取物5 g·kg-1（生藥）?；A(chǔ)對(duì)照組和模型對(duì)照組每日給予等體積生理鹽水，連續(xù)給藥30 d。

2.4 ?指標(biāo)測(cè)定

末次給藥后，禁食不禁水12 h，稱重并摘眼球取血后處死小鼠，采用氧化酶法測(cè)定血清TC、TG、LDL-C、HDL-C，結(jié)果見(jiàn)表4。

2.5 ?統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用 SPSS21.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用T檢驗(yàn)分析方法，認(rèn)為P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義結(jié)果。

2.6 ?建立指紋圖譜

2.6.1 ?指紋圖譜供試溶液的制備

精密稱取鬼針草正丁醇萃取部位和鬼針草的乙酸乙酯萃取部位萃取物各5 mg，分別在10.0 mL的容量瓶里用CH3OH溶液（分析純）進(jìn)行定容，配制成質(zhì)量濃度為0.5 mg·mL-1的鬼針草萃取部位樣品溶液。

2.6.2 ?色譜條件

色譜柱、流動(dòng)相及流速、柱溫、進(jìn)樣量及檢測(cè)波長(zhǎng)等相關(guān)條件如表1所示，流動(dòng)相梯度洗脫條件見(jiàn)表2，初始濃度平衡5 min。

3 ?血脂指標(biāo)與指紋圖譜相關(guān)結(jié)果

3.1 ?血脂指標(biāo)的變化

與基礎(chǔ)對(duì)照組比較，模型組TC、TG顯著升高（P<0.01或P<0.05）， HDL-C顯著降低（P<0.05），說(shuō)明造模成功。小鼠血脂指標(biāo)見(jiàn)表3。

3.2 ?各部位萃取物對(duì)高脂血癥小鼠血脂的影響

與基礎(chǔ)對(duì)照組比較，模型對(duì)照組TC、TG、LDL-C顯著升高（P<0.05或P<0.01），HDL-C顯著降低（P<0.05）。與模型對(duì)照組比較，洛伐他汀組、乙酸乙酯萃取物組和正丁醇萃取物組TC和LDL-C顯著降低（P<0.01）;乙酸乙酯萃取物組和正丁醇萃取物組HDL-C顯著提高（P<0.05）;洛伐他汀組TG顯著降低（P<0.05）。與洛伐他汀組比較，乙酸乙酯萃取物組和正丁醇萃取物組LDL-C含量相差顯著（P<0.01）。石油醚萃取物組以及二氯甲烷萃取物組各項(xiàng)指標(biāo)不明顯，故鬼針草乙酸乙酯部位萃取物和正丁醇部位萃取物對(duì)降低TC和LDL-C水平，升高HDL-C水平有較好的作用，有效改善血脂水平。各組小鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C水平比較見(jiàn)表4。

3.3 ?鬼針草乙酸乙酯及正丁醇萃取部位的指紋圖譜的測(cè)定

如圖1所示，正丁醇萃取部位與乙酸乙酯萃取部位的各主要色譜峰保留時(shí)間相近，但強(qiáng)度差異較大。

鬼針草正丁醇部位前半段時(shí)間色譜峰較多且強(qiáng)，可能存在一些極性較大的化學(xué)物質(zhì)，如黃酮多糖苷等。乙酸乙酯部位后半段時(shí)間色譜圖顯示出峰較多且峰強(qiáng)度大，可能相比于正丁醇部位所含物質(zhì)極性小一些，如黃酮單糖苷和黃酮苷元等。以上分析表明這兩種部位所含化學(xué)成分含量或者組成存在較大差異，可使用液質(zhì)聯(lián)用或者對(duì)照品等方法進(jìn)行進(jìn)一步分析所含化學(xué)成分。

4 ?有效降脂部位及色譜分析與討論

4.1 ?有效降脂部位的分析

本實(shí)驗(yàn)采用小鼠高血脂癥模型研究脂質(zhì)代謝紊亂狀況。實(shí)驗(yàn)表明，模型組小鼠血清TC、TG、LDL-C含量較正常組均明顯升高，HDL-C含量明顯降低，成功建立高脂血癥實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

