反式肉桂醛對(duì)副溶血性弧菌毒力因子的抑制作用

王 碩,鄧海潮,郭 都,庸琪瑤,趙鵬瑜,鄧瑞莎,石 超,夏效東

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,陜西 楊凌 712100）

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是弧菌科弧菌屬的一種無(wú)芽孢、無(wú)莢膜、有鞭毛、能運(yùn)動(dòng)的短桿或弧桿狀的革蘭氏陰性細(xì)菌[1]。副溶血性弧菌是一種常見(jiàn)的嗜鹽菌[2],可在含鹽量為0.5%～8.0%的環(huán)境中正常生長(zhǎng)[3],廣泛存在于海水及海產(chǎn)品中,其在夏季（7～9月份）海產(chǎn)品中的檢出率高達(dá)50%以上[4],其中蝦類(lèi)、魚(yú)類(lèi)和貝類(lèi)受副溶血性弧菌污染尤為嚴(yán)重[5]。食用被副溶血性弧菌污染的生的或未煮熟的海鮮后,可能會(huì)出現(xiàn)腹瀉、頭痛、嘔吐、惡心、腹痛、低熱等癥狀[6],重癥患者還可能脫水、休克、昏迷甚至死亡[7]。有報(bào)道稱(chēng),副溶血性弧菌已逐漸成為引起我國(guó)食源性食物中毒的首要致病菌,嚴(yán)重威脅著我國(guó)公眾的健康安全[8]。并且在全球范圍內(nèi),副溶血性弧菌也是導(dǎo)致腸胃炎等疾病頻發(fā)的主要致病菌[9-10]。

副溶血性弧菌的致病性與其毒力因子密不可分。細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性在其侵染宿主細(xì)胞的過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用[11],副溶血性弧菌能夠通過(guò)口腔進(jìn)入人體胃腸道,通過(guò)黏附腸上皮細(xì)胞、穿越腸道屏障,進(jìn)而侵入血管破壞宿主體內(nèi)環(huán)境,引發(fā)疾病[12]。因此,黏附和侵入人體腸上皮細(xì)胞是副溶血性弧菌引發(fā)感染的必經(jīng)途徑。并且副溶血性弧菌易在食品加工機(jī)械表面和食品包裝上形成生物被膜,生物被膜對(duì)細(xì)菌起著保護(hù)作用,這使得細(xì)菌對(duì)環(huán)境的耐受能力大大增強(qiáng)[13-14]。副溶血性弧菌的這些毒力因子使得其具有感染率高、難以被清除的特點(diǎn),因此,尋求一種安全有效的副溶血性弧菌控制方法對(duì)保障公眾安全具有重大意義。

目前,控制副溶血性弧菌感染主要依賴(lài)于抗生素類(lèi)物質(zhì)[15]。但近些年來(lái),抗生素的濫用使諸多問(wèn)題也隨之涌現(xiàn),主要表現(xiàn)為細(xì)菌耐藥菌株增加和耐藥性增強(qiáng)[16],這給使用抗生素治療疾病的方式帶來(lái)了巨大的挑戰(zhàn)。近年來(lái),植物源活性物質(zhì)因具有天然、安全和營(yíng)養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)而受到廣泛關(guān)注[17],其抑菌功效也成為許多學(xué)者的研究熱點(diǎn)[18]。肉桂醛是肉桂精油的主要活性成分,主要存在于肉桂樹(shù)皮中,在自然界中的天然存在形式為反式肉桂醛（C9H8O）[19]。反式肉桂醛已被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局列為公認(rèn)安全的食品成分。研究表明,反式肉桂醛具有多種生物活性,可在抗癌、抗炎、治療糖尿病等方面發(fā)揮功效[19],且對(duì)阪崎克羅諾腸桿菌、沙門(mén)氏菌、大腸桿菌O157:H7等有良好的抑制效果[20]。然而,反式肉桂醛對(duì)副溶血性弧菌毒力因子的抑制作用及其機(jī)制鮮有研究。

