鱘魚(yú)硫酸軟骨素對(duì)結(jié)直腸癌患病小鼠腸道菌群的影響

武瑞赟,馬儷珍,李平蘭,

（1.北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類(lèi)健康高精尖創(chuàng)新中心,中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院,北京 100083；2.天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院,天津 300384）

在人和動(dòng)物腸道內(nèi)寄居有大量細(xì)菌、病毒等復(fù)雜的微生物群體[1],宿主腸道和這些微生物建立起密不可分的共生關(guān)系,宿主腸道為微生物群體提供營(yíng)養(yǎng)和生存場(chǎng)所[2-3],同時(shí)這些微生物也對(duì)宿主的營(yíng)養(yǎng)、代謝和免疫功能調(diào)節(jié)發(fā)揮重要作用[4-5]。因此,它們之間的相互作用研究成為逐漸興起的熱點(diǎn)。伴隨著美國(guó)“人類(lèi)微生物組計(jì)劃”和歐盟“MetaHit計(jì)劃”的完成,人們已對(duì)寄居在遠(yuǎn)端腸道內(nèi)的復(fù)雜微生物生態(tài)系統(tǒng)有了更深入的了解[6],近年來(lái),越來(lái)越多的證據(jù)表明,腸道微生物的關(guān)鍵生理作用與機(jī)體之間有著密切關(guān)系[7-9],特別是在宿主健康和疾病中發(fā)揮著重要作用[10-12],如Lee等[13]發(fā)現(xiàn)人體中菌群的改變與人乳頭瘤病毒的感染有關(guān)。

腸道微生物是指寄居在機(jī)體消化道的數(shù)以萬(wàn)億計(jì)的微生物[14-15]。它們按照一定比例組合在一起,相互依存、制約、共生,形成相對(duì)穩(wěn)定的腸道微生態(tài)[16-19]。個(gè)體之間菌群數(shù)量、結(jié)構(gòu)、豐度及生理狀態(tài)均存在差異[20]。在正常腸道微生物菌群中,擬桿菌門(mén)及厚壁菌門(mén)最多,約占90%[21],其他較少的門(mén)類(lèi)菌群有放線(xiàn)菌門(mén)[22]、變形菌門(mén)[23]等。腸道菌群可寄居于不同部位,通過(guò)特定菌群結(jié)構(gòu)、活動(dòng)、代謝產(chǎn)物等共同影響機(jī)體的代謝,維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。但是腸道菌群與宿主之間存在密切的互利共生關(guān)系,菌群的穩(wěn)定與宿主年齡、遺傳背景、飲食、生活環(huán)境等相關(guān),反過(guò)來(lái),宿主能影響腸道菌群的結(jié)構(gòu)和功能,而腸道菌群也可通過(guò)其特有的功能屬性,影響宿主的生長(zhǎng)代謝[24],Chaplin等[25]通過(guò)分析在高脂肪飲食下接受鈣補(bǔ)充的C57BL/6J小鼠中的腸道微生物群,并確定其與宿主代謝的關(guān)系。

結(jié)直腸是人體中重要的消化器官,具有消化、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝以及貯存食物殘?jiān)淖饔?。但?由于食物殘?jiān)约按x產(chǎn)生的一些酸類(lèi)、酚類(lèi)等致癌物,使得腸屏障的完整性、免疫系統(tǒng)等受到了侵襲和破壞,增加了結(jié)直腸癌的患病風(fēng)險(xiǎn)。結(jié)直腸癌是常見(jiàn)的一類(lèi)以體質(zhì)量減輕、嚴(yán)重腹瀉以及腹痛為典型性特征的慢性和復(fù)發(fā)性消化道疾病[26-27],一般發(fā)生在回腸、結(jié)腸和直腸處。

