酪蛋白體外消化過程中DPP-IV抑制活性的變化規(guī)律及其機(jī)制分析

錢兢菁,鄭 淋,趙謀明

（華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,廣東 廣州 510640）

近年來,糖尿病已逐漸成為威脅人類健康三大慢性疾病之一,據(jù)國際糖尿病聯(lián)合會統(tǒng)計,2017年我國糖尿病患者達(dá)到1.144 億,也就是每11 個成年人中就有1 個糖尿病患者[1]。而臨床的各種治療藥物易引起低血糖、低血壓、肝損傷等各種副作用[2],因此開發(fā)新的用于輔助治療糖尿病的食源性活性物質(zhì)具有十分重要的應(yīng)用前景。食源性二肽基肽酶IV（dipeptidyl peptidase IV,DPP-IV）抑制肽已逐漸成為用于輔助治療II型糖尿病的重要靶點,并且無其他副作用[3]。DPP-IV抑制肽指的是蛋白水解物中某些特定肽段可以抑制體內(nèi)腸道酶DPP-IV對胰高血糖素樣肽（glucagonlike peptide-1,GLP-1）的降解,促進(jìn)胰島β細(xì)胞分泌胰島素及抑制胰島α細(xì)胞分泌胰高血糖素從而降低血糖[4],還不易誘發(fā)低血糖癥。這類食源性小分子肽主要來源于酪蛋白、乳清蛋白、膠原蛋白、小麥及大米蛋白等[5-9],通常是由2～10 個氨基酸組成的寡肽序列。截止2019年已報道的抑制肽大約共有400 多條[10],而學(xué)者們通過對這些肽的構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),DPP-IV抑制肽在結(jié)構(gòu)組成上存在一定的規(guī)律,即通常N末端具有Trp或第二位置為Pro或Ala[11-14],而N端第二位置具有Pro或Ala的肽段符合DPP-IV特異酶切位點,因而發(fā)揮競爭性抑制作用。因此,食源性DPP-IV抑制肽已成為今后輔助治療糖尿病的重要手段,而利用構(gòu)效關(guān)系鑒定活性潛力肽段輔助開發(fā)新的強活性DPP-IV抑制肽具有指導(dǎo)意義。

酪蛋白作為牛奶中含量最多的一類蛋白質(zhì),約占80%左右。近50年來,酪蛋白水解產(chǎn)物中很多種生物活性已陸續(xù)被發(fā)現(xiàn),如免疫調(diào)節(jié)、阿片樣活性、降血壓、降血糖、抗焦慮等活性[15-19]。大量研究表明,酪蛋白是DPP-IV抑制肽的重要來源,其各種亞基序列中含有許多DPP-IV抑制活性潛在序列[7],而目前關(guān)于酪蛋白DPP-IV抑制肽的研究主要集中在商業(yè)酶水解釋放,如張穎等[20-21]對牛及山羊乳通過5 種商業(yè)酶制備DPP-IV抑制肽及其機(jī)理研究,發(fā)現(xiàn)牛乳酪蛋白水解物對β-細(xì)胞促胰島分泌作用更強,由體內(nèi)體外實驗中證明牛乳酪蛋白經(jīng)商業(yè)酶水解確能釋放較多DPP-IV抑制肽。Tagliazucchi等[22]研究幾種物種乳源蛋白模擬消化的生物活性,4 種乳源蛋白共鑒定19 種DPP-IV抑制肽,牛奶被發(fā)現(xiàn)為DPP-IV抑制肽和抗氧化肽的最佳來源。綜上,目前對于牛乳酪蛋白直接消化過程中DPP-IV抑制活性變化規(guī)律仍不清晰,從DPP-IV抑制典型結(jié)構(gòu)特征肽分析DPP-IV抑制活性變化機(jī)制的研究鮮少、較新穎。

