摻鍶復(fù)合PVA/生物活性玻璃水凝膠的制備及其體外軟骨修復(fù)性能研究*

林博偲 王會(huì) 李久盛 蔣海珍 曾祥瓊

由機(jī)體老化、不健康運(yùn)動(dòng)、機(jī)械創(chuàng)傷和軟骨病變引起的關(guān)節(jié)軟骨損傷問(wèn)題正日趨嚴(yán)重，并且已經(jīng)嚴(yán)重威脅著患者的身心健康[1]。然而，關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)部缺少神經(jīng)和血管、軟骨細(xì)胞數(shù)目較少，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨幾乎不具備自我損傷修復(fù)的能力。軟骨損傷的再生修復(fù)是目前臨床上亟待解決的問(wèn)題[2-4]。但是，目前的市面上的人工軟骨的生物相容性不佳、力學(xué)性能差，臨床上修復(fù)效果不理想。因此，亟需制備一種具有高機(jī)械強(qiáng)度且生物相容性良好的軟骨修復(fù)材料。

生物活性玻璃（bioactive glass，BG）作為可植入生物材料領(lǐng)域最具潛力的材料之一，因其良好的生物相容性和降解性能，可作為骨植入材料并廣泛應(yīng)用于組織再生領(lǐng)域[5]。然而，彈性模量低和表面不穩(wěn)定性是其主要缺點(diǎn)，影響了BG 作為生物支架的機(jī)械強(qiáng)度。聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）具有無(wú)毒、韌性高、易改性等優(yōu)點(diǎn)，是一種性能優(yōu)良的高分子材料，可以作為改性材料使用[6]。本研究將PVA和BG 制成水凝膠以模擬天然軟骨的結(jié)構(gòu)，摻雜鍶元素提高成軟骨性能，研究水凝膠浸泡在磷酸鹽緩沖液（PBS）中的可降解性能、離子釋放性能和結(jié)構(gòu)變化。通過(guò)在水凝膠上培養(yǎng)小鼠軟骨細(xì)胞，對(duì)其細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞增殖進(jìn)行分析，評(píng)價(jià)水凝膠在體外軟骨修復(fù)中的應(yīng)用效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器及材料

EO20-PO70-EO20（P123）、正硅酸四乙酯（TEOS）、三水合硝酸鈣[Ca (NO3)24H2O]、磷酸三乙酯（TEP）、鹽酸（HCl）購(gòu)自Sigma-Aldrich 公司（美國(guó)）。聚乙烯醇（PVA）和乙醇購(gòu)自阿拉丁公司（上海）。差示掃描量熱儀（DSC3，Mettler Toledo，瑞士），電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀（Avio200，PerkinElmer，美國(guó)），pH 計(jì)（FiveEasyPlus，MettlerToledo，瑞士），X 射線(xiàn)衍射儀（D8Advance，Bruker，德國(guó)），掃描電鏡（SU-70，日立，日本），酶聯(lián)檢測(cè)儀（Imark，Bio-Rad 公司，美國(guó)）。

1.2 PB、PB-Sr 水凝膠的制備

1.2.1 BG 溶膠凝膠溶液的制備

采用非離子型嵌段共聚物EO20-PO70-EO20（P123）制備BG 溶膠凝膠溶液。將P123（4.0 g）、正硅酸四乙酯（TEOS，6.7 g）、Ca (NO3)24H2O（1.4 g）、磷酸三乙酯（TEP，0.73 g）、0.5M HCl（1.0 g）分別溶于乙醇（60 g）中，室溫?cái)嚢? d，得到BG 溶膠凝膠溶液。

1.2.2 Sr-BG 溶膠凝膠溶液的制備

在上述BG 配方的基礎(chǔ)上加入0.63gSrCl2，室溫?cái)嚢?d，得到Sr-BG 溶膠凝膠溶液。

1.2.3 PVA 溶液的制備

制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的PVA 溶液: 將2gPVA 溶于20mL的去離子水，加熱到90℃，磁力攪拌20min，使溶液清澈透明，在室溫下靜置1 h，得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的PVA 溶液。

1.2.4 水凝膠的制備

BG 溶膠凝膠溶液添加到PVA 溶液中，PVA 溶液與BG溶膠凝膠溶液體積比為5∶1，加熱到80 ℃，磁力攪拌2 h混合均勻，充分反應(yīng)得到凝膠，稱(chēng)為PB 水凝膠。