目前結(jié)直腸癌的詳細(xì)致病機(jī)制尚不清楚,腸道微生物[28-30]、腸上皮屏障以及腸免疫系統(tǒng)構(gòu)成的穩(wěn)態(tài)失調(diào)可能是影響結(jié)直腸癌發(fā)生的關(guān)鍵因素[31]。前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),鱘魚(yú)硫酸軟骨素具有抑制結(jié)直腸癌腫瘤細(xì)胞增殖的作用[32]。因此,本實(shí)驗(yàn)以結(jié)直腸癌小鼠為模型,通過(guò)對(duì)小鼠腸道內(nèi)容物的細(xì)菌菌群多樣性進(jìn)行分析,探究鱘魚(yú)硫酸軟骨素對(duì)結(jié)直腸癌患病小鼠腸道菌群的影響,研究結(jié)果為開(kāi)發(fā)以鱘魚(yú)軟骨素為基礎(chǔ)的膳食營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑以預(yù)防和降低結(jié)直腸癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

鱘魚(yú)硫酸軟骨素由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院應(yīng)用微生物實(shí)驗(yàn)室制備；雄性BALB/c裸鼠（生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0006） 北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；瓊脂糖 美國(guó)Sigma公司；DNA DL2000 Marker 北京艾德萊生物科技有限公司；氯仿、異丙醇、乙醇 北京化學(xué)工業(yè)集團(tuán)有限公司；糞便基因組提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

超低溫冰箱 海爾集團(tuán)公司；SCL-1300垂直流潔凈工作臺(tái) 北京賽伯樂(lè)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；GB303電子天平梅特勒-托利多（上海）集團(tuán)；4200型凝膠成像系統(tǒng) 上海天能科技有限公司；BG-power300電泳儀 北京百晶生物科技有限公司；GL-206低速離心機(jī) 湖南平凡儀器儀表有限公司；1658001型垂直電泳槽 美國(guó)伯樂(lè)公司；HiSeq測(cè)序儀 美國(guó)Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物的分組和處理

SPF級(jí)健康的5 周齡雄性BALB/c裸鼠飼養(yǎng)于北京市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,按照SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的要求在屏障環(huán)境中進(jìn)行飼養(yǎng)和管理。

飼養(yǎng)條件：動(dòng)物房溫度為（22±2）℃,相對(duì)濕度為（50±10）%,嚴(yán)格按照12 h光照/黑暗循環(huán),實(shí)驗(yàn)鼠進(jìn)行自由采食和進(jìn)水。

BALB/c裸鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后,隨機(jī)分為6 組,每組10 只,采用皮下注射結(jié)直腸癌細(xì)胞的方法建立結(jié)直腸癌模型小鼠,注射兩周后,瘤組織體積約為30 mm3,之后每天定時(shí)灌胃不同劑量的待測(cè)樣品,連續(xù)灌胃4 周。具體分組為：1）正常對(duì)照組：未注射結(jié)直腸癌細(xì)胞,灌胃生理鹽水；2）模型組：注射結(jié)直腸癌細(xì)胞,灌胃生理鹽水；3）陽(yáng)性處理組：注射結(jié)直腸癌細(xì)胞,灌胃5-氟尿嘧啶；4）低劑量組：注射結(jié)直腸癌細(xì)胞,灌胃低劑量鱘魚(yú)硫酸軟骨素（100 μg/g）；5）中劑量組：注射結(jié)直腸癌細(xì)胞,灌胃中劑量鱘魚(yú)硫酸軟骨素（200 μg/g）；6）高劑量組：注射結(jié)直腸癌細(xì)胞,灌胃高劑量鱘魚(yú)硫酸軟骨素（400 μg/g）。

1.3.2 小鼠腫瘤組織體積、質(zhì)量的測(cè)定

小鼠腫瘤組織體積的測(cè)定：皮下注射結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT-116后,使用游標(biāo)卡尺每4 d測(cè)量一次各組小鼠腫瘤長(zhǎng)度、寬度,腫瘤體積（V）按下式計(jì)算。

小鼠腫瘤組織質(zhì)量的測(cè)定：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,對(duì)各組實(shí)驗(yàn)鼠進(jìn)行取材處理,剖取各組小鼠腫瘤組織并稱(chēng)質(zhì)量/g,記錄各組小鼠腫瘤組織質(zhì)量。