因此,本實驗通過模擬人體胃腸消化（胃蛋白酶-胰酶體外消化）水解酪蛋白,研究酪蛋白消化產(chǎn)物DPP-IV抑制活性變化規(guī)律,并通過液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（liquid chromatographic-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS）分析酪蛋白消化產(chǎn)物中具有典型DPP-IV抑制肽結(jié)構(gòu)特征肽段序列變化,試圖闡明抑制活性、消化特性、特征肽組成及含量變化之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酪蛋白（分析純）、胃蛋白酶（分析純）、胰酶（分析純）、二肽基肽酶IV、甘氨酰-脯氨酰-對硝基苯胺對甲苯磺酸鹽（Gly-Pro-pNA）、二硫蘇糖醇、鄰苯二甲醛（o-phthalaldehyde,OPA）、5 種分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品（牛血清白蛋白（66 430 Da）、細(xì)胞色素c（12 384 Da）、抑肽酶（6 521 Da）、桿菌肽（1 423 Da）、VB12（1 355 Da）） 美國Sigma公司；合成肽IPI和LVF（純度＞95%）吉爾生化（上海）有限公司；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

ME 204電子天平 瑞士Mettler Toledo公司；PHS-3C型pH計 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；KND-2C型定氮儀 上海纖檢儀器有限公司；Varioskan Flash全波長掃描多功能讀數(shù)儀、HPLC高效液相色譜美國Thermo Fisher Scientific公司；Impact II高分辨四極桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜（electrospray ionization-qudropole timeof-flight-tandem mass spectrometry,ESI-Q-TOF-MS/MS）美國Bruker公司；ACQUITY超高效液相色譜（ultra performance liquid chromatography,UPLC）美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 體外胃蛋白酶-胰酶模擬胃腸道消化制備酪蛋白消化液

根據(jù)You Lijun等[23]的方法,加以修改。取5 g酪蛋白分散于50 mL蒸餾水中,放置于磁力攪拌器中使之充分?jǐn)嚢枞芙?再使用1 mol/L HCl溶液將酪蛋白溶解調(diào)整pH值至2.0左右,在37 ℃振蕩水浴搖床中溫育15 min后,向酪蛋白溶液中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%（基于酪蛋白原料）的胃蛋白酶,隨后混合物在37 ℃搖床中溫育水解持續(xù)2 h。2 h后取出,用2 mol/L NaOH溶液調(diào)pH值至7.5,往溶液中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的胰酶進(jìn)行第二步消化,同樣在37 ℃搖床中溫育水解持續(xù)2 h,分別在相應(yīng)時間點0、30、60、90、120、150、180、210、240 min時取出消化液,立即于100 ℃沸水下滅酶10 min終止消化,冷卻后均于10 000×g、4 ℃下離心15 min,取上清液,部分保留消化液儲存至-20 ℃?zhèn)溆?部分凍干后于-20 ℃保存供MS分析。

1.3.2 酪蛋白消化特性的測定

1.3.2.1 酪蛋白體外消化率的測定

依照GB 5009.5—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》用凱氏定氮法對9 個不同消化時間的消化樣品定氮,根據(jù)公式（1）計算蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù),然后根據(jù)公式（2）計算出酪蛋白體外消化率。

1.3.2.2 酪蛋白體外消化水解度的測定

水解度指水解蛋白質(zhì)斷裂游離N-末端氨基的百分比,使用OPA測定法定量測定,參考Nielsen等[24]的方法,加以改進(jìn)。根據(jù)1.3.2.1節(jié)測得的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)使用去離子水分別稀釋胃消化及腸消化樣品,稀釋樣品質(zhì)量濃度分別為1 mg/mL及0.5 mg/mL；使用紫外96 孔板,每孔中加32 μL樣品、去離子水、絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和240 μL OPA溶液,分別作為樣品組、空白組、標(biāo)準(zhǔn)組,并且每個樣平行3 次,在37 ℃下反應(yīng)2 min,于多功能酶標(biāo)儀中測定340 nm波長處吸光度,按照下列公式（3）計算水解度。

式中：h為水解肽鍵數(shù)；OD樣品組、OD空白組、OD標(biāo)準(zhǔn)組分別為樣品、去離子水、絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液在340 nm波長處測定的吸光度；c為樣品濃度/（mol/L）；β、α為計算蛋白原料水解肽鍵數(shù)固有系數(shù)；htot為總肽鍵數(shù),取決于原料的類型；其中酪蛋白的β＝0.383、α＝1.039、htot＝8.2。

