百合灰霉病對東方百合不同抗性品種的生理影響1)

李芳樂 管玲玲 胡鳳榮

(南京林業(yè)大學(xué)，南京，210037)

百合(Liliumspp.)是單子葉植物亞綱百合科(Liliaceae)百合屬(Lilium)所有種類的總稱。作為世界著名觀賞花卉之一，應(yīng)用廣泛。東方百合(LiliumorientalHybrid)作為百合的知名栽培品種之一，花色豐富、花形較大且具特殊香味，觀賞及應(yīng)用價值高。隨著百合栽培面積的不斷擴(kuò)大，病害的發(fā)生日趨嚴(yán)重。而引起百合病害的種類很多，其發(fā)病癥狀各異，較常發(fā)生且研究較多的幾種病害有灰霉病、炭疽病、枯萎病以及由鐮刀菌引起的根腐病、基腐病、斑點(diǎn)病等。

百合灰霉病是百合的主要病害之一，其病原菌為橢圓葡萄孢(Botrytiselliptica(Berk.) Cooke)[1]。它能侵染百合葉、莖稈、花及鱗莖，造成葉片枯萎，花蕾腐爛，植株提早死亡，影響鱗莖質(zhì)量，嚴(yán)重遏制百合的生產(chǎn)，一般產(chǎn)量損失20%～30%，嚴(yán)重時可造成失收[2]。由于長期大量依賴殺菌劑防治灰霉病，已使灰霉菌對各種殺菌劑產(chǎn)生抗藥性，也成為生產(chǎn)上亟待解決的一大難題。選育和利用抗病品種，則是一種更為經(jīng)濟(jì)、有效、安全的方法。但由于大量的研究工作只注重于藥劑防治，對灰霉菌引發(fā)的病害缺乏機(jī)制等方面的深入研究，更沒有篩選到有效的抗原材料，致使百合抗灰霉病的育種工作進(jìn)展緩慢。

目前，關(guān)于植物受病害脅迫后，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)新陳代謝變化的報道較多，如黃瓜(CucumissativusLinn.)枯萎病[3]、番茄(LycopersiconesculentumMiller)灰霉病[4]、蘋果(MaluspumilaMill.)褐斑病[5]，此外，在棉花(GossypiumherbaceumL.)[6]、玉米(ZeamaysL.)[7]等其他植物中也有相關(guān)研究。總之，由于植物抗病機(jī)制的復(fù)雜性，不同植物感染病原菌后各生理指標(biāo)的變化規(guī)律均不盡相同。百合灰霉病是我國百合地上部分普遍發(fā)生且危害嚴(yán)重的病害之一，但目前關(guān)于百合灰霉病發(fā)病后抗病品種體內(nèi)相關(guān)生理指標(biāo)的變化報道較少。本研究對東方百合不同抗性品種接種百合灰霉菌后體內(nèi)相關(guān)生理指標(biāo)進(jìn)行測定分析，以探討東方百合品種抗灰霉病的生理機(jī)制，以期為百合灰霉病的抗病育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以對百合灰霉病具有不同抗性的東方百合品種為試驗材料[8]，即高抗(HR)品種：‘索邦’(‘Sorbonne’)、‘康斯坦薩’(‘Constanta’)和‘西伯利亞’(‘Siberia’)，抗性由大到小的順序為‘Sorbonne’、‘Constanta’、‘Siberia’；高感(HS)品種‘法蘭西’(‘Francia’)為對照組。

供試菌種灰葡萄孢(Botrytiscinerea)(灰霉病菌)，由金陵科技學(xué)院植物保護(hù)教研室提供，分離于南京地區(qū)。

1.2 試驗方法

試驗在南京林業(yè)大學(xué)溫室進(jìn)行，保持灰霉病發(fā)病最適宜的溫濕度，隨機(jī)區(qū)組設(shè)計。每個品種3次重復(fù)，共12個小區(qū)，每小區(qū)10 m2，種植百合40株，常規(guī)栽培管理。

用無菌水將在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA培養(yǎng)基)上生長7 d的灰霉菌孢子洗出，并調(diào)成1×105～5×105菌落·mL-1的菌懸液，采用噴霧法接種，噴水套袋后放入高濕的培養(yǎng)箱中20 ℃培養(yǎng)。