1.3.3 糞便的采集

在實(shí)驗(yàn)結(jié)束前,采用壓迫擠壓法采集各組實(shí)驗(yàn)小鼠的新鮮糞便,左手抓緊并固定好小鼠,右手輕輕擠壓小鼠直腸,無(wú)菌離心管收集新鮮的糞便樣本,將采集好的樣本貯藏于-80 ℃冰箱、備用,避免反復(fù)凍融。

1.3.4 糞便中DNA的提取

取-80 ℃貯藏的糞便樣本,參照糞便DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)各實(shí)驗(yàn)組中小鼠的糞便進(jìn)行總DNA的提取。

1.3.5 腸道菌群16S rRNA V3區(qū)PCR擴(kuò)增

基于腸道菌群的16S rRNA基因V3～V4區(qū)域合成相關(guān)引物為515F（5'-ACTCCTCCGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACGCGGGTATCTAAT-3'）。擴(kuò)增體系包括2×Phanta Max緩沖液12.5 μL、10 mmol dNTP Mix 0.5 μL、10 μmol引物-F 1.0 μL、10 μmol引物-R 1.0 μL、1 U/μL DNA聚合酶0.5 μL、模板DNA 20.0 ng,加水補(bǔ)充至25.0 μL。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共23 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min,4 ℃保存。擴(kuò)增后進(jìn)行混樣、建庫(kù)并做相應(yīng)的檢測(cè),使用設(shè)定的標(biāo)簽序列進(jìn)行樣本區(qū)分。檢測(cè)合格的擴(kuò)增子文庫(kù)將采用Illumina HiSeq 2500高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

1.4.1 數(shù)據(jù)預(yù)處理和序列質(zhì)量?jī)?yōu)化統(tǒng)計(jì)

對(duì)Illumina HiSeq 2500測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù),利用軟件FastQC進(jìn)行數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估和數(shù)據(jù)過(guò)濾,并利用Pandaseq軟件進(jìn)行序列優(yōu)化統(tǒng)計(jì)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均是將低、中、高劑量組與正常對(duì)照組、模型組和陽(yáng)性處理組進(jìn)行比較分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。用SPSS 20軟件分析數(shù)據(jù),顯著性分析采用單因素方差分析和Duncan's多重檢驗(yàn),P＜0.05表示存在顯著性差異。

1.4.2 操作分類(lèi)單元聚類(lèi)分析

根據(jù)97%的序列相似性水平,利用QIIME軟件包中的uclust聚類(lèi)方法將移除嵌合體后的序列歸為多個(gè)操作分類(lèi)單元（operational taxonomic units,OTUs）,得到OTU聚類(lèi)結(jié)果。然后基于SILVA參考數(shù)據(jù)庫(kù),利用RDP Classifier軟件對(duì)每個(gè)樣品的OTUs進(jìn)行分類(lèi)學(xué)注釋。

1.4.3 稀釋曲線(xiàn)和物種相對(duì)豐度分析

對(duì)OTU的序列進(jìn)行隨機(jī)抽樣,分析序列數(shù)與OTU數(shù)目的關(guān)系,構(gòu)建稀釋曲線(xiàn)并做多樣性分析。

1.4.4 腸道微生物菌落組成分析

使用Qiime軟件,并根據(jù)OTU分類(lèi)結(jié)果對(duì)各組小鼠腸道微生物組成進(jìn)行分析,分別從門(mén)、科和屬等不同分類(lèi)水平上了解各組腸道微生物組成和結(jié)構(gòu)的變化特點(diǎn)。

1.4.5 組間相似性分析

主坐標(biāo)分析（principal co-ordinates analysis,PCoA）是一種通過(guò)分析數(shù)據(jù)距離、矩陣來(lái)研究數(shù)據(jù)間相似性或差異性的可視化方法。通過(guò)UniFrac分析得到所有樣品的距離、矩陣數(shù)據(jù),然后進(jìn)行PCoA,了解各組小鼠腸道微生物群落間的相似性。

