漢黃芩素對(duì)糖尿病腎病模型大鼠干預(yù)作用及腎組織RAGE、S100A8 表達(dá)的影響

張 璐 傅丹青

糖尿病腎病是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥[1]。糖尿病腎病與心血管疾病有關(guān)，并增加糖尿病患者的死亡率[2]。糖尿病腎病的病理生理學(xué)涉及炎癥、細(xì)胞黏附分子的表達(dá)、趨化因子和促炎性細(xì)胞因子分泌[3]。晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（RAGE）是高級(jí)糖化終產(chǎn)物（AGEs）的受體，AGE-RAGE 相互作用啟動(dòng)多個(gè)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，這些通路激活核因子-κB（NFκB），并增加氧化應(yīng)激[4]。此外，RAGE 基因的啟動(dòng)子區(qū)域包含兩個(gè)功能性NF-κB 結(jié)合位點(diǎn)，它們參與RAGE 表達(dá)的調(diào)控[5]。S100 蛋白家族由21 種小的（9-13kDa）Ca2+結(jié)合蛋白組成，參與多種細(xì)胞功能，髓樣相關(guān)蛋白8（S100A8）是S100 蛋白家族的成員，研究發(fā)現(xiàn)，S100A8 除了在炎癥過程中發(fā)揮作用外，還可能在糖尿病腎病中發(fā)揮病理生理作用[6]。漢黃芩素具有抗微生物、抗病毒和抗炎特性，長(zhǎng)期以來被用于治療各種疾病，例如系統(tǒng)紅斑狼瘡、腫瘤、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、傷口炎癥等[7]。研究表明，漢黃芩素的抗炎特性歸因于存在烯酮類化合物和苯丙烷類化合物，其抗氧化特性已有報(bào)道[8-9]。本研究擬探討漢黃芩素對(duì)糖尿病腎病模型大鼠的治療作用及腎組織RAGE、S100A8 表達(dá)的影響，為糖尿病腎病的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要藥物、試劑及儀器 漢黃芩素（原料藥，純度98%，成都瑞芬思生物科技有限公司，批號(hào)H-029，將漢黃芩素和蒸餾水配制成濃度分別為5、10mg/mL 的溶液）；厄貝沙坦片[賽諾菲（杭州）制藥有限公司，批號(hào)20190916，規(guī)格：0.15g×7 片/盒]；鏈脲佐菌素（STZ）（美國Sigma Aldrich 公司，批號(hào)S09367）；尿蛋白、血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）、血糖檢測(cè)試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司，批號(hào)分別為WS-7458、BG-6985、QA-2547、ZS-5896）；RNA 提取試劑盒、SYBR Premix Ex Taq 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒（日本Takara 公司，批號(hào)分別為RRA-2587、DRR420A）；RevertAid First Strand cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Thermo 公司，批號(hào)K1622）；RIPA 裂解緩沖液（西安赫特生物科技有限公司，批號(hào)WB009）；二辛可寧酸試劑盒（廈門研科生物技術(shù)有限公司，批號(hào)YKH-28993）；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠、聚偏二氟乙烯膜、化學(xué)發(fā)光試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究 所，批 號(hào) 分 別 為SF9101-5、FFP36、P0018M）；RAGE 一抗、S100A8 一抗、GAPDH 一抗、山羊抗鼠IgG 二抗（艾美捷科技有限公司，批號(hào)分別為ABP52321、BK003、NC0001、AMJ -AB2008）；GM300型血糖儀（瑞士Bionime 公司）；AU5800 型全自動(dòng)生化儀（美國貝克曼庫爾特公司）；CX23 型光學(xué)顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；Rotor-Gene 6000 型熒光實(shí)時(shí)定量PCR 儀（德國Qiagen 公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 清潔級(jí)Sprague Dawley（SD）大鼠60 只，10～12 周齡，體質(zhì)量180～220g，雌雄各半，購自華中科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（鄂）2019-0001，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK （鄂）2019-0045，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：N0019091326。根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分成五組：對(duì)照組、模型組、厄貝沙坦組（15mg/kg）[10]、漢黃芩素低劑量組（50mg/kg）[11]、漢黃芩素高劑量組（100mg/kg），每組12 只。大鼠單籠喂養(yǎng)，自由進(jìn)食和飲水，環(huán)境：濕度60%、溫度25°C、12h/12h 的光照/黑暗周期。本研究經(jīng)臺(tái)州市立醫(yī)院倫理委員會(huì)審核，批準(zhǔn)編號(hào)：倫審-2019-0117。