1.2.1 采樣

分別于接種當(dāng)天，即第1天(接菌前)和接種后第3、第5、第7、第9天采樣。每品種每小區(qū)隨機(jī)選取10株，分上、中、下隨機(jī)摘取百合葉片，洗凈晾干，剪去葉柄，將葉片剪成約1.0 cm×1.5 cm大小，分別迅速稱質(zhì)量，即0.3 g·包-1和1.0 g·包-1，放入冰箱超低溫冷凍備用。

1.2.2百合葉片RE，C及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)測定方法

RE，C采用電導(dǎo)率儀測定法、MDA質(zhì)量摩爾濃度采用硫代巴比妥酸顯色法、可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)采用考馬斯亮藍(lán)-G250染色法、可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)采用蒽酮比色法、Pro質(zhì)量分?jǐn)?shù)采用酸性茚三酮法測定[9]。

1.2.3 百合葉片防御酶測定方法

3種防御酶的粗酶提?。哼x用pH值7.0磷酸鹽緩沖液作為粗酶提緩沖液，可達(dá)到同時提取SOD、POD和CAT三種防御酶的目的[10]。

3種防御酶活性測定：SOD活性測定采用氮藍(lán)四唑法(NBT)[9]；POD活性測定采用愈創(chuàng)木酚比色法[9]；CAT活性測定采用紫外分光光度法[11]。

PAL活性測定：按孫紅梅等[12]的方法進(jìn)行PAL的提取和活性測定。

1.2.4 百合葉片植物激素質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定方法

采用酶聯(lián)免疫吸附檢測法(ELISA)測定植物激素質(zhì)量分?jǐn)?shù)[9]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用Excel軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行處理；應(yīng)用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 接菌前后東方百合抗感品種葉片表型變化

對接菌前及接菌后不同時期各抗感品種的生理指標(biāo)進(jìn)行測定，觀察到高感品種‘Fancia’發(fā)病早，發(fā)病嚴(yán)重且病情發(fā)展速度快，而高抗品種發(fā)病晚，發(fā)病較輕且病情發(fā)展緩慢。接菌后高感品種葉片出現(xiàn)圓形或橢圓形，中央灰白色、邊緣紅褐色的病斑，病斑面積占整個葉片面積的50%以上，且隨著接種時間的延長病斑面積逐漸擴(kuò)大，第7天葉片布滿霉層，開始枯萎凋落(圖1)；高抗品種接菌前無病斑出現(xiàn)，第5天才開始出現(xiàn)少量病斑，病斑面積占葉片面積的5%以下，第9天僅有少量葉片枯萎，對灰霉病表現(xiàn)出較強(qiáng)抗性(圖2)。但不論抗性強(qiáng)弱，接菌后各抗感品種葉片生理指標(biāo)都會發(fā)生一定變化。

2.2 接種百合灰霉菌后百合葉片RE，C和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的變化

本研究對東方百合高抗和高感品種接種百合灰霉菌后各葉片的RE，C，MDA質(zhì)量摩爾濃度，Pro、可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行測定，統(tǒng)計分析見表1。

表1 百合灰霉菌對東方百合葉片RE，C和代謝產(chǎn)物的影響

由表1可見，接種百合灰霉菌后，除了高抗與高感品種的RE，C間存在極顯著差異，‘Francia’和‘Sorbonne’的Pro質(zhì)量分?jǐn)?shù)間存在極顯著差異外，其他指標(biāo)品種間均未達(dá)到極顯著水平，表明百合灰霉病抗性與RE，C和Pro質(zhì)量分?jǐn)?shù)之間均可能存在一定相關(guān)性。

2.3 接種百合灰霉菌后百合體內(nèi)防御酶活性變化

本研究對東方百合高抗和高感品種接種百合灰霉菌后各葉片的SOD、POD、CAT和PAL活性進(jìn)行測定，統(tǒng)計分析見表2。

表2 百合灰霉菌對東方百合葉片4種防御酶活性的影響

由表2可見，接種百合灰霉菌后，高抗與高感品種的SOD、CAT活性間均存在極顯著差異；‘Constanta’和‘Francia’的POD、CAT活性間分別存在極顯著差異；‘Siberia’和‘Francia’的CAT、PAL活性間分別存在極顯著差異；高抗品種除POD活性間存在極顯著差異外，其余的酶活性間均未達(dá)到極顯著差異，表明百合灰霉病抗性和4種高防御酶活性之間可能有一定相關(guān)性。

2.4 接種百合灰霉菌后百合體內(nèi)相關(guān)植物激素質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化

