‘高原之火’北美海棠葉片組培快繁再生體系1)

王瑞敏 沈瑒 陳穎 馮凱 張濤 陳燕瓊 楊華

(南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心(南京林業(yè)大學)，南京，210037)

北美海棠(Northamericartbegonia)屬薔薇科蘋果屬，大部分是由美國和加拿大育種者從雜交海棠中選育出來的，引入國內(nèi)，因而稱其為北美海棠[1]。北美海棠品種繁多，由于其花色、果色和枝色豐富，成為重要的木本觀賞性植物。

‘高原之火’北美海棠(Malus‘Prairfire’)是從北美洲引進的落葉小喬木，新葉亮酒紅色，成熟葉呈橄欖綠色，深秋葉又變酒紅色。花深紫紅色,燈籠形果亮紅色，可掛果至次年3月份。該品種具有較強的抗病、抗旱和耐寒性能，既可作盆花，也可做行道樹，是集觀花、觀果、觀葉于一體的優(yōu)良精品樹種之一[2-3]。

由于‘高原之火’北美海棠從國外引進，種子較少，且采用種子繁殖存在品種變異大、周期長等缺點，現(xiàn)大部分通過嫁接和扦插繁殖，但由于受季節(jié)、接穗和插條數(shù)量的限制，繁殖規(guī)模受到影響，因而限制了該品種的推廣栽培。采用組織培養(yǎng)快速繁殖的方法，可在短時間內(nèi)獲得大量無性系優(yōu)良苗木，滿足工廠化生產(chǎn)需要。有關北美海棠組培快繁有一些研究，如趙志新[1]和黃俊軒等[4]進行了有關北美海棠增殖培養(yǎng)研究；蔡鴻宇等[5]通過初代培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)、生根培養(yǎng)及煉苗獲得海棠再生植株。但這些研究大部分集中于北美海棠腋芽的誘導再生，且大多數(shù)作者沒有指明是什么品種，目前還沒有發(fā)現(xiàn)有關‘高原之火’北美海棠的葉片再生植株的報道。

本研究以北美海棠‘高原之火’幼葉為外植體，通過誘導不定芽增殖和生根建立葉片不定芽再生體系，并通過細胞學觀察葉片不定芽再生的細胞分化過程，探討‘高原之火’北美海棠不定芽發(fā)育的起源方式，為優(yōu)質(zhì)品種‘高原之火’北美海棠苗木推廣和培育，以及海棠品種遺傳轉化體系的建立提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

材料來源于南京林業(yè)大學實驗教學基地內(nèi)的3年生‘高原之火’北美海棠。

1.2 腋芽或頂芽的誘導

4月份選取當年新萌生的長5 cm枝條嫩梢為外植體，清洗干凈后進行二次消毒處理。先用75%酒精對外植體浸泡30 s，無菌水沖洗3～4次后，再用0.3%高錳酸鉀溶液浸泡25 min，期間不斷攪拌，消毒完成后用無菌水清洗4～5次，無菌濾紙吸干表面水分，將嫩梢剪成1～2 cm帶芽的莖段，接種在MT+1.00 mg·L-1BA+0.20 mg·L-1IBA的腋芽誘導培養(yǎng)基上培養(yǎng)40 d，以新抽出芽上的葉片作為不定芽誘導外植體的來源。

1.3 葉片愈傷組織的誘導與分化

取經(jīng)無菌條件下新誘導嫩梢上的葉片，無菌條件下將葉片切成約0.5 cm2的小塊，接種在添加不同調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基上，進行葉片愈傷組織的誘導，葉片背面朝下。其中噻苯隆(TDZ)設置0.10、0.12和0.15 mg·L-13個水平，α-萘乙酸(NAA)設置0.5、1.0、1.5 mg·L-13個水平。每個處理5瓶，每瓶5個外植體，3次重復。暗培養(yǎng)17 d后，統(tǒng)計愈傷組織誘導及生長情況。

將暗處培養(yǎng)17 d的外植體轉到光下再培養(yǎng)28 d后,統(tǒng)計愈傷組織分化不定芽情況，統(tǒng)計每瓶的不定芽數(shù)。

1.4 不定芽的增殖與壯苗培養(yǎng)