1.3 動(dòng)物建模及給藥 模型組、厄貝沙坦組、漢黃芩素低、高劑量組大鼠喂食高糖高脂飼料，8 周后，禁食、禁水12h，大鼠腹膜內(nèi)注射STZ 55mg/kg；對(duì)照組大鼠注射等體積生理鹽水，注射72h 后，測(cè)量空腹血糖（FBG）濃度，當(dāng)FBG 濃度＞16.7mmol/L，且尿蛋白＞30mg/24h 視為糖尿病腎病模型造模成功[12]。建模成功后第1 天開始，漢黃芩素低、高劑量組分別灌胃50、100mg/kg 的漢黃芩素（濃度分別為5、10mg/mL的溶液，灌胃體積10mL/kg）；厄貝沙坦組灌胃15mg/kg的厄貝沙坦（灌胃體積10mL/kg）；對(duì)照組和模型組給予等體積生理鹽水（10mL/kg）；每天1 次，持續(xù)8 周。

1.4 24h 尿蛋白、Scr、BUN、血糖的測(cè)定 最后一次給藥后24h，將所有動(dòng)物用氯胺酮（75mg/kg）麻醉。通過心臟穿刺收集血樣，快速分離血清，等分并保存在-80°C 下。取出大鼠腎臟組織樣品，立即冷凍在液氮中，并保存在-70°C 進(jìn)行RNA 提取。此外，將一部分腎臟組織固定在10%福爾馬林中以進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。使用代謝籠收集尿液，全自動(dòng)生化儀測(cè)定24h 尿蛋白、Scr、BUN、血糖水平。

1.5 大鼠腎臟病理觀察 將大鼠腎臟組織經(jīng)乙醇脫水，石蠟包埋后，制成石蠟切片，進(jìn)行HE 染色，顯微鏡觀察大鼠腎臟病理改變。

1.6 大鼠腎臟組織RAGE、S100A8 mRNA 水平檢測(cè)使用RNA 提取試劑盒從腎臟組織中分離總RNA，提取后，通過在260nm 波長(zhǎng)處定量RNA 純度，并通過電泳檢查其質(zhì)量。用RevertAid First Strand cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的RNA 用于合成互補(bǔ)DNA（cDNA）。使用SYBR Premix Ex Taq 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒和熒光實(shí)時(shí)定量PCR 儀通過PCR 反應(yīng)確定mRNA 表達(dá)的相對(duì)量。在包含10μL SYBR Premix Ex Taq、1μL 正向引物、1μL 反向引物、1μL cDNA 模板和7μL 無核酸酶蒸餾水的20μL 總反應(yīng)體系中進(jìn)行。引物由碧云天生物技術(shù)研究所合成，引物序列如下：RAGE：5'-GAGTCCGAGTCTACCAGATTCC-3'（正向）和5'-GGTCTCCTCCTTCACAACTGTC-3'（反向）；S100A8：5'-TGCCCTCTACAAGAATGACT-3'（正向）和5'-AAGCTCTGCTACTCCTTGTG-3'（反向）；β-肌動(dòng)蛋白：5'-GAGAAGATTTGGCACCACAC-3'（正向）和5'-CATCACAATGCCAGTGGTAC-3'（反向）。PCR 反應(yīng)在以下條件下進(jìn)行：在95°C 下20s（變性），55°C 30s（退火）和60°C 30s（延伸）的40個(gè)循環(huán)。根據(jù)2-ΔΔCt 方法確定RAGE 和S100A8 mRNA 的相對(duì)表達(dá)。β-肌動(dòng)蛋白的表達(dá)水平用作參考基因。