本研究對東方百合高抗和高感品種接種百合灰霉菌前后各葉片植物激素質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行測定，統(tǒng)計分析見表3。

表3 百合灰霉菌對東方百合葉片4種植物激素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

由表3可見，接種百合灰霉菌后，高抗品種和高感品種在4種植物激素質(zhì)量分?jǐn)?shù)上均存在極顯著差異，表明百合灰霉病抗性和4種植物激素間均可能存在一定相關(guān)性。

2.5 不同百合灰霉病菌脅迫時間下不同抗性東方百合品種各生理指標(biāo)的變化

2.5.1葉片RE，C

由表4可知，接菌后第9天各抗感品種均低于接菌前。方差分析表明，接菌后第9天與接菌前相比，各抗感品種RE，C間均差異顯著。高感品種‘Francia’接菌前RE，C最大，達(dá)34.21%，接菌后迅速下降，至第5天達(dá)到最低，顯著降低了15%。各高抗品種接菌后，RE，C為15.86%～31.13%，均呈先上升后下降再上升再下降的趨勢，在第5天出現(xiàn)最低值。

2.5.2 葉片MDA質(zhì)量摩爾濃度

由表4可知，接菌后第9天高抗品種‘Sorbonne’和高感品種‘Francia’MDA質(zhì)量摩爾濃度較接菌前下降，其余品種均高于接菌前。方差分析表明，接菌后第9天與接菌前相比，各抗感品種MDA質(zhì)量摩爾濃度的變化差異均未達(dá)顯著水平。接菌后，各高抗品種葉片MDA質(zhì)量摩爾濃度均迅速上升，第3天達(dá)到最大值后下降至第5天與接菌前MDA質(zhì)量摩爾濃度相當(dāng)，之后‘Sorbonne’ MDA質(zhì)量摩爾濃度繼續(xù)下降，‘Constanta’和‘Siberia’均緩慢上升，‘Constanta’在接菌第3天MDA質(zhì)量摩爾濃度達(dá)最大值，為接菌前的2.86倍；而高感品種‘Francia’ MDA質(zhì)量摩爾濃度呈先下降后上升再下降后上升的趨勢，在第7天出現(xiàn)最小值，比接菌前顯著降低了46%。接菌前和接菌后第3天測定葉片MDA質(zhì)量摩爾濃度的差異可作為鑒定抗感品種的指標(biāo)。

2.5.3 葉片Pro質(zhì)量分?jǐn)?shù)

由表4可知，接菌后第9天各抗感品種Pro質(zhì)量分?jǐn)?shù)均較接菌前下降。方差分析表明，接菌后第9天與接菌前相比，各抗感品種Pro質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化差異均未達(dá)顯著水平。接菌前，高抗品種‘Sorbonne’葉片Pro質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低。接菌后各抗感品種葉片Pro質(zhì)量分?jǐn)?shù)總體呈下降趨勢。高感品種‘Francia’接菌后先下降后緩慢上升，第7天達(dá)到最低，下降了1.741 μg·g-1。高抗品種‘Constanta’和‘Siberia’接菌后葉片Pro質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降較快，‘Constanta’到第3天降至最低，下降了3.335 μg·g-1，‘Siberia’到第7天達(dá)到最低，下降了2.448 μg·g-1

接菌后高抗品種反應(yīng)較快，Pro質(zhì)量分?jǐn)?shù)迅速下降，高感品種下降較慢。

2.5.4 葉片可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)

由表4可知，接菌后第9天各抗感品種可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)均較接菌前上升。方差分析表明，接菌后第9天與接菌前相比，僅高抗品種‘Sorbonne’可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化差異顯著。接菌后，高抗品種‘Siberia’和‘Sorbonne’葉片可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化趨勢一致，均呈先上升后下降再上升的趨勢。而‘Constanta’則呈現(xiàn)先下降后上升再下降的趨勢，接菌后葉片可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)迅速下降，在第5天達(dá)到最低值，比接菌前顯著降低了50%，第7天達(dá)到最大值，顯著上升了51%；高感品種‘Francia’接菌后呈先降后升的趨勢，在第7天達(dá)到最大值。各抗感品種受病菌侵染后，可溶性糖在體內(nèi)積累，并隨侵染時間的延長，糖積累量增加，高抗品種積累較快，高感品種積累緩慢。

2.5.5 葉片可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)