各種脂蛋白在血漿中保持基本恒定的濃度，比例失調(diào)則發(fā)生脂質(zhì)代謝失?；蛭蓙y。LDL-C含量增加是導(dǎo)致冠心病的重要原因之一，LDL還與動(dòng)脈壁上的多糖生成沉淀，纖維組織受到刺激增生，最終形成粥樣斑塊[5]。而TC與 LDL-C含量的升高多是伴發(fā)的，TC和LDL-C 含量愈高，患冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的危險(xiǎn)性越大[6]。HDL-C由肝臟和小腸合成，基本功能是將多余的膽固醇送到肝臟分解，抑制LDL-C的氧化，能夠促使斑塊縮小，保護(hù)內(nèi)皮的完整性，因此對(duì)血管壁有一定的保護(hù)作用[7]。目前臨床上治療高脂血癥以他汀類藥物為主，他汀類藥物降血脂療效顯著，但是存在著急性肝炎、晶狀體混濁等不良反應(yīng)[8]。

一方面，張媛媛[9]通過(guò)建立大鼠高血脂模型，發(fā)現(xiàn)鬼針草中的總黃酮物質(zhì)可明顯升高高密度脂蛋白（HDL）的含量，顯著降低高血脂大鼠血清中的總膽固醇（TC）和甘油三酯（TG）的含量。另一方面，黃川鋒等通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，高血脂大鼠血清中的NO含量明顯高于正常組，過(guò)量的NO作為免疫介質(zhì)能夠發(fā)揮細(xì)胞毒作用，可導(dǎo)致心肌損傷等副作用，結(jié)果顯示鬼針草乙酸乙酯萃取物可顯著降低高血脂大鼠由NO過(guò)量引起的心肌損傷[10]。同時(shí)馬瑜紅等通過(guò)相關(guān)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)鬼針草具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的藥效作用[11]。為進(jìn)一步研究高效的降血脂藥用部位，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立小鼠高血脂模型，對(duì)比分析鬼針草各萃取部位的降脂效果，結(jié)果得出，除洛伐他汀外，乙酸乙酯萃取部位和正丁醇萃取部位降血脂效果較好，為鬼針草最佳降脂部位，可顯著降低小鼠血清中TC和LDL-C含量，升高HDL-C含量，且降低LDL-C水平明顯優(yōu)于洛伐他汀。說(shuō)明鬼針草有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的功能，改善LDL-C氧化導(dǎo)致的動(dòng)脈壁組織增生，減少粥樣斑塊的形成，保護(hù)血管，有效防治動(dòng)脈粥樣硬化和冠心病。鬼針草中化學(xué)物質(zhì)主要為黃酮類等，楊秀東實(shí)驗(yàn)證明黃酮類含量在鬼針草乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物中高于其他萃取物，對(duì)鬼針草乙酸乙酯萃取部位使用液質(zhì)聯(lián)用，分析發(fā)現(xiàn)主要含有芹菜素及其苷類、木犀草素、木犀草苷等[12，13]。

經(jīng)過(guò)以上總結(jié)分析，初步認(rèn)為鬼針草乙酸乙酯和正丁醇萃取部位具有降血脂藥效作用的可能主要為黃酮類成分。黃酮類化合物種類較多，對(duì)心腦血管等方面藥用價(jià)值較大，因此鬼針草所含有的化學(xué)物質(zhì)在降血脂方面有待深層次篩選分析，研究其發(fā)揮作用的主要化合物及結(jié)構(gòu)。

4.2 ?色譜分析

流動(dòng)相分別采用乙腈-甲酸（0.2%）、甲醇-甲酸（0.2%），乙腈-磷酸（0.2%）。分析圖譜結(jié)果顯示以乙腈-甲酸（0.2%）為佳。利用DAD檢測(cè)器依次采集分析鬼針草樣品溶液在254， 360， 380， 410 nm處的高效液相色譜圖，結(jié)果表明以360 nm為佳，其所含有的色譜峰較多，同時(shí)鬼針草兩種萃取部位的主要色譜峰分離度較好，峰強(qiáng)度較大。鬼針草乙酸乙酯和正丁醇部位具體成分還有待分析。

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