2 結(jié)果與分析

2.1 鱘魚(yú)硫酸軟骨素對(duì)結(jié)直腸癌荷瘤小鼠中腫瘤組織體積與質(zhì)量的影響

圖1 各組小鼠腫瘤組織體積及質(zhì)量Fig.1 Tumor volume and mass

由圖1A可知,與模型組相比,低、中、高劑量組實(shí)驗(yàn)小鼠的結(jié)直腸腫瘤組織體積的增長(zhǎng)速率隨口服劑量的增加而下降,呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性,與模型組的體積相比差異顯著（P＜0.05）。同時(shí),腫瘤組織質(zhì)量結(jié)果顯示（圖1B）,與模型組比較,隨灌胃鱘魚(yú)硫酸軟骨素劑量的增加,腫瘤質(zhì)量顯著降低（P＜0.05）,表明對(duì)于已經(jīng)形成結(jié)直腸癌的小鼠,口服鱘魚(yú)硫酸軟骨素可以減緩腫瘤的生長(zhǎng)發(fā)展,起到治療的作用。

2.2 物種相對(duì)豐度結(jié)果分析

2.2.1 稀釋曲線(xiàn)分析

稀釋性曲線(xiàn)是指采用隨機(jī)抽樣的方法,從樣本中隨機(jī)抽取一定數(shù)量的個(gè)體,統(tǒng)計(jì)出這些個(gè)體所代表物種數(shù)目,并以個(gè)體數(shù)與物種數(shù)來(lái)構(gòu)建的曲線(xiàn),它可以用來(lái)比較不同的樣本之間的物種豐富度,還能夠直觀地反映樣本的取樣大小是否合理。稀釋曲線(xiàn)（圖2）結(jié)果表明,當(dāng)測(cè)序量增多時(shí),樣本中物種多樣性的增長(zhǎng)幅度較低,說(shuō)明測(cè)序量對(duì)樣本中物種多樣性的貢獻(xiàn)率較小,當(dāng)前所選的樣本測(cè)序量足夠多,可以較好地反映樣品中的微生物物種信息。

圖2 各組樣本Shannon指數(shù)曲線(xiàn)Fig.2 Shannon exponential curves of the samples

2.2.2 相對(duì)豐度分布曲線(xiàn)分析

圖3 各組樣本相對(duì)豐度分布曲線(xiàn)Fig.3 Relative abundance curves of the samples

OTU是在系統(tǒng)發(fā)生分析或群體遺傳研究中的一個(gè)假定的分類(lèi)單元。對(duì)于樣本的微生物組成研究,目前常用分類(lèi)單元主要有門(mén)、綱、目、科、屬、種6 個(gè)水平。通常以閾值序列相似性為97%為同一類(lèi),每一個(gè)類(lèi)就是一個(gè)OTU,代表一個(gè)種。Rank-Abundance曲線(xiàn)可以同時(shí)用于反映測(cè)序樣品中所含物種的豐富程度和均勻程度,其中曲線(xiàn)越長(zhǎng),說(shuō)明物種組成越豐富,曲線(xiàn)越平滑,則表明物種組成的均勻程度越高。

豐度分布曲線(xiàn)（圖3）中的每條曲線(xiàn)分別對(duì)應(yīng)一個(gè)測(cè)序樣本,橫坐標(biāo)表示OTU相對(duì)豐度按等級(jí)降序排列,縱坐標(biāo)表示該OTU中序列數(shù)的相對(duì)豐度,結(jié)果顯示,測(cè)序樣本的物種序列數(shù)主要分布在100～700,且組成分布均勻。

2.2.3 多樣性分析

為了更好地了解每個(gè)樣本本身的生物多樣性情況,通常會(huì)通過(guò)多個(gè)指標(biāo)來(lái)表示,俗稱(chēng)多樣性分析。本實(shí)驗(yàn)以Chao1指數(shù)、ACE值、Shannon指數(shù)和Goods's coverage指數(shù)來(lái)反映各組樣品的物種相對(duì)豐度和群落多樣性,數(shù)值與物種的豐度呈正相關(guān)。其中,Goods's coverage指數(shù)可以反映測(cè)序深度,數(shù)值越高,樣本中沒(méi)有被檢出的概率越低。如表1所示,各組小鼠的測(cè)序深度均為0.98以上、漸近1,且無(wú)顯著性差異（P＞0.05）,表明各組樣本的序列基本均被檢出。