Sr-BG 溶膠凝膠溶液添加到PVA 溶液中，PVA 溶液與Sr-BG 溶膠凝膠溶液體積比為5∶1，加熱到80 ℃，磁力攪拌2 h 混合均勻，充分反應(yīng)得到凝膠，稱(chēng)為PB-Sr 水凝膠。

1.3 測(cè)試與表征

1.3.1 差示掃描量熱法（DSC）

采用差示掃描量熱儀在空氣氣氛下進(jìn)行熱分析，測(cè)試溫度范圍25 ～800 ℃，升溫速率為10 ℃/min。通過(guò)DSC 曲線(xiàn)分析材料的熱力學(xué)性能。

1.3.2 形貌觀察

通過(guò)SEM 觀察材料在PBS 溶液浸泡前后的形貌變化，對(duì)PVA、PB 和PB-Sr 表面生成的羥基磷灰石形成進(jìn)行評(píng)價(jià)。在測(cè)試前，用濺射法在試樣表面鍍上一層薄薄的金膜。利用15 kV 的加速電壓，獲得了二次電子（SE）的圖像。

1.3.3 pH 的變化和質(zhì)量損失

將3 組材料（PVA、PB、PB-Sr）在無(wú)水乙醇介質(zhì)中超聲清洗、烘干，然后將支架置于盛有PBS 溶液的聚乙烯瓶中，按照PBS 溶液體積和材料質(zhì)量比為100 mL/g 的比例，再將聚乙烯瓶加蓋密封，置于37 ℃的烘箱內(nèi)，整個(gè)過(guò)程中不更換PBS 溶液（即靜態(tài)PBS 溶液浸泡）。到達(dá)預(yù)定時(shí)間2、4、6、8、10、14、28 d 后，取出材料，用pH 計(jì)測(cè)試浸泡后溶液的pH，用去離子水和無(wú)水乙醇輕輕洗滌材料3 遍，然后在37 ℃烘箱中干燥，完全烘干后稱(chēng)重并計(jì)算質(zhì)量損失。

1.3.4 離子釋放研究

水凝膠浸泡PBS 溶液2、4、6、8、10、14、28d 后溶液中的Ca、Si、Sr 元素含量用電感耦合等離子體-原子發(fā)射光譜測(cè)定。

1.3.5 X 射線(xiàn)衍射（XRD）

采用X 射線(xiàn)多晶衍射儀分析水凝膠表面的羥基磷灰石結(jié)晶情況（測(cè)試角度10 ～80°，工作電壓40kV，電流40mA，掃描速度10°/min）。

1.3.6 細(xì)胞增殖性評(píng)價(jià)

水凝膠的浸提液與細(xì)胞共培養(yǎng)1、3、7 d 后，使用CCK-8工作液對(duì)細(xì)胞的增殖進(jìn)行評(píng)估。將購(gòu)置的CCK-8 原液與完全培養(yǎng)基以1∶10 的比例配置CCK-8 工作液，并將其避光放置。將到達(dá)時(shí)間點(diǎn)的孔板里的培養(yǎng)基用移液槍吸出，用PBS清洗后往每個(gè)孔中加入200 L 的CCK-8 工作液，并將其用錫紙包裹，置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)1 h。然后從每孔吸取100 L 工作液加入新的96 孔板中，注意孔板中的工作液表面不能有氣泡，通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)量其在450nm 處的OD 值。

1.3.7 細(xì)胞熒光染色

使用活/死細(xì)胞試劑盒檢測(cè)軟骨細(xì)胞在3 種材料（PVA、PB、PB-Sr）上的生長(zhǎng)活性。材料經(jīng)75%乙醇消毒滅菌后放入96 孔板，將軟骨細(xì)胞按照2×104的細(xì)胞數(shù)量種植在以上3 種材料上，放入恒溫箱培養(yǎng)3 d。倒掉培養(yǎng)基，用PBS 溶液洗滌1 ～2 次，然后加入羅丹明B 和DAPI 的混合溶液至浸沒(méi)材料。室溫放置3 ～5 min。吸除多余染色液，用PBS溶液洗滌2 ～3 次，每次3 ～5 min。直接在熒光顯微鏡下觀察。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0 軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析（ANOVA）對(duì)多組進(jìn)行比較，然后進(jìn)行Tukey-Kramer 檢驗(yàn)＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 差示掃描量熱法（DSC）表征