基于此,本研究將探究反式肉桂醛對(duì)副溶血性弧菌毒力因子的抑制作用。首先,通過(guò)測(cè)定反式肉桂醛對(duì)副溶血性弧菌的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration,MIC）,以評(píng)價(jià)其抑菌效果,并確定亞抑制濃度；在此基礎(chǔ)上,探究在亞抑制濃度下,反式肉桂醛對(duì)菌體泳動(dòng)運(yùn)動(dòng)性、生物被膜形成能力和黏附及侵入Caco-2細(xì)胞能力的影響,并探討反式肉桂醛對(duì)副溶血性弧菌多種毒力因子的抑制作用,旨在為反式肉桂醛進(jìn)一步應(yīng)用于食品工業(yè)中控制食源性疾病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 17802、ATCC 33847購(gòu)于美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)（American type culture collection,ATCC）；副溶血性弧菌分離菌株202、209、210、253、258、259、260、261由香港理工大學(xué)食物安全及科技研究中心分離自鮮蝦。實(shí)驗(yàn)所用的Caco-2細(xì)胞（人克隆結(jié)腸腺癌上皮細(xì)胞）購(gòu)于武漢大學(xué)細(xì)胞保藏中心。

反式肉桂醛（純度≥99%） 美國(guó)Sigma公司；質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂（3% NaCl tryptone soya agar,3% NaCl TSA）、3%氯化鈉胰蛋白胨大豆肉湯（3% NaCl tryptone soya broth,3% NaCl TSB）北京陸橋技術(shù)有限公司；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液 美國(guó)Gibco公司；胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）以色列Biological Industries公司。

1.2 儀器與設(shè)備

微生物全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀 芬蘭Bioscreen公司；KB-900脫色搖床 海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司；HF90 CO2恒溫培養(yǎng)箱 上海力申科技儀器有限公司；Model 680酶標(biāo)儀 美國(guó)Bio-Rad公司；S-4800場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡 日本Hitachi公司；JS680B凝膠成像系統(tǒng) 上海培清科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化及菌懸液制備

將凍存于-80 ℃的副溶血性弧菌采用劃線法在3% NaCl TSA平板上活化,37 ℃培養(yǎng)12 h后挑取單菌落接種于30 mL 3% NaCl TSB中,將培養(yǎng)液置于37 ℃培養(yǎng)18 h,培養(yǎng)后的菌懸液經(jīng)離心（5 000×g、5 min,4 ℃）去除上清液,使用pH 7.2磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline,PBS）洗滌兩次后,使用3% NaCl TSB調(diào)整菌懸液在600 nm波長(zhǎng)處的OD值為0.5,此時(shí)菌懸液濃度約為108CFU/mL。

1.3.2 反式肉桂醛對(duì)副溶血性弧菌MIC的測(cè)定

參照Shi Chao等[21]的方法,利用液體稀釋法測(cè)定反式肉桂醛對(duì)副溶血性弧菌（2 株標(biāo)準(zhǔn)菌株和8 株分離菌株）MIC。將1.3.1節(jié)中所得菌懸液稀釋至濃度為5×105CFU/mL,并將100 μL菌懸液加入96 孔酶標(biāo)板中。向每孔加入反式肉桂醛溶液,使每孔中反式肉桂醛的終質(zhì)量濃度為200、100、50、25、12.5 μg/mL,隨后檢測(cè)樣品的OD600nm。將樣品置于37 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24 h后,再次檢測(cè)OD600nm,比較樣品培養(yǎng)前后的OD600nm。若兩者相差小于0.05,則認(rèn)為測(cè)試質(zhì)量濃度的反式肉桂醛能夠抑制細(xì)菌的生長(zhǎng),所對(duì)應(yīng)的最低質(zhì)量濃度即為反式肉桂醛對(duì)副溶血性弧菌的MIC。