表1 各組小鼠腸道菌群的多樣性分析Table 1 Diversity analysis of intestinal flora in mice from each group

人和動(dòng)物腸道內(nèi)定植著龐大的微生物群體,這些微生物在代謝膳食營(yíng)養(yǎng)、促進(jìn)免疫系統(tǒng)發(fā)育、抵抗病原微生物入侵等方面發(fā)揮重要作用[33]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),許多的腸道基本疾病可能與腸道微生物多樣性或者相對(duì)豐度的降低有關(guān)。結(jié)果表明,模型組樣本的Chao1指數(shù)、ACE值均低于正常對(duì)照組,說(shuō)明腸炎疾病可以引起小鼠腸道菌群中物種數(shù)量的改變及降低物種數(shù)量。同時(shí),模型組的Shannon指數(shù)顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.05）,說(shuō)明患結(jié)直腸癌可以使小鼠腸道菌群的多樣性發(fā)生改變并降低。灌胃不同劑量的鱘魚(yú)硫酸軟骨素,可以使患病模型小鼠腸道微生物的Shannon指數(shù)降低,且逐漸趨于正常組,其中高劑量組的Shannon指數(shù)低于陽(yáng)性對(duì)照組。由此可見(jiàn),灌胃鱘魚(yú)硫酸軟骨素能夠一定程度上增加結(jié)直腸癌患病模型小鼠腸道內(nèi)的菌群多樣性,起到調(diào)節(jié)腸道微生物菌群的作用。

2.3 腸道微生物菌落組成結(jié)果分析

2.3.1 基于門(mén)水平的微生物菌落結(jié)構(gòu)分析

由圖4可知,各組小鼠腸道菌群檢測(cè)中,樣品共注釋到14 個(gè)細(xì)菌門(mén)類(lèi),分別為產(chǎn)古菌門(mén)（Euryarchaeota）、放線(xiàn)菌門(mén)（Actinobacteria）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、藍(lán)藻細(xì)菌門(mén)（Cyanobacteria）、脫鐵桿菌門(mén)（Deferribacteres）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、梭桿菌門(mén)（Fusobacteria）、浮霉菌門(mén)（Planctomycetes）、變形菌門(mén)（Proteobacteria）、糖化菌門(mén)（Saccharibacteria）、螺旋菌門(mén)（Spirochaetae）、互養(yǎng)菌門(mén)（Synergistetes）、柔膜菌門(mén)（Tenericutes）和疣微菌門(mén)（Verrucomicrobia）。其中,擬桿菌門(mén)和厚壁菌門(mén)為主要的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)。

圖4 各組小鼠腸道菌群在門(mén)水平上的注釋結(jié)果Fig.4 Annotation results of intestinal microflora at the phylum level in mice from each group

關(guān)于腸道疾病與腸道菌群的關(guān)系近年來(lái)受到了廣泛的關(guān)注。已有文獻(xiàn)和研究證明,腸道中厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)的比例對(duì)腸道健康影響不大[34],但梭桿菌門(mén)是主要的腸道致病菌,與癌癥等多種疾病相關(guān),尤其在結(jié)直腸癌中,具核梭桿菌作為共生致病菌是目前較為明確的與癌癥有密切關(guān)系的菌[35],其可以促進(jìn)癌細(xì)胞的發(fā)育、生長(zhǎng)、傳播以及影響癌癥治療的響應(yīng)[36]。結(jié)果表明,模型組中的梭桿菌門(mén)相對(duì)豐度（0.008 5%）顯著高于正常對(duì)照組（0.001 3%）（P＜0.05）,經(jīng)灌胃鱘魚(yú)硫酸軟骨素處理后,小鼠腸道中的梭桿菌門(mén)相對(duì)豐度降低并且趨于正常對(duì)照組,其中高劑量組中的梭桿菌門(mén)相對(duì)豐度約為0.001 4%,表明鱘魚(yú)硫酸軟骨素可以改變結(jié)直腸癌患病小鼠腸道中的梭桿菌門(mén)相對(duì)豐度,進(jìn)而起到對(duì)結(jié)直腸的調(diào)節(jié)作用（圖5A）。