由表4可知，接菌第9天各抗感品種可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)與接菌前質(zhì)量分?jǐn)?shù)相當(dāng)，且接菌后，各抗感品種可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)均變化平緩。方差分析表明，接菌后，在病菌脅迫時間水平上，各抗感品種可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)均差異不顯著。

2.5.6 SOD活性

由表4可知，接菌第9天各抗感品種SOD活性均較接菌前上升。方差分析表明，接菌后第9天與接菌前相比，各抗感品種SOD活性均差異顯著。接菌后，各抗感品種SOD活性均呈現(xiàn)先升后降的趨勢。高抗品種SOD活性迅速升高，其中‘Constanta’在第3天達(dá)到最大值，比接菌前上升了146.077 U·g-1，‘Sorbonne’和‘Siberia’在第5天達(dá)到最大值，比接種前分別上升了178.532和220.249 U·g-1；高感品種‘Francia’在第5天達(dá)到最大值，比接菌前上升了107.469 U·g-1。

2.5.7 POD活性

由表4可知，接菌第9天各抗感品種POD活性均較接菌前上升。方差分析表明，接菌后第9天與接菌前相比，各抗感品種POD活性均差異顯著。高抗品種‘Sorbonne’接菌后POD活性呈現(xiàn)先上升后下降再上升的趨勢，在第9天達(dá)到最大值，較接菌前顯著上升。其余各抗感品種POD活性均呈上升趨勢。接菌第9天各高抗品種比接菌前顯著上升了8.000～10.000 U·g-1·min-1，高感品種顯著上升了24.334 U·g-1·min-1。

2.5.8 CAT活性

由表4可知，接菌第9天各抗感品種CAT活性均較接菌前下降。方差分析表明，接菌后第9天與接菌前相比，高抗品種‘Constanta’和‘Siberia’ CAT活性差異顯著。接菌前，高抗品種葉片內(nèi)CAT活性顯著高于高感品種。接菌后各抗感品種CAT活性均呈現(xiàn)先升后降的規(guī)律，高抗品種CAT活性均在第3天達(dá)到最大值，之后持續(xù)下降至第9天達(dá)到最低值，顯著低于接菌前，且3個品種CAT活性相近；高感品種‘Francia’在第5天達(dá)到最大值，CAT活性比接菌前提高了4倍，在第7天后CAT活性與接菌前相當(dāng)，接菌前和接菌后第3天測定百合葉片CAT活性可作為鑒定抗感品種的指標(biāo)。

2.5.9 PAL活性

由表4可知，接菌后各抗感品種PAL活性總體較接菌前上升。方差分析表明，接菌后第9天與接菌前相比，各抗感品種PAL活性均差異不顯著。接菌后，高抗品種‘Siberia’和‘Sorbonne’ PAL活性呈先下降后上升的趨勢，分別于第3天和第7天PAL活性達(dá)到最低值，之后酶活性持續(xù)上升。高感品種‘Francia’PAL活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。接菌第9天各抗感品種PAL活性與接菌前相當(dāng)。

2.5.10 脫落酸(ABA)質(zhì)量分?jǐn)?shù)

由表4可知，接菌第9天各抗感品種ABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)均較接菌前上升。方差分析表明，接菌后第9天與接菌前相比，各抗感品種ABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)均差異顯著。接菌前，高感品種ABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于高抗品種。高抗品種‘Sorbonne’和高感品種‘Francia’接菌第7天后ABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)迅速上升，至第9天比接菌前分別顯著提高了1.99倍和3.45倍；高抗品種‘Constanta’和‘Siberia’ABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化則較為平緩。

表4 不同灰霉病菌脅迫時間下不同抗性東方百合品種各生理指標(biāo)

時 間Pro質(zhì)量分?jǐn)?shù)/μg·g-1‘索邦’‘康斯坦薩’‘西伯利亞’‘法蘭西’可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%‘索邦’‘康斯坦薩’‘西伯利亞’‘法蘭西’第1天(4.246±0.390)a(7.712±0.720)a(5.946±0.470)a(7.367±0.490)a(0.0029±0.0004)c(0.0065±0.0004)b(0.0045±0.0005)b(0.0047±0.0006)b第3天(4.336±0.460)a(4.377±0.470)b(3.811±0.470)b(6.604±0.480)ab(0.0057±0.0005)b(0.0050±0.0003)d(0.0069±0.0004)a(0.0039±0.0002)b第5天(4.073±0.480)a(5.289±0.510)b(3.687±0.490)b(6.234±0.390)ab(0.0050±0.0006)b(0.0032±0.0003)c(0.0045±0.0003)b(0.0039±0.0003)b第7天(3.581±0.500)a(4.427±0.500)b(3.498±0.350)b(5.626±0.480)b(0.0083±0.0003)a(0.0098±0.0006)a(0.0045±0.0003)b(0.0064±0.0003)a第9天(4.151±0.470)a(4.961±0.340)b(4.057±0.420)b(6.291±0.380)ab(0.0088±0.0008)a(0.0065±0.0002)b(0.0056±0.0006)ab(0.0051±0.0002)b