1.3.3 反式肉桂醛對(duì)副溶血性弧菌ATCC 17802亞抑制濃度的測(cè)定

參照Silva-Angulo等[22]的方法測(cè)定反式肉桂醛對(duì)副溶血性弧菌ATCC 17802的亞抑制濃度。將1.3.1節(jié)中最終得到的菌懸液再稀釋100 倍,使菌懸液濃度約為106CFU/mL。向百孔蜂窩板中每孔加入125 μL的菌懸液及125 μL的反式肉桂醛溶液（使用3% NaCl TSB配制）,使各孔中反式肉桂醛的終濃度分別為MIC、1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC、1/16 MIC、1/32 MIC和1/64 MIC。樣品對(duì)照組添加125 μL菌懸液及125 μL 3% NaCl TSB,背景空白對(duì)照組添加250 μL 3% NaCl TSB。設(shè)置微生物全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀的培養(yǎng)溫度為37 ℃,每隔1 h檢測(cè)每孔樣品在波長(zhǎng)600 nm處的OD值并繪制生長(zhǎng)曲線,選擇質(zhì)量濃度低于MIC且對(duì)副溶血性弧菌的正常生長(zhǎng)無(wú)明顯抑制作用的最高的3 個(gè)質(zhì)量濃度作為本研究的亞抑制濃度。

1.3.4 副溶血性弧菌ATCC 17802泳動(dòng)能力的測(cè)定

反式肉桂醛對(duì)副溶血性弧菌ATCC 17802泳動(dòng)運(yùn)動(dòng)性影響的測(cè)定參照Shi Chao等[21]的方法。稱(chēng)取LB肉湯培養(yǎng)基0.5 g、氯化鈉0.5 g和瓊脂0.06 g于20 mL蒸餾水中,加熱煮沸至完全溶解,121 ℃高壓滅菌,待溫度降至45 ℃左右時(shí),向其中加入反式肉桂醛,使其終質(zhì)量濃度分別為0（對(duì)照）、1/64 MIC、1/32 MIC和1/16 MIC,混勻后倒入培養(yǎng)皿,制成泳動(dòng)平板。冷卻30 min后,吸取1.3.1節(jié)制備的菌懸液5 μL,接種至泳動(dòng)平板表面,37 ℃培養(yǎng)7 h。隨后使用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照,并測(cè)量副溶血性弧菌向周?chē)緞?dòng)區(qū)域（泳動(dòng)圈）的半徑,并計(jì)算出泳動(dòng)圈面積。

1.3.5 副溶血性弧菌ATCC 17802生物被膜形成能力的分析

1.3.5.1 結(jié)晶紫染色法定量檢測(cè)

參照Naves等[23]的方法,選取成膜能力較強(qiáng)的副溶血性弧菌ATCC 17802按照1.3.1節(jié)中的方法制備菌懸液,并將菌懸液濃度調(diào)整至OD600nm＝1.0,配制質(zhì)量濃度分別為1/32 MIC和1/16 MIC的反式肉桂醛溶液和菌液的混合液,以不含反式肉桂醛、3% NaCl TSB為空白對(duì)照,取各組混合液250 μL轉(zhuǎn)移至96 孔酶標(biāo)板后,分別置于10 ℃和25 ℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)24、48 h和72 h。測(cè)定各時(shí)間點(diǎn)時(shí)所有孔溶液的OD630nm。隨后,吸出菌液,每孔用無(wú)菌水漂洗一次,烘干20 min,再向每孔加入1 g/100 mL結(jié)晶紫溶液,室溫下染色20 min,染色結(jié)束后吸出染料,每孔用無(wú)菌水漂洗3 次,烘干30 min,然后用冰乙酸溶解。最后使用Model 680酶標(biāo)儀測(cè)定OD570nm。本實(shí)驗(yàn)副溶血性弧菌的生物被膜成膜能力用生物被膜形成（specific biofilm formation,SBF）指數(shù)表征,其按下式計(jì)算。