糖化菌門(mén)的主要作用是將多糖轉(zhuǎn)化為簡(jiǎn)單的雙糖和單糖,利于人體的吸收[37]。結(jié)果發(fā)現(xiàn),灌胃鱘魚(yú)硫酸軟骨素后,小鼠中的糖化菌門(mén)相對(duì)豐度顯著增高（P＜0.05）,明顯高于正常對(duì)照組（0.15%）、模型組（0.47%）、陽(yáng)性處理組（0.33%）,且隨著灌胃劑量的增加,腸道中糖化菌門(mén)的相對(duì)豐度增加,其中低劑量組為1.65%,中劑量組為1.85%,高劑量組可達(dá)2.10%,說(shuō)明鱘魚(yú)硫酸軟骨素灌胃后能夠增加糖化菌門(mén)含量,促進(jìn)多糖的吸收,改變腸道菌群的結(jié)構(gòu)（圖5B）。

圖5 各組小鼠腸道內(nèi)糖化菌門(mén)的相對(duì)豐度Fig.5 Relative abundance of intestinal microflora in mice from each group

2.3.2 基于科水平的微生物菌落結(jié)構(gòu)分析

腸道菌群的平衡和穩(wěn)定有利于腸道及機(jī)體的健康,而腸道菌群的多樣性受到了生活方式以及自身的影響。為了進(jìn)一步探究鱘魚(yú)硫酸軟骨素對(duì)結(jié)直腸癌小鼠腸道菌群的影響,本實(shí)驗(yàn)在門(mén)水平基礎(chǔ)上,進(jìn)一步分析了科水平上的變化。由表2可知,正常對(duì)照組小鼠和灌胃鱘魚(yú)硫酸軟骨素高劑量組小鼠中腸道的優(yōu)勢(shì)菌均為類(lèi)桿菌科（Bacteroidaceae）、擬桿菌目S27科（Bacteroidales S24-7 group）和瘤胃菌科（Ruminococcaceae）,與正常對(duì)照組相比,模型組中的Ruminococcaceae相對(duì)豐度由15%降至12%,同時(shí)Bacteroidales S24-7 group相對(duì)豐度由30%降至18%,且患病模型組小鼠腸道內(nèi)科水平的優(yōu)勢(shì)菌發(fā)生了改變,變?yōu)锽acteroidales S24-7 group 18%、Lachnospiraceae 18%以及Ruminococcaceae 12%。

近年來(lái),擬桿菌屬對(duì)癌癥的調(diào)節(jié)作用受到了研究者的關(guān)注和證明,Vetizou等[38]研究發(fā)現(xiàn),CTLA-4作為一種新的免疫抑制藥物,具有抗腫瘤作用,并且CTLA-4的抗腫瘤作用取決于不同的擬桿菌菌屬,在小鼠和患者中,Bacteroidales或脆弱擬桿菌特異性的T細(xì)胞應(yīng)答與抗癌藥物對(duì)癌細(xì)胞增殖的阻斷功效相關(guān),同時(shí)已證實(shí),脆擬桿菌具有抗癌特性[39]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),一些糖類(lèi)物質(zhì)能夠促進(jìn)擬桿菌屬中的某些細(xì)菌的生長(zhǎng)[40]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示出,灌胃鱘魚(yú)硫酸軟骨素后,隨灌胃劑量的增加,小鼠中Bacteroidales S24-7group相對(duì)豐度總體呈增加趨勢(shì),其中低劑量組僅為31%,高劑量組則可達(dá)40%,說(shuō)明鱘魚(yú)硫酸軟骨素可以提高Bacteroidales S24-7group的相對(duì)豐度；與模型組（18%）相比,說(shuō)明鱘魚(yú)硫酸軟骨素可能通過(guò)提高擬桿菌屬的相對(duì)豐度,抑制結(jié)直腸癌的發(fā)展。灌胃鱘魚(yú)硫酸軟骨素后,小鼠腸道菌群中的科水平微生物含量逐漸趨于正常組小鼠,結(jié)合在灌胃鱘魚(yú)硫酸軟骨素素治療的過(guò)程,以及前期細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的結(jié)果[32],說(shuō)明鱘魚(yú)硫酸軟骨素可以通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群的平衡,改善腸道炎癥的病變。