1.7 大鼠腎臟組織RAGE、S100A8 蛋白水平檢測(cè)將腎臟組織在RIPA 裂解緩沖液中裂解，通過二辛可寧酸試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離相等質(zhì)量的蛋白質(zhì)，并將其轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。將膜用含5%脫脂牛奶的Tris 緩沖鹽水封閉2h，然后與RAGE、S100A8，GAPDH 一抗（稀釋比均為1:1000）在37°C 過夜，與山羊抗鼠IgG 二抗（稀釋比1:5000）在室溫下孵育1h，并用化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。使用放射自顯影膠片進(jìn)行曝光和處理，Quantity One 分析軟件來定量印跡蛋白的條帶強(qiáng)度。GAPDH 用作內(nèi)部對(duì)照。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（） 表示，采用單因素方差分析比較，多重比較采用SNK-q 檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血BUN、Scr、24h 尿蛋白、血糖比較模型組大鼠血BUN、Scr、24h 尿蛋白、血糖水平高于對(duì)照組（P＜0.05）；厄貝沙坦組、漢黃芩素低、高劑量組大鼠BUN、Scr、24h 尿蛋白、血糖水平低于模型組（P＜0.05），且隨著漢黃芩素劑量的增加，漢黃芩素低、高劑量組大鼠BUN、Scr、24h 尿蛋白、血糖水平降低（P＜0.05）；漢黃芩素低、高劑量組大鼠BUN、Scr、24h 尿蛋白、血糖水平高于厄貝沙坦組（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠血BUN、Scr、24h 尿蛋白、血糖比較（）

注：對(duì)照組予10mL/kg 生理鹽水灌胃；模型組予10mL/kg 生理鹽水灌胃；厄貝沙坦組予15mg/kg 厄貝沙坦灌胃；漢黃芩素低劑量組予50mg/kg漢黃芩素灌胃；漢黃芩素高劑量組予100mg/kg 漢黃芩素灌胃；BUN 為尿素氮；Scr 為血肌酐；與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與厄貝沙坦組比較，cP＜0.05；與漢黃芩素低劑量組比較，dP＜0.05

2.2 各組大鼠腎組織HE 染色比較 對(duì)照組腎小球結(jié)構(gòu)正常；模型組腎小管上皮細(xì)胞胞質(zhì)不完整、脫落，出現(xiàn)明顯炎性浸潤(rùn)，基底膜增厚；厄貝沙坦組及漢黃芩素低、高劑量組炎性浸潤(rùn)、腎小管擴(kuò)張程度、腎小球增大明顯改善。見插頁圖1。

2.3 各組大鼠腎組織RAGE、S100A8 mRNA 水平比較 模型組大鼠腎組織RAGE、S100A8 mRNA 水平高于對(duì)照組（P＜0.05）；厄貝沙坦組、漢黃芩素低、高劑量組大鼠腎組織RAGE、S100A8 mRNA 水平低于模型組（P＜0.05），且隨著漢黃芩素劑量的增加，漢黃芩素低、高劑量組大鼠腎組織RAGE、S100A8 mRNA水平降低（P＜0.05）；漢黃芩素低、高劑量組大鼠腎組織RAGE、S100A8 mRNA 水平高于厄貝沙坦組（P＜0.05）。見表2。

2.4 各組大鼠腎組織RAGE、S100A8 蛋白水平比較模型組大鼠腎組織RAGE、S100A8 蛋白水平高于對(duì)照組（P＜0.05）；厄貝沙坦組、漢黃芩素低、高劑量組大鼠腎組織RAGE、S100A8 蛋白水平低于模型組（P＜0.05），且隨著漢黃芩素劑量的增加，漢黃芩素低、高劑量組大鼠腎組織RAGE、S100A8 蛋白水平降低（P＜0.05）；漢黃芩素低、高劑量組大鼠腎組織RAGE、S100A8 蛋白水平高于厄貝沙坦組（P＜0.05）。各組大鼠腎組織RAGE、S100A8 蛋白電泳深淺程度與表3 結(jié)果符合。見表3，插頁圖2。

3 討論

糖尿病是胰島素分泌不足或胰島素敏感性降低引起的代謝綜合征[13]。糖尿病控制不良會(huì)引起嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥，包括視網(wǎng)膜病變、神經(jīng)病變、腎病和大血管并發(fā)癥[14]。漢黃芩素是從黃芩中提取的一種化合物，是類黃酮家族的成員，具有抗氧化特性[15]。本研究顯示，漢黃芩素低、高劑量組大鼠BUN、Scr、24h 尿蛋白、血糖水平低于模型組（P＜0.05），且隨著漢黃芩素劑量的增加，大鼠BUN、Scr、24h 尿蛋白、血糖水平降低（P＜0.05）；結(jié)合病理學(xué)結(jié)果：厄貝沙坦組及漢黃芩素低、高劑量組腎組織炎性浸潤(rùn)、腎小管擴(kuò)張程度、腎小球增大明顯改善，表明漢黃芩素對(duì)大鼠糖尿病腎病具有明顯治療效果。