1.3.5.2 場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡定性觀察

參考Gowrishankar等[24]的方法,利用場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡定性觀察反式肉桂醛對(duì)副溶血性弧菌ATCC 17802生物被膜形成能力的影響。按照1.3.1節(jié)中的方法稍作修改制備菌懸液,將菌懸液調(diào)整至OD600nm＝1.0。將反式肉桂醛溶液與菌液等體積混合,使反式肉桂醛終質(zhì)量濃度分別為0（對(duì)照）、1/32 MIC和1/16 MIC,將玻璃片（直徑6 mm）浸入混合液中,置于25 ℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h。取出玻璃片后用無(wú)菌水漂洗15 s,再用新的無(wú)菌水清洗5 s。隨后加入體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛溶液,置于4 ℃冰箱12 h初步固定。使用PBS和無(wú)菌水分別清洗玻片約15 s,再加入沒(méi)過(guò)玻璃片的適量體積分?jǐn)?shù)1%鋨酸固定5 h。隨后用體積分?jǐn)?shù)30%、50%、70%、80%、90%和100%的乙醇溶液進(jìn)行梯度洗脫,每次約10 min,靜置晾干后進(jìn)行真空干燥及噴金處理,置于場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡下觀察。

1.3.5.3 副溶血性弧菌ATCC 17802黏附及侵入Caco-2細(xì)胞能力的測(cè)定

反式肉桂醛對(duì)副溶血性弧菌ATCC 17802黏附及侵入Caco-2細(xì)胞能力的測(cè)定參照Amalaradjou等[25]的方法。首先,將濃度為1×105cells/mL處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Caco-2細(xì)胞接種于24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中恒溫培養(yǎng)18 h,隨后,使用無(wú)菌PBS輕柔清洗3 次。取1.3.1節(jié)中菌懸液,添加反式肉桂醛溶液,使反式肉桂醛的質(zhì)量濃度分別為0（對(duì)照）、1/64 MIC、1/32 MIC和1/16 MIC,將樣品置于37 ℃恒溫?fù)u床（100 r/min）培養(yǎng)6 h。取出樣品進(jìn)行離心（5 000×g、5 min,4 ℃）,使用含體積分?jǐn)?shù)10% FBS的DMEM培養(yǎng)液稀釋菌體濃度至106CFU/mL。向預(yù)先培養(yǎng)的細(xì)胞中每孔分別加入1 mL菌懸液后離心（600×g、5 min）,隨后將上清液放入37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)1 h。

在黏附實(shí)驗(yàn)中,恒溫培養(yǎng)1 h后取出樣品并吸出孔板內(nèi)液體,使用無(wú)菌PBS清洗細(xì)胞3 次。向每孔中加入1 mL體積分?jǐn)?shù)0.1% Triton X-100,置于4 ℃下處理20 min后使細(xì)胞裂解,使用移液器取孔中液體來(lái)回吸打,使得細(xì)胞及其碎片充分懸浮于液體中,并將所有液體全部轉(zhuǎn)移至新的離心管中。將離心管中液體進(jìn)行10 倍梯度稀釋后涂布于3% NaCl TSA上,于37 ℃培養(yǎng)24 h后讀數(shù),計(jì)算黏附Caco-2細(xì)胞的菌體數(shù)量。相對(duì)黏附率以處理組黏附菌量占對(duì)照組黏附菌量的比例表示。