表2 各組優(yōu)勢(shì)菌科水平Table 2 Distribution of dominant bacteria in samples at the family level

2.3.3 基于屬水平的微生物菌落結(jié)構(gòu)分析

選取相對(duì)豐度在前15%的菌進(jìn)行屬水平的菌落組成分析,結(jié)果如圖6所示。正常組腸道內(nèi)相對(duì)豐度在2%以上的屬水平菌分別為擬桿菌屬（16.47%）、BacteroidalesS24-7 group（24.56%）、阿利斯泰伯屬（8.48%）、嗜胃氣桿菌屬（2.21%）、LachnospiraceaeNK4A136group（3.39%）、RuminococcaceaeUCG-014（9.54%）、Akkermansia（8.48%）,與結(jié)直腸癌患病小鼠模型組對(duì)比發(fā)現(xiàn),Ruminiclostridium5在患病小鼠的腸道內(nèi)相對(duì)豐度明顯升高,由正常組的0.92%升高到2.05%。已有研究發(fā)現(xiàn),Ruminiclostridium5主要與腸道、肝臟等慢性疾病相關(guān),具有促進(jìn)炎癥發(fā)生的作用[41],結(jié)果顯示,當(dāng)灌胃鱘魚(yú)硫酸軟骨素后,小鼠腸道內(nèi)的Ruminiclostridium5相對(duì)豐度隨著灌胃劑量的增加而降低,在高劑量組中,相對(duì)豐度為0.41%,基本接近正常組,說(shuō)明鱘魚(yú)硫酸軟骨素具有一定的抗炎作用。

圖6 各組小鼠腸道菌群在屬水平上的注釋結(jié)果Fig.6 Taxonomic composition and distribution in samples at the genus level

LachnospiraceaeNK4A136 group、Oscillibacter都與機(jī)體的炎癥反應(yīng)相關(guān),二者含量的增加能夠加重機(jī)體的炎癥,增加機(jī)體患病風(fēng)險(xiǎn)。Li Jun等[42]通過(guò)使用新得到的益生元混合物灌胃模型小鼠,發(fā)現(xiàn)可以減緩腫瘤的生長(zhǎng),與正常對(duì)照組相比顯著降低腫瘤大小約40%,說(shuō)明益生元改變了腸道微生物群落中有益細(xì)菌的優(yōu)勢(shì),其中包括Prevotella和Oscillibacter,它們可以產(chǎn)生抗炎代謝物。結(jié)果發(fā)現(xiàn),患病模型組中的LachnospiraceaeNK4A136 group、Oscillibacter相對(duì)豐度增加,且明顯高于正常組；在治療組中,灌胃不同劑量的鱘魚(yú)硫酸軟骨素后,體內(nèi)兩種菌在屬水平上的相對(duì)豐度都降低,其中高劑量組由模型組的LachnospiraceaeNK4A136 8.45%、Oscillibacter1.1%分別降低至3.49%和0.68%,恢復(fù)至正常組水平（3.39%和0.61%）。因此,鱘魚(yú)硫酸軟骨素可通過(guò)抑制促炎菌的生長(zhǎng)改變腸道中菌群的數(shù)量,促進(jìn)抗炎代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生,進(jìn)而增加抗炎能力,抑制癌細(xì)胞的增殖,最終起到緩解癌癥的作用。