將上述帶芽愈傷組織再繼續(xù)培養(yǎng)15 d后，將其切割成2 cm3左右的帶芽組織塊接種在上述篩選出的最優(yōu)培養(yǎng)基上，繼續(xù)培養(yǎng)30 d，發(fā)現(xiàn)不定芽愈傷化、膨化嚴重，于是又進行基本培養(yǎng)基和調(diào)節(jié)劑的篩選。以MS、1/2MS和MT 3種基本培養(yǎng)基，設置6-BA 1.0、1.5、2.0 mg·L-13個水平；IBA 0.2、0.5、1.0 mg·L-13個水平。每個處理5瓶，每瓶3個外植體，3次重復。30 d后統(tǒng)計長度大于5 mm的不定芽數(shù)及不定芽的長勢情況。

1.5 芽苗的生根及馴化移栽

對長至3 cm以上的試管芽苗進行不定根的誘導，以MS、1/2MS和1/4MS為基本培養(yǎng)基，設置IBA 0.2、0.5、1.0 mg·L-13個水平。另外，對選擇出最優(yōu)1/4MS培養(yǎng)基的基礎上，添加3個質(zhì)量濃度的活性碳處理。每個處理5瓶，每瓶3個芽，3次重復，40 d后統(tǒng)計生根率及平均生根數(shù)。

生根的小苗長至5～6 cm、5～6條根時進行馴化移栽。將小苗從瓶中取出洗去根部培養(yǎng)基，移入裝有基質(zhì)(V(蛭石)∶V(有機土)∶V(林下土)=1∶1∶1)的容器中，小苗上部用帶孔透明的塑料薄膜遮蓋，15 d后去除，苗木成活。

以上培養(yǎng)基中除特殊說明外，內(nèi)含3%蔗糖(生根2%)、6.0 g·L-1瓊脂，pH值5.8；培養(yǎng)室溫度為(25±2)℃，光/暗時間為14 h/10 h(暗培養(yǎng)除外)，光合有效輻射55 μmol·m-2·s-1。

1.6 測定指標的計算公式

愈傷組織誘導率=(誘導出愈傷的葉片數(shù)/每個重復接種數(shù))×100%。

不定芽分化率=(分化的愈傷組織數(shù)/每個重復接種數(shù))×100%。

增殖系數(shù)=接種后增加的不定芽數(shù)/接種時芽數(shù)。

生根率=(生根的芽苗數(shù)/接種時芽數(shù))×100%。

1.7 組織細胞學觀察

選取不同發(fā)育階段的愈傷組織為材料，參照王灶安[6]法，將外植體切成0.5 mm3的樣品，用FAA固定液(體積分數(shù)為38%甲醛5 mL+冰醋酸5 mL+體積分數(shù)為50%酒精90 mL)進行固定，常規(guī)石蠟制片法制片，番紅固綠染色，Leica BME徠卡光學顯微鏡觀察拍照。

1.8 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010與SPSS 20.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析，多重比較采用Duncan’s法，不同字母表示同一處理間差異達顯著水平(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 葉片愈傷組織的誘導

將無菌培養(yǎng)40 d的‘高原之火’北美海棠嫩梢上的葉片剪成0.5 cm2，接種在添加不同質(zhì)量濃度TDZ和NAA的培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)7 d后，發(fā)現(xiàn)葉片的切口邊緣向外翹起，并出現(xiàn)少量白色愈傷組織，17 d開始大量白色愈傷組織(圖1A)伴有少量不定芽的出現(xiàn)(圖1B)。由表1可以看出，不同質(zhì)量濃度TDZ和NAA組合下葉片愈傷組織誘導率出現(xiàn)顯著性差異(P<0.05)，其中愈傷組織在MS+0.15 mg·L-1TDZ+1.5 mg·L-1NAA培養(yǎng)基上愈傷組織誘導率最高，達80.0%，其誘導的愈傷組織表面濕潤，質(zhì)地疏松，蓋滿葉部，生活力強。MS+0.12 mg·L-1TDZ+0.5 mg·L-1NAA及MS+0.15 mg·L-1TDZ+0.5 mg·L-1NAA次之。以TDZ和NAA二因素和三水平進行正交試驗，通過極差分析，發(fā)現(xiàn)TDZ的極差R3(0.93)>NAA的極差R3(0.40)，表明TDZ對愈傷誘導率的影響大于NAA，隨著TDZ質(zhì)量濃度的升高，誘導率越大，當TDZ質(zhì)量濃度提高至0.15 mg·L-1時，愈傷組織誘導率都比較高。而1.5 mg·L-1NAA對葉片愈傷組織誘導更有利。綜合各培養(yǎng)處理的效果可得出，葉片愈傷組織誘導的最佳培養(yǎng)基為MS+0.15 mg·L-1TDZ+1.5 mg·L-1NAA。