采用DSC 法對(duì)PVA、PB、PB-Sr 水凝膠的熱穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)。如圖1 所示，PB 和PB-Sr 水凝膠的熱分解曲線(xiàn)不同，有一定溫度偏移。并且在480℃有一個(gè)明顯的峰值，是由于PVA 和BG 發(fā)生交聯(lián)，形成了雜化物。

圖1 PVA、PB、PB-Sr 水凝膠的DSC 曲線(xiàn)

2.2 形貌觀察

PBS 溶液浸泡90 d 后的水凝膠SEM 圖像如圖2 所示，水凝膠表面被層片狀的羥基磷灰石覆蓋。BG釋放的Ca2+離子與PBS溶液中的PO43-離子發(fā)生反應(yīng)形成羥基磷灰石。結(jié)果表明，相比PB-Sr 水凝膠，PB 水凝膠表面生成的羥基磷灰石結(jié)晶情況更佳。

圖2 PVA、PB、PB-Sr 水凝膠在PBS 溶液中浸泡90 d 的SEM 圖

2.3 pH 的變化、質(zhì)量損失和離子釋放研究

PVA、PB、PB-Sr 三組水凝膠在PBS 溶液中浸泡的質(zhì)量損失和pH 變化如圖3 所示。由于BG 向羥基磷灰石（HA）的轉(zhuǎn)化伴隨著質(zhì)量的減輕，因此這些數(shù)據(jù)可以用來(lái)衡量轉(zhuǎn)化動(dòng)力學(xué)。3 組水凝膠的減重趨勢(shì)相同，在最初的0 ～9 d 內(nèi)迅速增長(zhǎng)，之后又顯著放緩，在28 d 左右趨向穩(wěn)定。圖3A為質(zhì)量損失曲線(xiàn)，在任意浸泡時(shí)間段內(nèi)，PB 水凝膠組的失重都高于PB-Sr 組，28 d 后PB 水凝膠降解率為25%，PBSr 水凝膠降解率為16%。圖3B 為水凝膠樣品浸泡在PBS 溶液下的pH 變化曲線(xiàn)，PB-Sr 組的pH 變化更小，說(shuō)明PB-Sr組比PB 組更穩(wěn)定。這是由于PVA 原料中殘余的酸在降解過(guò)程中緩慢釋放，導(dǎo)致3 組水凝膠的pH 下降。

采用電感耦合等離子體光譜儀（ICP）分析水凝膠浸泡過(guò)程中離子釋放到溶液中的情況。羥基磷灰石的形成是通過(guò)消耗水凝膠釋放的Ca2+和PBS 溶液釋放的Ca2+、Sr2+和的累積釋放量顯示同樣的趨勢(shì)（見(jiàn)圖3C-E）。圖3D 中可見(jiàn)，Ca2+濃度在開(kāi)始的幾天內(nèi)迅速上升，之后逐漸緩慢上升。

圖3 PVA、PB、PB-Sr 水凝膠浸泡在PBS 溶液中28 d 內(nèi)的相關(guān)參數(shù)變化:A.質(zhì)量損失曲線(xiàn)；B.pH變化曲線(xiàn)；C.Sr2+離子釋放曲線(xiàn)；D.Ca2+離子釋放曲線(xiàn)；E.SiO32-離子釋放曲線(xiàn)

2.4 X 射線(xiàn)衍射表征

圖4 為PB-Sr 水凝膠在PBS 溶液中浸泡0、30、90 d 的XRD 圖譜。在羥基磷灰石標(biāo)準(zhǔn)圖譜Ca10(PO4)6OH2（JCPSD 72-1243）上出現(xiàn)特征峰，與羥基磷灰石標(biāo)準(zhǔn)圖譜對(duì)應(yīng)得很好。最強(qiáng)峰位于標(biāo)準(zhǔn)圖譜的左側(cè)[Ca10(PO4)6OH2標(biāo)準(zhǔn)譜最強(qiáng)峰的2 為31.773°]，表明在PBS 溶液浸泡下，水凝膠表面形成了羥基磷灰石。浸泡時(shí)間越長(zhǎng)，其峰值越強(qiáng)。說(shuō)明隨著浸泡時(shí)間的延長(zhǎng)，生成的羥基磷灰石結(jié)晶程度更好。從圖譜中還可以看出，浸泡90 d 的PB-Sr 水凝膠的XRD 衍射峰強(qiáng)度高，峰型尖銳，說(shuō)明得到的羥基磷灰石晶體結(jié)構(gòu)完整[7]。