在侵入實(shí)驗(yàn)中,恒溫培養(yǎng)1 h后取出樣品并吸出孔板內(nèi)液體,使用無(wú)菌PBS清洗細(xì)胞1 次。向每孔中加入1 mL含有100 μL/mL慶大霉素和體積分?jǐn)?shù)1% FBS的DMEM培養(yǎng)液,于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)30 min以殺滅Caco-2胞外細(xì)菌。隨后離心（600×g、5 min）去除上清液并使用無(wú)菌PBS清洗3 次,向每孔中加入體積分?jǐn)?shù)0.1% Triton X-100,并置于4 ℃下作用20 min以裂解細(xì)胞。最后,使用無(wú)菌PBS 10 倍梯度稀釋進(jìn)行涂布,37 ℃下培養(yǎng)24 h后,讀數(shù)并計(jì)算侵入Caco-2細(xì)胞的菌體數(shù)量。相對(duì)侵入率以處理組侵入菌量與對(duì)照組侵入菌量的比值表示。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行獨(dú)立的3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn),采用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和作圖,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示,并通過(guò)SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析,采用T檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn),P＜0.05表示差異顯著,P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 反式肉桂醛對(duì)副溶血性弧菌的MIC結(jié)果

反式肉桂醛對(duì)副溶血性弧菌MIC的測(cè)定選取了2 種標(biāo)準(zhǔn)菌株和8 種分離菌株進(jìn)行,結(jié)果見(jiàn)表1。反式肉桂醛對(duì)副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 17802的MIC為50 μg/mL,對(duì)ATCC 33847的MIC為100 μg/mL,對(duì)8 株分離菌的MIC均為100～200 μg/mL。由于副溶血性弧菌ATCC 17802具有泳動(dòng)運(yùn)動(dòng)性、生物被膜形成能力、黏附及侵入Caco-2細(xì)胞能力等毒力表征[26],因此選擇ATCC 17802作為后續(xù)研究對(duì)象。

表1 反式肉桂醛對(duì)副溶血性弧菌的MICTable 1 MIC of trans- cinnamaldehyde against Vibrio parahaemolyticus

2.2 反式肉桂醛對(duì)副溶血性弧菌ATCC 17802的亞抑制濃度

圖1 反式肉桂醛對(duì)副溶血性弧菌ATCC 17802生長(zhǎng)曲線的影響Fig.1 Effect of trans-cinnamaldehyde on the growth curve of Vibrio parahaemolyticus ATCC 17802

反式肉桂醛對(duì)副溶血性弧菌ATCC 17802的生長(zhǎng)曲線的影響如圖1所示。與對(duì)照組相比,當(dāng)反式肉桂醛質(zhì)量濃度為1/2 MIC時(shí)細(xì)菌的延滯期明顯延長(zhǎng)。當(dāng)反式肉桂醛質(zhì)量濃度為1/4 MIC時(shí)細(xì)菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期與對(duì)照組相比有明顯的差異。當(dāng)反式肉桂醛質(zhì)量濃度為1/16 MIC、1/32 MIC、1/64 MIC時(shí),細(xì)菌的生長(zhǎng)情況與對(duì)照組相比幾乎無(wú)差異,細(xì)菌可正常生長(zhǎng)繁殖,因此,本研究選擇1/16 MIC、1/32 MIC、1/64 MIC為反式肉桂醛對(duì)副溶血性弧菌的亞抑制濃度。

2.3 反式肉桂醛對(duì)副溶血性弧菌ATCC 17802泳動(dòng)運(yùn)動(dòng)性的影響

圖2 反式肉桂醛對(duì)副溶血性弧菌ATCC 17802泳動(dòng)能力的抑制作用Fig.2 Trans-cinnamaldehyde inhibited swimming motility of Vibrio parahaemolyticus ATCC 17802

反式肉桂醛對(duì)副溶血性弧菌ATCC 17802泳動(dòng)運(yùn)動(dòng)性的影響如圖2所示。經(jīng)過(guò)反式肉桂醛處理的菌體泳動(dòng)圈面積與對(duì)照組相比明顯減小。對(duì)照組中副溶血性弧菌的泳動(dòng)圈面積為（7.22±0.05）cm2。與對(duì)照組相比,經(jīng)1/64 MIC的反式肉桂醛處理后,副溶血性弧菌ATCC 17802的泳動(dòng)圈面積極顯著降低至（5.01±0.18）cm2（P＜0.01）,1/32 MIC和1/16 MIC的反式肉桂醛處理后,泳動(dòng)圈面積分別極顯著降低至（4.76±0.22）cm2（P＜0.01）和（3.89±0.19）cm2（P＜0.01）。因此,亞抑制濃度的反式肉桂醛對(duì)副溶血性弧菌的泳動(dòng)運(yùn)動(dòng)性有良好的抑制作用。