表1 不同TDZ和NAA組合對‘高原之火’北美海棠葉片愈傷組織誘導的影響

2.2 葉片愈傷組織不定芽的分化

將暗處培養(yǎng)17 d的外植體轉到光下再培養(yǎng)28 d后，可觀察到大量嫩白小芽出現(xiàn)在愈傷組織表面(圖1C)。從表2可看出，不同TDZ和NAA質(zhì)量濃度組合下，不定芽分化率出現(xiàn)差異，在1號、3～6號、9號培養(yǎng)基上生長的愈傷組織分化不定芽的能力較弱，只有10%左右，這些培養(yǎng)基之間不定芽分化率和不定芽數(shù)不存在顯著差異(P>0.05)。2號培養(yǎng)基盡管誘導愈傷組織的能力較強(55.6%)，但不定芽分化率最低，產(chǎn)生大量蓬松的愈傷組織。而7號培養(yǎng)基，即MS+0.15 mg·L-1TDZ+0.5 mg·L-1NAA不定芽分化率最高，達60.0%，每塊葉片愈傷組織分化不定芽數(shù)達18.8個，不定芽長勢好；8號培養(yǎng)基MS+0.15 mg·L-1TDZ+1.0 mg·L-1NAA培養(yǎng)基次之，不定芽分化率達42.2%，每塊葉片愈傷組織分化不定芽數(shù)達14.0個。質(zhì)量濃度0.15 mg·L-1是3個TDZ處理中愈傷組織分化數(shù)較高的，同時，NAA中0.5 mg·L-1最好，提高NAA質(zhì)量濃度愈傷組織分化數(shù)下降。

表2 不同質(zhì)量濃度TDZ和NAA組合對‘高原之火’北美海棠愈傷組織不定芽分化的影響

2.3 穩(wěn)定不定芽的增殖體系建立與壯苗培養(yǎng)

將上述帶芽愈傷組織塊(圖1C)切割成2 cm3左右的小塊(沿芽叢邊緣切割)，接種在篩選出的MS+0.15 mg·L-1TDZ+0.5 mg·L-1NAA的最優(yōu)不定芽誘導培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)30 d，芽叢繼續(xù)增殖(圖1D)，但發(fā)現(xiàn)TDZ和NAA組合盡管有利于不定芽的誘導，但繼代時間久了不定芽會出現(xiàn)膨化、畸形等情況，不利于不定芽的增殖和壯苗(圖1D～F)。因此，為獲得正常和穩(wěn)定增殖的不定芽苗，將芽叢切割后繼代在6-BA和IBA組合的培養(yǎng)基上再培養(yǎng)30 d后，不定芽逐漸長成正常苗(圖1G、H)。由表3可看出，不同基本培養(yǎng)基MS、1/2MS和MT，以及6-BA、IBA質(zhì)量濃度的不同，繼代后的不定芽數(shù)和增殖系數(shù)出現(xiàn)差異(P<0.01)。3個基本培養(yǎng)基中1/2MS培養(yǎng)基中不定芽數(shù)量多，芽苗健壯，最適合增殖與壯苗，而在高鹽的MS培養(yǎng)基上生長的不定芽苗細長，在MT培養(yǎng)基的不定芽數(shù)量較少，芽苗粗而短。不定芽增殖和壯苗最適合的培養(yǎng)基是1/2MS+0.5 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1IBA及1/2MS+1.0 mg·L-16-BA+1.0 mg·L-1IBA，每瓶正常不定芽數(shù)量可達10.2和9.2個，增殖系數(shù)達3.40和3.07。6-BA質(zhì)量濃度1.0 mg·L-1芽增殖系數(shù)最高。以后的不定芽增殖可以根據(jù)上述最優(yōu)配方為基礎，實現(xiàn)不定芽苗的不斷增殖，30 d可以增殖3倍以上。