圖4 PB-Sr 水凝膠在PBS 浸泡0、30、90 d 的XRD 圖和羥基磷灰石Ca10(PO4)6OH2 標(biāo)準(zhǔn)XRD 圖譜

2.5 細(xì)胞增殖能力評(píng)價(jià)

如圖5 所示，培養(yǎng)7 d 后PB-Sr 水凝膠的OD 值為0.76±0.04，PB 水凝膠的OD 值為0.52±0.02，PVA 水凝膠的OD 值為0.45±0.04。PB 和PB-Sr 水凝膠組的OD 值均高于對(duì)照組，說(shuō)明PB 和PB-Sr 水凝膠的細(xì)胞增殖水平高于對(duì)照組，表明了這兩種水凝膠均無(wú)明顯細(xì)胞毒性。PB-Sr 水凝膠的OD 值明顯高于PB 水凝膠和PVA 水凝膠，進(jìn)一步說(shuō)明軟骨細(xì)胞在PB-Sr 水凝膠上能更好的黏附與增殖。

2.6 細(xì)胞熒光染色

如圖6 所示，軟骨細(xì)胞黏附于水凝膠上生長(zhǎng)，核形完整、無(wú)固縮、染色質(zhì)均勻。在PVA、PB、PB-Sr 水凝膠上培養(yǎng)的細(xì)胞數(shù)量呈現(xiàn)依次增加趨勢(shì)，PB-Sr 水凝膠上細(xì)胞數(shù)量最多表明軟骨細(xì)胞在PB-Sr 水凝膠上能更好的黏附與增殖。

圖5 培養(yǎng)在PVA、PB、PB-Sr 水凝膠上的軟骨細(xì)胞增殖能力；與對(duì)照組比較*＜0.05，***＜0.001

圖6 PVA、PB、PB-Sr 水凝膠在羅丹明B 和DAPI 下的細(xì)胞熒光染色，藍(lán)色部分采用DAPI 對(duì)細(xì)胞核染色，紅色部分采用羅丹明B 對(duì)細(xì)胞質(zhì)染色，紫紅色部分為兩者疊加圖像

3 討論

鍶是人體牙齒和骨骼中天然存在的元素，具有良好的促骨修復(fù)性能。大量研究結(jié)果表明，鍶參與骨的形成，具有刺激骨形成和抑制骨吸收的作用[8]； 鍶可預(yù)防骨丟失，改善骨代謝，增加骨質(zhì)疏松動(dòng)物的骨質(zhì)量[9]； 同時(shí)，低濃度的鍶還可促進(jìn)骨基質(zhì)的合成及成骨細(xì)胞的成熟和礦化，有利于骨骼重建和骨小梁數(shù)量的增加[10-11]。Terra 等[12]報(bào)道鍶能增強(qiáng)磷酸鈣的骨傳導(dǎo)性能，提高骨組織的力學(xué)性能。Bonnelye 和Marie 等[13-14]研究發(fā)現(xiàn)，鍶能促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，抑制破骨細(xì)胞的形成和吸收。另外，相關(guān)研究表明，鍶還具有促進(jìn)軟骨修復(fù)的性能: Marie 和Yu 等[15-16]報(bào)道在骨關(guān)節(jié)炎治療中，鍶在減少軟骨退化和減少軟骨細(xì)胞凋亡方面起著至關(guān)重要的作用。沈宇輝等[17]的研究表明，鍶離子可通過(guò)激活缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxia inducible factor, HIF）信號(hào)通路，誘導(dǎo)軟骨的增殖，維持其表型；通過(guò)作用激活軟骨細(xì)胞自噬作用，抑制細(xì)胞降解代謝活動(dòng)及印度刺猬蛋白（Indian hedgehog，IHH）信號(hào)通路保護(hù)軟骨細(xì)胞。