2.4 反式肉桂醛對(duì)副溶血性弧菌ATCC 17802生物被膜形成能力的影響

圖3 不同質(zhì)量濃度反式肉桂醛在10 ℃（A）和25 ℃（B）作用下對(duì)副溶血性弧菌ATCC 17802生物被膜形成能力的影響Fig.3 Effect of different concentrations of trans-cinnamaldehyde on the biofilm formation ability of Vibrio parahaemolyticus ATCC 17802 at 10 ℃ (A) and 25 ℃ (B)

如圖3所示,副溶血性弧菌有較強(qiáng)的生物被膜形成能力,與對(duì)照組相比,在10 ℃下反式肉桂醛作用24 h后,1/32 MIC和1/16 MIC濃度條件使副溶血性弧菌ATCC 17802生物被膜形成量分別下降了29.59%和33.91%；作用48 h后分別極顯著下降了37.89%和47.31%（P＜0.01）；作用72 h后分別極顯著下降了40.86%和44.08%（P＜0.01）（圖3A）。與對(duì)照組相比,不同質(zhì)量濃度的反式肉桂醛對(duì)副溶血性弧菌ATCC 17802生物被膜的形成量均有抑制作用,并且呈濃度依賴(lài)性。

如圖3B所示,1/16 MIC的反式肉桂醛在25 ℃下作用24 h后對(duì)副溶血性弧菌的生物被膜形成能力有顯著的抑制作用（P＜0.05）；反式肉桂醛作用48 h后對(duì)副溶血性弧菌的生物被膜形成能力沒(méi)有顯著的抑制作用（P＞0.05）；在72 h時(shí),經(jīng)1/32 MIC反式肉桂醛處理的副溶血性弧菌ATCC 17802生物被膜形成量下降了5.68%,而1/16 MIC濃度使生物被膜形成量極顯著下降了45.44%（P＜0.01）。

2.5 副溶血性弧菌ATCC 17802形成的生物被膜微觀結(jié)構(gòu)

如圖4所示,對(duì)照組中副溶血性弧菌的生物被膜致密均勻,分布緊湊,布滿整個(gè)視野（圖4A）；而在1/32 MIC反式肉桂醛作用下,菌體形成的生物被膜稀疏、松散、分布不均（圖4B）；經(jīng)1/16 MIC反式肉桂醛處理后,菌體形成生物被膜時(shí),生物被膜中的細(xì)菌量明顯減少,生物被膜結(jié)構(gòu)更加松散（圖4C）。結(jié)果表明,反式肉桂醛能夠抑制副溶血性弧菌ATCC 17802生物被膜的形成能力,且呈質(zhì)量濃度依賴(lài)性。

圖4 副溶血性弧菌ATCC 17802形成的生物被膜掃描電子顯微鏡圖Fig.4 Scanning electron micrographs of biofilm formed by Vibrio parahaemolyticus ATCC 17802

2.6 反式肉桂醛對(duì)副溶血性弧菌ATCC 17802黏附及侵入Caco-2細(xì)胞能力的影響

圖5 反式肉桂醛對(duì)副溶血性弧菌ATCC 17802黏附（A）及侵入（B）Caco-2細(xì)胞的影響Fig.5 Effect of trans-cinnamaldehyde on the ability of Vibrio parahaemolyticus ATCC 17802 to adhere to (A) and invade (B) Caco-2 cells