表3 不同培養(yǎng)基和生長調(diào)節(jié)劑對葉片不定芽苗增殖的影響

2.4 試管苗的生根與練苗移栽

選取上述培養(yǎng)基上長至3 cm以上的不定芽進行生根培養(yǎng)(剩下的小芽繼續(xù)增殖培養(yǎng))，20 d后開始有輻射狀粉白色根長出。由表4可以看出(培養(yǎng)40 d統(tǒng)計)，培養(yǎng)基的鹽分高低對‘高原之火’北美海棠不定根發(fā)生影響較大，在1/2MS和MS的生根率都很低，MS培養(yǎng)基幾乎不能誘導出不定根(最高只有6.7%)；而1/4MS培養(yǎng)基效果最好，說明‘高原之火’北美海棠不定根發(fā)生不需要較高質(zhì)量濃度的鹽分，從添加IBA的質(zhì)量濃度來看，1.0 mg·L-1IBA效果最好，最高生根率達75.0%。在1/4MS+1.0 mg·L-1IBA的基礎上添加不同質(zhì)量分數(shù)的活性炭，發(fā)現(xiàn)質(zhì)量分數(shù)為0.15%活性炭對不定根生長最好，生根率最高，達86.7%(表4)。

生根的小苗長至5～6 cm、根5～6條時進行馴化移栽。將小苗從瓶中取出洗去根部培養(yǎng)基，移入裝有基質(zhì)(V(蛭石)∶V(有機土)∶V(林下土)=1∶1∶1)的容器中，小苗上部用帶孔透明的塑料薄膜遮蓋，每隔2 d澆1次水，1周澆1次1/4 Haogland營養(yǎng)液，15 d后苗木成活，去除薄膜后繼續(xù)培養(yǎng)30 d生長健壯(圖2)，成活率在80%以上。

表4 不同培養(yǎng)基、不同質(zhì)量濃度IBA及活性炭質(zhì)量分數(shù)對不定芽苗生根的影響

2.5 葉片不定芽形成過程的細胞學觀察

‘高原之火’北美海棠的葉片經(jīng)暗培養(yǎng)7 d出現(xiàn)嫩白愈傷組織，細胞排列整齊(圖3A)，15 d后表皮細胞開始平周分裂，形成凸起(圖3B)；從圖3中可以看出，‘高原之火’北美海棠不定芽起源有兩種形式，一種為外起源式，芽原基由愈傷組織表皮細胞或皮下組織形成分生細胞團，不斷增殖形成不定芽(圖3C)，繼續(xù)培養(yǎng)在愈傷表面形成芽體(圖3D)。

葉片不定芽發(fā)生另一種起源方式為內(nèi)起源式，不定芽起源于組織深處維管束鞘形成層細胞內(nèi)部，其薄壁細胞脫分化形成分生細團(圖4A、B)，即“生長中心”，分生細胞團細胞橫向伸長逐漸分化成層狀細胞(圖4A、B)，細胞團變長圓錐形芽原基(圖4C、D),芽原基逐漸發(fā)育成不定芽(圖4E、F)。