本研究發(fā)現(xiàn)，在PB 水凝膠的基礎(chǔ)上引入鍶元素（PBSr）可促進(jìn)形成新的化學(xué)鍵，進(jìn)而提高材料的化學(xué)穩(wěn)定性。DSC 結(jié)果顯示（見(jiàn)圖1），PB-Sr 相比PB 水凝膠在480 ℃有峰的偏移，說(shuō)明材料結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。浸泡實(shí)驗(yàn)中的質(zhì)量損失和pH 改變（見(jiàn)圖3 A、圖3B）說(shuō)明PB 和PB-Sr 水凝膠均具有較好的降解性能。其中PB-Sr 的降解速率較慢，表明其化學(xué)穩(wěn)定性更高，與DSC 分析結(jié)果一致。PB 和PB-Sr 的質(zhì)量損失和pH 變化在開(kāi)始浸泡后的初始階段均有大幅度的上升，隨著浸泡時(shí)間的增加逐漸趨緩。這是由于試樣表面積累的羥基磷灰石層逐漸阻礙了降解反應(yīng)，導(dǎo)致pH 變化率和質(zhì)量損失率隨時(shí)間呈減緩趨勢(shì)。鍶離子屬于堿性離子，被釋放時(shí)會(huì)增加局部環(huán)境的pH[18]，所以PB-Sr 組的pH 最高。PB 和PB-Sr 組的pH 均高于PVA 組，因?yàn)锽G 中的CaO 等組分溶于溶液中釋放Ca2+離子，與水中的羥基發(fā)生反應(yīng)，生成堿性的Ca (OH)2，從而抵消一部分由PVA 自帶的酸性原料使pH 下降的影響。離子釋放曲線(xiàn)（見(jiàn)圖3C-E）表明，材料能釋放出促進(jìn)軟骨修復(fù)的鈣離子和鍶離子。鈣離子濃度的快速增加是由于水凝膠降解導(dǎo)致離子快速釋放所致，然后形成的羥基磷灰石消耗鈣離子導(dǎo)致鈣離子濃度增長(zhǎng)緩慢。Sr2+和SiO32-則逐步緩慢釋放。SEM 結(jié)果（見(jiàn)圖2）和XRD 結(jié)果（見(jiàn)圖4）也證明了羥基磷灰石的生成，并且隨著浸泡時(shí)間的增加，羥基磷灰石結(jié)晶更完整。

細(xì)胞增殖結(jié)果（見(jiàn)圖5）和熒光染色結(jié)果（見(jiàn)圖6）表明，PB 水凝膠可促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖，鍶元素的引入則能進(jìn)一步增強(qiáng)細(xì)胞增殖效果。Henrotin 與Alexandersen 研究發(fā)現(xiàn)，鍶元素可通過(guò)刺激關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞合成代謝增加軟骨基質(zhì)的形成[19]并可降低Ⅱ型膠原降解生物標(biāo)記物CTX-Ⅱ的水平，進(jìn)而減少軟骨退變[20]。Deng 等[21]報(bào)道鍶離子通過(guò)激活Wnt 通路刺激軟骨重建，促進(jìn)軟骨下骨再生，并通過(guò)抑制軟骨細(xì)胞代謝活性和增加自噬來(lái)進(jìn)一步保護(hù)軟骨細(xì)胞免受骨關(guān)節(jié)炎的損傷。

對(duì)生物活性玻璃（BG）和摻鍶生物活性玻璃（Sr-BG）與PVA 制備的復(fù)合水凝膠進(jìn)行相關(guān)性能研究，探索水凝膠浸泡在磷酸鹽緩沖液（PBS）中的可降解性能、離子釋放性能和結(jié)構(gòu)變化，以及體外促軟骨細(xì)胞增殖能力評(píng)價(jià)。筆者的研究結(jié)果表明，PB 和PB-Sr 水凝膠具有良好的生物活性和降解性能，同時(shí)兩種水凝膠均可以促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖分化，可望用于修復(fù)受損軟骨。PB 和PB-Sr 水凝膠均無(wú)明顯的細(xì)胞毒性，其中摻雜鍶元素后能更好地促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖與黏附，有效幫助軟骨組織修復(fù)再生。然而該材料在體內(nèi)的降解吸收情況和體內(nèi)修復(fù)關(guān)節(jié)骨軟骨損傷的效果還有待進(jìn)一步研究，以期為臨床應(yīng)用提供更多依據(jù)。