時 間可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)/mg·g-1‘索邦’‘康斯坦薩’‘西伯利亞’‘法蘭西’SOD活性/U·g-1‘索邦’‘康斯坦薩’‘西伯利亞’‘法蘭西’第1天(22.564±0.620)a(20.559±0.760)ab(21.703±0.600)a(22.133±1.230)a(75.732±0.620)e(82.158±0.880)e(30.293±0.750)e(91.336±1.120)e第3天(21.708±0.570)a(19.713±0.500)b(23.041±0.570)a(22.077±0.490)a(179.608±0.730)b(228.235±1.430)a(171.765±1.180)c(109.020±1.360)d第5天(22.041±0.860)a(20.99±0.590)ab(21.687±0.300)a(21.59±0.280)a(254.264±1.210)a(119.474±0.780)bc(250.542±0.470)a(198.805±0.930)a第7天(21.405±0.580)a(21.908±0.450)a(22.318±0.670)a(22.631±0.620)a(131.794±0.730)c(121.324±0.550)b(224.788±0.370)b(168.745±0.680)c第9天(21.467±0.490)a(21.215±0.520)ab(22.01±0.340)a(21.687±0.660)a(125.033±0.870)d(116.911±0.630)c(157.235±1.120)d(174.309±0.800)b

時 間POD活性/U·g-1·min-1‘索邦’‘康斯坦薩’‘西伯利亞’‘法蘭西’CAT活性/U·g-1‘索邦’‘康斯坦薩’‘西伯利亞’‘法蘭西’第1天(2.667±0.390)c(9.000±0.240)c(5.667±1.160)c(2.333±0.580)d(0.500±0.050)c(1.375±0.130)b(1.063±0.030)a(0.084±0.030)b第3天(8.333±0.380)b(9.333±0.960)c(10.333±0.940)b(3.529±0.690)cd(1.584±0.140)a(1.833±0.110)a(1.667±0.230)b(0.208±0.060)ab第5天(3.667±0.960)c(12.333±0.330)b(12.667±0.180)a(5.000±0.400)c(1.251±0.120)b(1.251±0.030)b(0.833±0.020)b(0.333±0.100)a第7天(7.445±0.060)b(11.667±0.220)b(10.000±0.100)b(9.333±0.380)b(0.584±0.040)c(0.833±0.040)c(0.333±0.090)c(0.084±0.020)b第9天(10.667±1.150)a(19.000±0.880)a(14.000±0.520)a(26.667±0.340)a(0.333±0.010)c(0.251±0.020)d(0.251±0.030)c(0.081±0.010)b

時 間PAL活性/U·g-1‘索邦’‘康斯坦薩’‘西伯利亞’‘法蘭西’GA質(zhì)量分?jǐn)?shù)/ng·g-1‘索邦’‘康斯坦薩’‘西伯利亞’‘法蘭西’第1天(34.972±0.460)a(36.972±0.290)c(34.472±0.590)a(45.056±0.370)bc(14.966±0.460)c(13.782±0.640)b(18.686±0.700)a(12.685±0.700)a第3天(35.861±0.090)a(49.667±0.330)b(27.722±0.740)c(49.639±0.360)a(10.824±0.360)d(13.644±0.600)b(10.046±0.580)c(10.949±0.500)ab第5天(30.583±0.760)b(49.194±0.470)b(31.333±0.490)b(45.806±0.470)b(11.213±0.430)d(15.135±0.630)b(10.392±0.640)c(9.043±0.640)c第7天(24.611±0.170)c(51.472±0.250)a(35.028±0.440)c(45.167±0.480)bc(16.773±0.180)b(15.400±0.680)b(13.193±0.690)b(9.911±0.630)bc第9天(35.861±0.230)a(37.944±0.570)c(35.889±0.290)a(44.056±0.550)c(19.641±0.420)a(21.643±0.360)a(8.650±0.610)c(11.778±0.310)ab