2.4 組間相似性結(jié)果分析

PCoA將多維數(shù)據(jù)進(jìn)行降維,是一種研究數(shù)據(jù)相似性或差異性的可視化方法。為了更好地比較各組之間的微生物群落結(jié)構(gòu)的多樣性和各組腸道微生物組成間的相似性,本實(shí)驗(yàn)采用樣品聚類(lèi)的方法進(jìn)行PCoA（圖7）。

PCoA中樣本點(diǎn)之間的距離越靠近,表明對(duì)應(yīng)的樣品間的腸道微生物組成越相似。各組小鼠腸道菌群PCoA二維圖中可以看出,兩種主坐標(biāo)分別貢獻(xiàn)了11.84%和9.66%的差異。李敏[43]通過(guò)構(gòu)建急性結(jié)腸炎小鼠模型,發(fā)現(xiàn)在不同處理后的小鼠腸道菌群PCoA中,兩種主坐標(biāo)貢獻(xiàn)率為17.7%和13.2%；同時(shí),張任帥[44]通過(guò)對(duì)葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的腸炎小鼠模型灌胃松花多糖后發(fā)現(xiàn),PCO1和PCO2是兩個(gè)主坐標(biāo)成分,PCO1表示盡可能最大解釋數(shù)據(jù)變化的主坐標(biāo)成分,PCO2為解釋余下的變化度中占比例最大的主坐標(biāo)成分,分別為15.2%和11.93%,貢獻(xiàn)率相對(duì)較小,與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似,這可能是由于腸道微生物的構(gòu)成、改變是多方面、多因素的,也可能是由于實(shí)驗(yàn)處理樣本相對(duì)較少。

圖7 各組小鼠腸道菌群PCoA主成分分析Fig.7 Principal co-ordinates analysis of intestinal flora of mice from each group

但是,與正常組相比,陽(yáng)性對(duì)照組各樣本間的分散程度較高,說(shuō)明5-氟尿嘧啶可以能會(huì)造成腸道菌群的紊亂,與上文中門(mén)水平的注釋結(jié)果一致。正常對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性處理組和灌胃低、中、高劑量的鱘魚(yú)硫酸軟骨素各組的菌相組成存在差異。其中,灌胃鱘魚(yú)硫酸軟骨素的各組樣本之間比較分散,可能是由于樣本本身的個(gè)體存在差異,且低劑量組和中劑量組與模型組也存在著部分的相似性,而高劑量組則與模型組差異較大,結(jié)合之前鱘魚(yú)硫酸軟骨素灌胃處理后,小鼠腸道菌群在門(mén)、科以及屬水平的變化,可以說(shuō)明鱘魚(yú)硫酸軟骨素可以引起小鼠腸道菌群組成的改變。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)利用皮下注射結(jié)直腸癌細(xì)胞的方法,構(gòu)建了結(jié)直腸癌患病小鼠模型,探究了灌胃鱘魚(yú)硫酸軟骨素對(duì)結(jié)直腸癌小鼠腸道菌群組成的影響。結(jié)果顯示,鱘魚(yú)硫酸軟骨素可以改變小鼠腸道微生物的數(shù)量和多樣性,結(jié)直腸癌患病小鼠中BacteroidalesS24-7 group、毛螺菌科以及瘤胃菌科相對(duì)豐度明顯優(yōu)于其他組,為主要的優(yōu)勢(shì)菌科,具有增加結(jié)直腸癌的患病風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí),灌胃鱘魚(yú)硫酸軟骨素后,小鼠腸道中的優(yōu)勢(shì)菌屬發(fā)生改變,且部分菌屬相對(duì)豐度改變,LachnospiraceaeNK4A136 group和Oscillibacter相對(duì)豐度明顯降低,逐漸趨于正常對(duì)照組小鼠,說(shuō)明鱘魚(yú)硫酸軟骨素可通過(guò)抑制促炎菌的生長(zhǎng)改變腸道中菌群的數(shù)量,進(jìn)而增加抗炎能力,抑制癌細(xì)胞的增殖,最終起到緩解癌癥的作用。