1.3.3 酪蛋白消化液DPP-IV抑制活性測定

DPP-IV抑制活性是指樣品對內(nèi)源性腸道酶DPP-IV的抑制作用,抑制活性的測定參照Silveira等[25]的方法,加以改進(jìn)。分別先后在96 孔板中加入40 μL 0.5 mol/L底物（Gly-Pro-pNA溶液）和80 μL蛋白質(zhì)量濃度4 mg/mL樣品（樣品組）或Tris溶液（對照組）同時37 ℃溫育10 min,再加入40 μL 12.5 mU/mL DPP-IV酶（預(yù)先在37 ℃保溫5 min）,混勻后于多功能酶標(biāo)儀在37 ℃下孵育,每隔2 min在405 nm波長處測吸光度,共孵育2 h。根據(jù)公式（4）計算抑制率。

式中：Slope對照組為利用Slope函數(shù)求空白組吸光度在線性范圍內(nèi)變化的時間點的斜率；Slope樣品組為使用Slope函數(shù)求樣品組吸光度在線性范圍內(nèi)變化的時間點的斜率。

1.3.4 分子質(zhì)量分布的測定

分子質(zhì)量的分布可以用來表示蛋白質(zhì)水解的效率,以及輔助分析肽段降解的序列長短范圍,參照Zheng Lin等[26]的方法加以修改,采用G2000 SWXL TSK凝膠色譜柱（7.8 mm×300 mm,5 μm）,流動相為含0.1%三氟乙酸的磷酸鈉緩沖液,流速1 mL/min,進(jìn)樣量20 μL,在220 nm波長處測吸光度,使用6 種分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品參照物,包括牛血清白蛋白（66 430 Da）、細(xì)胞色素c（12 384 Da）、抑肽酶（6 521 Da）、桿菌肽（1 423 Da）、VB12（1 355 Da）和合成三肽LVF（377 Da）,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線y＝-0.351 4x+7.359 2,R2＝0.998 2,計算分析消化產(chǎn)物1、2、3、4 h的分子質(zhì)量分布。

1.3.5 UPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS鑒定活性肽段

通過UPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS來鑒定酪蛋白模擬胃腸消化過程中釋放的肽段序列。色譜柱為HSS T3柱（2.1 mm×100 mm,1.8 μm）,洗脫速率為0.2 mL/min,進(jìn)樣量為2 μL。流動相A為0.1%甲酸水,B為乙腈（色譜純）,洗脫程序為：0～10 min,5%～40% B；10～12 min,40%～90% B；12～14 min,90% B；14～15 min,90%～5% B；15～18 min,5% B平衡至初始狀態(tài)。質(zhì)譜參數(shù)：電子轟擊離子源能量7 eV,毛細(xì)管電壓4 500 V,離子源溫度200 ℃,干燥氣體流量8 L/min,霧化器壓力1.5 bar,質(zhì)量掃描范圍m/z50～1 500。

數(shù)據(jù)解譜及檢索：采用Mascot搜庫鑒定6 肽以上的長肽序列；而具有2～6 個氨基酸殘基的短肽則采用Target Analysis 1.2軟件篩選匹配符合DPP-IV抑制肽結(jié)構(gòu)特征,再結(jié)合Data Analysis 4.3軟件手動解譜測序確認(rèn)序列。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

本實驗中所有數(shù)據(jù)分析、作圖,均采用Excel 2013、Origin Pro 8軟件及SPSS 22軟件處理完成,結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用Duncan多重比較對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性差異分析。以P＜0.05時表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 酪蛋白體外消化特性分析結(jié)果

利用胃蛋白酶-胰酶兩步體外消化水解酪蛋白,從而模擬其人體胃腸消化過程,并以水解度和消化率來分析其消化過程中肽鍵斷裂程度及消化程度,結(jié)果如圖1所示。在0～120 min胃蛋白酶消化階段,水解度均較低,僅為5%左右,且無顯著性差異（P＞0.05）,消化率也較低,在50%～80%左右。這主要是由于胃蛋白酶為內(nèi)切型蛋白酶,其酶解位點較特異,主要水解肽鍵的氨基端或羧基端為芳香族氨基酸,因此通常水解肽鍵程度較低,蛋白消化程度低。而經(jīng)胰酶消化30 min后,水解度快速增加,由5.29%增加到26.71%,之后趨于平緩；消化率也快速增加至92.24%,之后趨于平緩穩(wěn)定且無顯著性差異（P＞0.05）。胰酶中含有胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶以及羧肽酶A和B等多種內(nèi)切型蛋白酶和外切型蛋白酶,因此能夠快速地降解酪蛋白形成小分子肽和游離氨基酸,從而使其水解度和消化率快速增加。Goodman[27]研究也發(fā)現(xiàn)相同結(jié)論,胰酶相較于胃蛋白酶更有利于蛋白水解,降解成小分子肽,水解度顯著增加。以上表明酪蛋白經(jīng)胃腸消化釋放許多有潛力的生物活性肽。