時 間IAA質(zhì)量分?jǐn)?shù)/ng·g-1‘索邦’‘康斯坦薩’‘西伯利亞’‘法蘭西’ABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)/ng·g-1‘索邦’‘康斯坦薩’‘西伯利亞’‘法蘭西’第1天(31.551±0.850)c(103.729±0.500)a(102.806±0.850)e(69.285±0.590)d(94.862±0.800)c(129.610±0.770)b(97.913±0.760)e(80.642±0.780)e第3天(27.538±0.780)d(55.557±0.530)b(145.186±1.290)b(74.225±0.660)c(83.021±0.550)d(124.129±0.720)c(133.559±0.640)b(97.596±1.170)d第5天(22.146±0.700)e(46.168±0.430)c(153.692±1.080)a(78.875±1.070)b(109.465±0.500)b(109.626±1.400)d(129.947±0.930)c(110.571±0.770)c第7天(35.297±0.990)b(56.276±0.560)b(128.782±0.820)c(53.794±0.500)e(107.611±0.800)b(140.990±0.340)a(137.144±0.620)a(144.971±0.500)b第9天(93.708±0.330)a(56.116±0.600)b(123.321±1.110)d(152.193±1.040)a(188.416±0.920)a(142.393±0.630)e(103.174±0.620)e(278.535±0.480)a

時 間ZR質(zhì)量分?jǐn)?shù)/ng·g-1‘索邦’‘康斯坦薩’‘西伯利亞’‘法蘭西’第1天(18.088±0.410)a(20.346±0.660)a(15.935±0.270)c(19.729±0.520)b第3天(15.810±0.440)bc(19.811±0.240)a(40.634±0.780)bc(20.202±0.640)b第5天(15.684±0.600)c(19.298±0.620)ab(19.314±0.470)b(19.766±0.400)b第7天(16.385±0.510)bc(17.881±0.500)bc(20.029±0.500)b(14.563±0.400)c第9天(16.059±0.660)b(17.286±0.650)c(19.099±0.800)b(35.622±0.270)a

2.5.11 赤霉素(GA)質(zhì)量分?jǐn)?shù)

由表4可知，接菌第9天各抗感品種GA質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化不一致。方差分析表明，接菌后第9天與接菌前相比，高抗品種GA質(zhì)量分?jǐn)?shù)均差異顯著。接菌后，高抗品種‘Siberia’ GA質(zhì)量分?jǐn)?shù)總體呈下降趨勢，至第9天較接菌前顯著下降了10.036 ng·g-1，高抗品種‘Constanta’和‘Sorbonne’均呈上升趨勢，至第9天分別顯著上升了7.861 ng·g-1和4.675 ng·g-1；高感品種‘Francia’ GA質(zhì)量分?jǐn)?shù)先降后升，第5天達(dá)到最低值，較接菌前顯著下降了3.642 ng·g-1，其GA質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化比高抗品種平緩。

2.5.12 生長素(IAA)質(zhì)量分?jǐn)?shù)

由表4可知，接菌第9天除高抗品種‘Constanta’ IAA質(zhì)量分?jǐn)?shù)較接菌前下降，其余各品種均較接菌前上升。方差分析表明，接菌后第9天與接菌前相比，各抗感品種IAA質(zhì)量分?jǐn)?shù)均差異顯著。接菌后，高抗品種‘Sorbonne’和高感品種‘Francia’IAA質(zhì)量分?jǐn)?shù)總體呈上升趨勢，至第9天分別是接菌前的2.970倍和2.300倍。接菌后‘Sorbonne’在第7天IAA質(zhì)量分?jǐn)?shù)迅速上升，高抗品種‘Siberia’和‘Constanta’接菌后IAA質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別呈先上升再下降和先下降再上升的趨勢，在第5天分別達(dá)到最大值和最小值。

2.5.13 玉米素核苷(ZR)質(zhì)量分?jǐn)?shù)