3 結論與討論

“高原之火”北美海棠是一種極具開發(fā)價值的觀賞品種，本研究建立的葉片再生體系為該品種擴大繁殖、滿足市場的需求提供基礎。在葉片誘導不定芽的過程中有2種方式，一種是直接在葉片上產(chǎn)生不定芽的直接再生，一種是產(chǎn)生愈傷組織再在愈傷組織中分化出不定芽的間接再生[7]，‘高原之火’北美海棠屬于后一種類型，即愈傷組織誘導的間接型。在薔薇科植物的組織培養(yǎng)中，初期的黑暗培養(yǎng)對薔薇科植物葉片脫分化及不定芽誘導起著至關重要的作用[8-10]，啟動初期最優(yōu)暗培養(yǎng)期為3～7 d[11-12]。不同植物最佳暗光交替時間也有所差異，齊向麗等[13]對‘紅國王’葡萄的莖段培養(yǎng)試驗中發(fā)現(xiàn)最佳黑暗誘導時間為10 d；趙麗蒙[14]發(fā)現(xiàn)，衛(wèi)矛雌蕊暗培養(yǎng)20 d處理后愈傷組織誘導率高；吳雅琴等[15]發(fā)現(xiàn)，13～16 d的暗培養(yǎng)才能使昌紅蘋果(Malusdomestica‘Changhong’)葉片誘導出不定芽；王禹等[16]發(fā)現(xiàn)，弱光培養(yǎng)可促進麗格海棠葉片不定芽再生。本研究中‘高原之火’北美海棠的葉片在光下預培養(yǎng)沒有誘導出不定芽，改變培養(yǎng)方式為暗培養(yǎng)后，第7天可誘導出生活力旺盛的幼嫩白色愈傷，至15 d時大量的愈傷組織長出，該結果與趙麗蒙[14]及梁月香等[17]的結論相似。

不同激素種類及配比決定了離體器官的分化方向，適宜的激素配比是誘導離體器官高效再生的先決條件。不同科的植物愈傷組織及不定芽的誘導效率對調(diào)節(jié)劑的質(zhì)量濃度和種類的要求差異很大。薔薇屬植物不定芽再生受TDZ影響較大[16，18]，TDZ可以刺激植物組織再生，誘導不定芽的形成[19]。當培養(yǎng)基中TDZ質(zhì)量濃度較低時，誘導不定芽再生效果不明顯，過高則對愈傷組織及不定芽有一定的毒害作用，促進乙稀的生成而表現(xiàn)為葉片脫落[20]。本研究中愈傷組織誘導最佳培養(yǎng)基為MS+0.15 mg·L-1TDZ+1.5 mg·L-1NAA，細胞分裂素TDZ對愈傷誘導的作用大于生長素NAA，此結果與王晨璐等[21]在甜椒上的結論相符。

近年來，國內(nèi)外學者報道了許多關于不定芽發(fā)生的研究成果[22-24]，但在外植體不定芽發(fā)生的途徑及起源這2個方面有很大的意見分歧。田春英[25]對紅富士蘋果不定芽再生的研究中發(fā)現(xiàn)不定芽發(fā)生在切口周圍的葉脈和葉肉細胞，一部分表皮細胞也進行不定芽再生，由此認為，紅富士蘋果以多起源的方式進行不定芽再生。陳瑤等[26]對八角蓮(組織培養(yǎng)產(chǎn)生的不定芽細胞組織學觀察發(fā)現(xiàn)，芽原基起源于愈傷組織外側的幾層薄壁細胞,芽原基背離愈傷組織中央生長形成不定芽，起源方式為外起源。王曉玲等[27]對草莓不定芽的研究中認為，其不定芽都為外起源。本研究中，‘高原之火’北美海棠的葉片經(jīng)過暗培養(yǎng)7 d后切口邊緣開始出現(xiàn)嫩白愈傷組織，轉到光照培養(yǎng)17 d后，大部分愈傷組織團邊緣開始出現(xiàn)嫩黃小芽點，再培養(yǎng)13 d后，可觀察到大量芽體出現(xiàn)在愈傷表面。從切片觀察來看，‘高原之火’北美海棠不定芽的起源存在2種方式，一種是從表皮下皮層薄壁細胞發(fā)育的外源式，一種起源于形成層細胞，發(fā)育成不定芽為內(nèi)起源式，從切片結果看，‘高原之火’北美海棠不定芽內(nèi)起源式為主要方式。

綜上所述，本研究以‘高原之火’北美海棠葉片為外植體建立了其不定芽再生的快繁體系，不定芽增殖系數(shù)達3.4，每瓶不定芽增加數(shù)達10.2個以上，不定芽生根率達86.7%，移栽成活率達80%以上。通過對葉片愈傷組織不定芽分化過程中的細胞學觀察發(fā)現(xiàn)，‘高原之火’北美海棠不定芽起源為混合型，其中內(nèi)起源為主要方式。本研究為北美海棠新品種的繁育，滿足市場對苗木的需求提供了技術支持。