表2 各組大鼠腎組織RAGE、S100A8 mRNA 水平比較（）

表2 各組大鼠腎組織RAGE、S100A8 mRNA 水平比較（）

注：對(duì)照組予10mL/kg 生理鹽水灌胃；模型組予10mL/kg 生理鹽水灌胃；厄貝沙坦組予15mg/kg 厄貝沙坦灌胃；漢黃芩素低劑量組予50mg/kg 漢黃芩素灌胃；漢黃芩素高劑量組予100mg/kg 漢黃芩素灌胃；RAGE 為晚期糖基化終末產(chǎn)物受體；S100A8 為髓樣相關(guān)蛋白8；與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與厄貝沙坦組比較，cP＜0.05；與漢黃芩素低劑量組比較，dP＜0.05

表3 各組大鼠腎組織RAGE、S100A8 蛋白水平比較（）

表3 各組大鼠腎組織RAGE、S100A8 蛋白水平比較（）

注：對(duì)照組予10mL/kg 生理鹽水灌胃；模型組予10mL/kg 生理鹽水灌胃；厄貝沙坦組予15mg/kg 厄貝沙坦灌胃；漢黃芩素低劑量組予50mg/kg 漢黃芩素灌胃；漢黃芩素高劑量組予100mg/kg 漢黃芩素灌胃；RAGE 為晚期糖基化終末產(chǎn)物受體；S100A8 為髓樣相關(guān)蛋白8；與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與厄貝沙坦組比較，cP＜0.05；與漢黃芩素低劑量組比較，dP＜0.05

AGEs 與糖尿病腎病的發(fā)展有關(guān)[16]，AGE-RAGE相互作用可通過激活煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（NADPH）氧化酶提高活性氧（ROS）的產(chǎn)生。ROS 的過度生成導(dǎo)致氧化應(yīng)激，氧化應(yīng)激被認(rèn)為是腎臟疾病的共振器，可誘導(dǎo)NF-κB 表達(dá)[17]。此外，AGERAGE 相互作用導(dǎo)致諸如NF-κB 等壓力敏感信號(hào)級(jí)聯(lián)的激活，研究顯示[18]，在糖尿病小鼠中觀察到RAGE 的過表達(dá)，并加劇了腎臟疾病的發(fā)展。本研究結(jié)果表明，模型組大鼠腎組織RAGE mRNA 和蛋白水平高于對(duì)照組（P＜0.05）；厄貝沙坦組、漢黃芩素低、高劑量組大鼠腎組織RAGE mRNA 和蛋白水平低于模型組（P＜0.05），且隨著漢黃芩素劑量的增加，大鼠腎組織RAGE mRNA 和蛋白水平降低（P＜0.05）。說明RAGE 在糖尿病腎病模型大鼠中過表達(dá)，而漢黃芩素抑制糖尿病腎病模型大鼠腎組織RAGE mRNA 和蛋白表達(dá)有劑量依賴性。此外，研究發(fā)現(xiàn)，RAGE 的基因缺失可以有效減少DN 早期的原發(fā)性腎功能損害和腎小球結(jié)構(gòu)改變，這與本研究結(jié)果符合[19]。AGEs 可誘導(dǎo)S100A8 mRNA 表達(dá)增加，S100A8 是RAGE 的一種配體，它通過激活NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)參與促炎細(xì)胞因子的分泌，研究證明S100A8 在糖尿病小鼠中的表達(dá)升高[20]。研究顯示，在糖尿病大鼠中，紋狀體鏈球菌以劑量依賴性方式下調(diào)S100A8 表達(dá)，紋狀體鏈球菌對(duì)S100A8 基因轉(zhuǎn)錄的抑制有助于腎臟功能的改善[21]。本研究結(jié)果顯示，厄貝沙坦組、漢黃芩素低、高劑量組大鼠S100A8 mRNA 和蛋白水平低于模型組（P＜0.05），且隨著漢黃芩素劑量的增加，大鼠S100A8 mRNA 和蛋白水平降低（P＜0.05）；說明漢黃芩素可對(duì)糖尿病腎病大鼠S100A8 mRNA 和蛋白產(chǎn)生抑制作用，其效果與紋狀體鏈球菌相似。

綜上所述，漢黃芩素對(duì)糖尿病腎病大鼠模型具有明顯治療效果；其機(jī)制可能與漢黃芩素可對(duì)糖尿病腎病大鼠腎臟組織RAGE、S100A8 mRNA 和蛋白產(chǎn)生抑制作用有關(guān)。