由表4可知，接菌第9天高抗品種‘Siberia’和高感品種‘Francia’ ZR質(zhì)量分?jǐn)?shù)較接菌前上升，其余品種均較接菌前下降。方差分析表明，接菌后第9天與接菌前相比，各抗感品種ZR質(zhì)量分?jǐn)?shù)間均差異顯著。‘Constanta’和‘Sorbonne’接菌前后ZR質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化較小，而‘Siberia’接菌后ZR質(zhì)量分?jǐn)?shù)迅速上升，至第3天達(dá)到最大值，是接菌前的2.55倍，而后又迅速下降，第5天后葉片ZR質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化較小。接菌第9天3個品種ZR質(zhì)量分?jǐn)?shù)接近。

2.6 各抗性指標(biāo)相關(guān)性及主成分分析

單一指標(biāo)不能完全反應(yīng)植物抗病能力大小，且各指標(biāo)之間既不完全獨(dú)立，也不完全相關(guān)，為彌補(bǔ)單一指標(biāo)對百合抗病能力評定產(chǎn)生的片面性，對各指標(biāo)反映出的物種間的差異進(jìn)行主成分分析，從而提取少數(shù)幾個相對獨(dú)立的綜合指標(biāo)最大程度反映原有指標(biāo)提供的物種之間差異。各單一指標(biāo)的相關(guān)系數(shù)矩陣見表5。

由表5可知，可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)與GA質(zhì)量分?jǐn)?shù)之間呈顯著正相關(guān)；RE，C與Pro質(zhì)量分?jǐn)?shù)間、RE，C與ABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)間以及Pro質(zhì)量分?jǐn)?shù)與ABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)間分別達(dá)極顯著正相關(guān)。通過對百合灰霉病抗病指標(biāo)相關(guān)性分析，篩選出與抗病能力相關(guān)性強(qiáng)的指標(biāo)，對其進(jìn)行主成分分析。主成分分析可以簡化原有復(fù)雜數(shù)據(jù)，實(shí)現(xiàn)指標(biāo)降維，各指標(biāo)主成分分析見表6。

由表6可知，東方百合在整個脅迫期共有3個主成分入選，累計方差貢獻(xiàn)率達(dá)100%，說明這3個主成分代表的信息已經(jīng)把這幾種東方百合對灰霉菌抗性信息100%表達(dá)出來了。第一主成分的貢獻(xiàn)率為44.266%，主要包括RE，C和Pro質(zhì)量分?jǐn)?shù)，PAL活性，ABA、IAA和ZR質(zhì)量分?jǐn)?shù)表達(dá)的信息；第二主成分的貢獻(xiàn)率為34.848%，主要包括RE，C和Pro質(zhì)量分?jǐn)?shù)，POD、PAL活性以及ABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)表達(dá)的信息；第三主成分的貢獻(xiàn)率為20.886%，主要包括MDA質(zhì)量摩爾濃度，POD活性，IAA、ZR質(zhì)量分?jǐn)?shù)表達(dá)的信息；從貢獻(xiàn)率來看，各主成分依次遞減，說明各主成分代表的信息重要性遞減。

從貢獻(xiàn)率來看，各主成分間貢獻(xiàn)率相差不大，說明東方百合對灰霉病的抗性是各種指標(biāo)綜合反映的結(jié)果，不能相互替代。

3 結(jié)論與討論

植物受到脅迫時，膜的結(jié)構(gòu)和功能會遭到破壞，膜透性增大，從而使細(xì)胞內(nèi)的電解質(zhì)外滲，以致RE，C增大。同時脅迫會導(dǎo)致膜脂過氧化作用增強(qiáng)，MDA為膜脂過氧化的最終產(chǎn)物[13]，它的高低可反映植物在逆境下的受害程度。本試驗結(jié)果顯示，各高抗品種接菌后MDA質(zhì)量摩爾濃度均迅速上升，且葉片RE，C和MDA質(zhì)量摩爾濃度變化同步，與前人研究結(jié)果一致[14]。接菌后，高抗品種對脅迫反應(yīng)敏感，而高感品種對脅迫反應(yīng)相對滯后，多在染病后的第5～第7天內(nèi)表現(xiàn)出明顯不同。

脅迫條件下，植物體內(nèi)大量積累的Pro是主要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一，能提高植物抗逆性[15]。本研究中，各抗感品種在接菌后，Pro質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈下降趨勢，與以往文獻(xiàn)報道有較大差異[16-17]。在最初的5 d高抗品種葉片Pro質(zhì)量分?jǐn)?shù)的下降幅度大于高感品種，說明可能該品種對灰霉病的抗性與葉片Pro質(zhì)量分?jǐn)?shù)無關(guān)，其抗性強(qiáng)弱可能取決于病菌入侵后的應(yīng)激反應(yīng)，高抗品種反應(yīng)快，高感品種反應(yīng)慢，其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