圖1 酪蛋白體外消化過程中的水解度和消化率變化Fig.1 Change in degree of hydrolysis and digestibility of casein during in vitro digestion

2.2 酪蛋白消化產(chǎn)物的DPP-IV抑制率

DPP-IV是一種腸道酶,能降解腸促激素GLP-1及葡萄糖依賴性促胰島素多肽[4],從而減少胰島素的釋放。根據(jù)Pratley等[28]研究表明DPP-IV酶是一種高特異性絲氨酸蛋白酶,具有酶解特異性,主要酶切N端第二位為Pro或Ala的肽鏈。因此,本實驗考察了酪蛋白經(jīng)體外消化水解后DPP-IV抑制活性的變化,結(jié)果如圖2所示,樣品組進(jìn)樣蛋白含量均維持0.32 mg一致,在0～30 min胃蛋白酶消化階段,其產(chǎn)物的DPP-IV抑制率由0.61%顯著增加至19.51%（P＜0.05）。由此可以看出,酪蛋白本身不具備DPP-IV抑制活性,但經(jīng)一步消化,胃蛋白酶酶切位點為典型疏水性氨基酸,酪蛋白可能釋放出部分符合DPP-IV抑制特征結(jié)構(gòu)肽,使活性增加[29]。而在進(jìn)一步的30～120 min胃蛋白酶消化過程中,DPP-IV抑制率無顯著變化（P＞0.05）,表明在30 min內(nèi)胃蛋白酶酶切釋放特征肽基本作用完全,因此隨著消化時間延長,活性無較大變化。在第二步胰酶消化階段中,在120～150 min內(nèi)酪蛋白消化產(chǎn)物DPP-IV抑制率顯著提高（P＜0.05）,抑制率由23.22%驟提至50.91%。而在150～240 min內(nèi)抑制率增加速率減緩,于240 min時抑制率達(dá)到最大值58.04%,約是胃蛋白酶消化產(chǎn)物活性的2 倍,表明胰酶消化能顯著提高DPP-IV抑制活性（P＜0.05）,這可能與胰酶中多種消化酶的酶切位點有關(guān),釋放出更多DPP-IV抑制肽,從而活性顯著提高[30],而后用MS進(jìn)行分析驗證。

圖2 酪蛋白體外消化過程不同時間點DPP-IV抑制率Fig.2 DPP-IV inhibitory activity of casein hydrolysates during in vitro digestion