可溶性糖也是植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，因而，在植物抗性生理試驗中常被用作指標(biāo)加以測定。本研究結(jié)果顯示，高抗品種受侵染后，防衛(wèi)反應(yīng)比高感品種迅速，代謝速度加快，使糖主要供給植物的生長，增強(qiáng)其抗性。但其變化規(guī)律呈波動式上升，與前人研究的變化規(guī)律不同[18-19]，這可能是由于百合在受灰霉菌侵染初期會產(chǎn)生一種應(yīng)激性反應(yīng)，隨脅迫時間的延長，植物適應(yīng)這種環(huán)境后，就會誘導(dǎo)細(xì)胞可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高，從而有利于提高其抗性。

植物受到病害脅迫后，會導(dǎo)致體內(nèi)活性氧代謝失調(diào)。這時體內(nèi)的保護(hù)酶系就會發(fā)揮作用，減輕脅迫給植物帶來的傷害。研究表明，它們在植物體內(nèi)發(fā)揮作用不是單一的，而是彼此協(xié)同發(fā)揮清除活性氧的作用，因此應(yīng)綜合考慮其作用[20]。

本試驗結(jié)果表明，侵染后，高抗品種SOD活性被迅速激活上升，以清除或阻止病原菌造成的傷害，高感品種SOD活性上升較慢。隨著脅迫時間的延長，活性氧積累加劇了對保護(hù)酶系的損害，SOD活性開始下降。植物體內(nèi)SOD活性先上升后下降的過程與劉佳等[21]研究規(guī)律一致。

接菌后，高感品種葉片POD活性比高抗品種增強(qiáng)的幅度大，說明高感品種受病原菌侵染后產(chǎn)生較多的自由基，比高抗品種更易受病菌脅迫。接菌后各抗感品種體內(nèi)的POD活性均呈上升趨勢，與一般研究規(guī)律一致[22-23]，但相對SOD活性變化具有滯后性，這可能是由于SOD是植物受侵染后發(fā)揮抵抗作用的第一道防護(hù)所致，并且POD能將SOD酶促反應(yīng)終產(chǎn)物H2O2有效分解清除。

CAT活性初期上升可能是植物的一種應(yīng)激反應(yīng)，而后CAT活性均下降，說明隨脅迫時間的延長酶調(diào)節(jié)能力有限。脅迫后期，各抗感品種酶活性均比接種前低，預(yù)示著細(xì)胞的衰老死亡。接菌后高抗品種CAT活性高于高感品種，且上升快，與李方方等[24]研究結(jié)果一致。

植物激素具有質(zhì)量分?jǐn)?shù)低但對植物生長發(fā)育具有重大作用的特點(diǎn)。接菌后，植物激素質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化無規(guī)律性，這可能與品種類型、激素的合成部位和運(yùn)輸方式等有關(guān)。同時植物激素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加是病菌侵染后刺激植物合成的，還是病菌自身合成的，還是二者兼有都有待做進(jìn)一步的驗證。

綜上所述，東方百合各抗感品種接菌后各生理指標(biāo)變化不完全一致，且測定接菌前和接菌后第3天MDA質(zhì)量摩爾濃度和CAT活性可作為初步鑒定抗感品種的生理指標(biāo)。由方差分析可以看出，各抗感品種的RE，C，SOD、POD活性，ABA、IAA、ZR質(zhì)量分?jǐn)?shù)以及高抗品種的可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)、CAT活性、GA質(zhì)量分?jǐn)?shù)在時間水平上的變化均達(dá)顯著水平；而高感和高抗品種間除了MDA質(zhì)量摩爾濃度，可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)未達(dá)極顯著水平，其余指標(biāo)均達(dá)極顯著水平。各抗性指標(biāo)相關(guān)性及主成分分析顯示，東方百合在整個脅迫期共有3個主成分入選；從貢獻(xiàn)率來看，各主成分間貢獻(xiàn)率相差不大。因此，可以推測不同東方百合品種對灰霉病的抗性并不是單一指標(biāo)作用的結(jié)果，可能是多種生理反應(yīng)協(xié)同作用的結(jié)果，要想全面了解百合灰霉病的生理生化機(jī)制，還需要作進(jìn)一步的探討研究。