2.3 酪蛋白不同消化時間消化產(chǎn)物分子質(zhì)量分析結(jié)果

分子質(zhì)量分布能夠體現(xiàn)蛋白水解、肽鍵斷裂的程度,分子質(zhì)量與消化產(chǎn)物的生物活性及消化吸收生物可利用度密切相關(guān),小分子質(zhì)量的肽段通常更易于胃腸道吸收[31]?；谀z色譜法結(jié)果,本實驗將酪蛋白消化產(chǎn)物的分子質(zhì)量分為4 個部分,分別是分子質(zhì)量大于5、3～5、1～3 kDa和小于1 kDa。表1呈現(xiàn)出酪蛋白消化過程中隨消化時間延長分子質(zhì)量分布的變化情況。結(jié)果表明：在胃蛋白酶消化階段即水解1、2 h內(nèi)主要是大于5 kDa的組分占比最大,將近一半（分別為43.84%和41.75%）,而1～3 kDa和小于1 kDa的小分子片段較少（消化2 h后分別為20.55%和24.11%）,表明胃蛋白酶消化僅降解一小部分大分子蛋白及大分子肽。且這兩個組分在1 h和2 h之間無顯著性差異（P＞0.05）,變化趨勢基本平穩(wěn),此時主要為胃蛋白酶的內(nèi)切型酶切作用,符合Nongonierma等[32]酪蛋白消化肽釋放動力學(xué)研究,胃蛋白酶酶解產(chǎn)物大多產(chǎn)生較長的肽,大分子質(zhì)量產(chǎn)物（分子質(zhì)量大于3 kDa占比57.20%）占比仍然較大。而在胰酶消化階段即水解3、4 h內(nèi),大于3 kDa組分顯著減少（P＜0.05）,由57.20%下降至33.16%,分子質(zhì)量在1～3 kDa內(nèi)達(dá)33.55%,小于1 kDa的2～10 肽占比達(dá)33.29%,說明胰酶消化酪蛋白后能產(chǎn)生大多為小分子的肽段,而Iwona等[33]研究表明,DPP-IV抑制肽含有2～5 個氨基酸殘基通常具有較高生物活性及生物可及性,此時可以初步解釋酪蛋白在胰酶消化階段的DPP-IV抑制活性高于胃蛋白酶階段。

表1 酪蛋白消化產(chǎn)物分子質(zhì)量分布Table 1 Molecular mass distribution of casein digests

2.4 UPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS分析特征結(jié)構(gòu)肽段組成及其含量變化

圖3 酪蛋白體外模擬消化產(chǎn)物總離子流圖Fig.3 Total ion current chromatograms of casein digests in vitro

圖4 酪蛋白體外消化LC-MS/MS鑒定DPP-IV抑制肽分布Fig.4 Distribution of DPP-IV inhibitory peptides during in vitro casein digestion examined by LC-MS/MS

表2 通過電噴霧四極桿聯(lián)用二級質(zhì)譜鑒定酪蛋白消化產(chǎn)物中肽組分Table 2 Peptide profile of casein digests identified by UPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS

為了進(jìn)一步闡述酪蛋白在消化過程中DPP-IV抑制活性變化的內(nèi)在機(jī)制,采用UPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS對酪蛋白消化后釋放的肽段進(jìn)行序列解析,并分析具有DPP-IV抑制肽典型結(jié)構(gòu)特征的肽段變化規(guī)律,主要包括Xaa-Pro-、Xaa-Ala-及Trp-Xaa-等結(jié)構(gòu)特征。本實驗僅對鑒定結(jié)果中48 條滿足具有3～10 個氨基酸殘基的寡肽序列進(jìn)行分析,除去25 條二肽（已很多研究）及8 條10 肽以上序列（潛力低）,結(jié)果如圖3及圖4A所示。酪蛋白在胃蛋白酶消化階段共釋放出25 條具有DPP-IV抑制肽典型結(jié)構(gòu)特征的肽段,胰酶消化階段釋放48 條特征肽段,數(shù)量上將近達(dá)到胃消化的2 倍,與其消化產(chǎn)物DPP-IV抑制活性變化規(guī)律一致,進(jìn)一步說明其DPP-IV抑制活性可能與其特征肽的釋放有關(guān)。LC-MS/MS鑒定消化4 h產(chǎn)物分類結(jié)果如圖4B所示,對DPP-IV抑制肽典型結(jié)構(gòu)特征分類分析,Xaa-Pro-占66%、Xaa-Ala-占32%、Trp-Xaa-僅占2%,即推測酪蛋白消化產(chǎn)物中DPP-IV抑制肽主要是結(jié)構(gòu)特征為Xaa-Pro-的序列。Nongonierma等[11]研究乳分離蛋白消化產(chǎn)物中DPP-IV抑制肽的定量構(gòu)效關(guān)系,而探索結(jié)果表明乳分離蛋白消化產(chǎn)物中DPP-IV抑制肽大多也為Xaa-Pro-樣肽。表2呈現(xiàn)了這48 條具有DPP-IV抑制肽典型結(jié)構(gòu)特征的序列及其相關(guān)蛋白來源信息。這些肽來源于αS1-酪蛋白、αS2-酪蛋白、β-酪蛋白及κ-酪蛋白4 種亞基,其中包括19 條目標(biāo)肽來源于αS1-酪蛋白,14 條目標(biāo)肽來自κ-酪蛋白,基本各占總數(shù)的1/3左右,表明這兩種亞基序列可以釋放更多符合DPP-IV抑制肽典型特征結(jié)構(gòu)。Iwona等[33]利用計算機(jī)分析預(yù)測得出κ-酪蛋白是良好的DPP-IV抑制肽食物來源,其中目前效力最高的IPI亦來自于κ-酪蛋白,進(jìn)一步驗證本實驗結(jié)果,但αS1-酪蛋白作為DPP-IV抑制肽的潛在來源還未受到相關(guān)具體研究。對這些鑒定得出的肽采用BIOPEP[34]（http://www.uwm.edu.pl/biochemia/index.php/pl/biopep）檢索已報道DPP-IV抑制肽對比發(fā)現(xiàn),有6 條已被報道,分別是IPI（半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration,IC50）為7.40 μmol/L）、YPVEPF（IC50為124.70 μmol/L）、GPFPILV（IC50為163.70 μmol/L）、VPLGTQ（IC50為22.80 μmol/L）、VPL（IC50為15.80 μmol/L）、HPIK（IC50為108.00 μmol/L）,主要來源于αS1-酪蛋白、β-酪蛋白及κ-酪蛋白,表明酪蛋白經(jīng)體外消化可產(chǎn)生很多較強DPP-IV抑制活性潛力肽段。此外,消化產(chǎn)物中還含有很多文獻(xiàn)中尚未報道,但含量較高且具有DPP-IV抑制活性潛力肽段,如VAPFPEVFG、GPFPI、YPELF、SPAQI、NAVPITPT,有待進(jìn)一步合成驗證活性強弱,為開發(fā)新的有效降糖物質(zhì)提供參考。結(jié)合圖5熱圖分析消化過程中特征肽含量（由色譜峰面積表示）變化規(guī)律發(fā)現(xiàn),胃蛋白酶消化肽段特征大多為含有3～9 個氨基酸殘基的較長肽,且1～2 h期間,5 肽以下短肽釋放含量逐漸增加,胃蛋白酶進(jìn)一步酶切過程導(dǎo)致,但體外抑制活性變化不大,推斷這些增加的短肽可能并非完全為競爭性抑制作用[35]。而反觀胰酶消化階段,特征肽結(jié)構(gòu)特征基本為2～7 肽較短肽,且胰酶與胃蛋白酶階段相比較,能釋放更多特征肽,且包含6 條已報道具有高活性的抑制肽。因此無論從前期直觀的特征肽數(shù)量上還是各潛在高活性特征肽含量上胰酶消化產(chǎn)物與胃蛋白酶消化產(chǎn)物相較呈增加趨勢,能很好地解釋前期體外活性評價結(jié)果。

圖5 酪蛋白體外模擬消化不同時間DPP-IV抑制樣肽分布熱力圖Fig.5 Heat map of DPP-IV inhibition-like peptide distribution of casein hydrolysates during in vitro simulated gastrointestinal digestion

3 結(jié) 論

本實驗利用體外模擬胃蛋白酶-胰酶消化模型水解酪蛋白,研究其消化過程DPP-IV抑制活性變化規(guī)律及其機(jī)制。酪蛋白經(jīng)兩步消化水解產(chǎn)物具有較強DPP-IV抑制活性,并具有一定的規(guī)律,胰酶消化后較胃蛋白酶消化產(chǎn)物抑制活性高2 倍左右,并發(fā)現(xiàn)兩階段均產(chǎn)生大量潛在的DPP-IV抑制肽,且其數(shù)目和含量有所不同。本實驗發(fā)現(xiàn)酪蛋白消化過程中能釋放許多DPP-IV抑制肽,其中抑制活性變化推測可能主要由釋放肽中的3～10 肽典型Xaa-Pro-序列相關(guān)。但酪蛋白消化產(chǎn)物在生物體內(nèi)DPP-IV抑制活性發(fā)揮作用機(jī)制的量效關(guān)系仍有待研究,以及鑒定的48 條（除6 條已報道）3～10 肽的典型特征肽,可以為今后開發(fā)DPP-IV抑制肽及輔助降糖產(chǎn)品提供理論依據(jù)。