如圖5A所示,反式肉桂醛能夠顯著降低副溶血性弧菌黏附Caco-2細(xì)胞的能力,并且呈濃度依賴(lài)性,當(dāng)反式肉桂醛質(zhì)量濃度為1/64 MIC時(shí),細(xì)菌的黏附率降低至對(duì)照組的44.2%；當(dāng)反式肉桂醛質(zhì)量濃度為1/32 MIC和1/16 MIC時(shí),細(xì)菌的相對(duì)黏附率分別降至42.9%和24.9%,與對(duì)照組呈現(xiàn)極顯著差異（P＜0.01）。

由圖5B可知,反式肉桂醛對(duì)副溶血性弧菌ATCC 17802侵入Caco-2能力具有明顯的抑制作用,并且隨反式肉桂醛質(zhì)量濃度的增加,相對(duì)侵入率逐漸下降。與對(duì)照組相比,當(dāng)反式肉桂醛質(zhì)量濃度為1/64 MIC和1/32 MIC時(shí),細(xì)菌的相對(duì)侵入率分別降至對(duì)照組的58.2%和48.3%,與對(duì)照組呈顯著性差異（P＜0.05）；當(dāng)反式肉桂醛質(zhì)量濃度為1/16 MIC時(shí),細(xì)菌的相對(duì)侵入率降至對(duì)照組的34.5%,與對(duì)照組呈極顯著差異（P＜0.01）。

3 討 論

本研究首先測(cè)定了反式肉桂醛對(duì)副溶血性弧菌的MIC,以評(píng)價(jià)反式肉桂醛對(duì)副溶血性弧菌的抑菌功效。結(jié)果表明,反式肉桂醛對(duì)副溶血性弧菌的MIC為50～200 μg/mL,抑菌效果良好。選擇1/16 MIC、1/32 MIC、1/64 MIC為反式肉桂醛對(duì)副溶血性弧菌的亞抑制濃度,在亞抑制濃度下,細(xì)菌的生長(zhǎng)及存活不會(huì)受到影響,因此實(shí)驗(yàn)可排除反式肉桂醛對(duì)細(xì)菌存活及生長(zhǎng)的影響。在Li Guanghui等[27]研究安石榴苷對(duì)沙門(mén)氏菌泳動(dòng)運(yùn)動(dòng)能力和侵入HT29細(xì)胞能力的影響時(shí),選用了1/16 MIC和1/32 MIC為亞抑制濃度；Sivaranjani等[28]發(fā)現(xiàn),亞抑制濃度（1/4 MIC、1/8 MIC、1/16 MIC）的桑色素可對(duì)單增李斯特菌的毒力因子產(chǎn)生有效的抑制作用；本實(shí)驗(yàn)研究了亞抑制濃度（1/16 MIC、1/32 MIC、1/64 MIC）反式肉桂醛對(duì)副溶血性弧菌運(yùn)動(dòng)性、生物被膜形成能力、黏附及侵入Caco-2細(xì)胞能力的影響,旨在共同闡述反式肉桂醛對(duì)副溶血性弧菌毒力因子的抑制作用。

副溶血性弧菌的運(yùn)動(dòng)性與其毒力密切相關(guān),并且影響著其對(duì)宿主細(xì)胞的黏附及侵入能力[26]。細(xì)菌依靠鞭毛的定向運(yùn)動(dòng)是病原菌作用于宿主細(xì)胞并引發(fā)感染的第一步,因此抑制病原菌的運(yùn)動(dòng)性可有效降低其感染能力[29]。在本研究中,與對(duì)照相比,經(jīng)亞抑制濃度反式肉桂醛作用后的副溶血性弧菌的泳動(dòng)圈直徑極顯著下降,表明反式肉桂醛能夠有效抑制副溶血性弧菌的運(yùn)動(dòng)能力。Upadhay等[30]證明了亞抑制濃度的反式肉桂醛能將空腸彎曲桿菌的泳動(dòng)運(yùn)動(dòng)能力降低70%以上；Packiavathy等[31]發(fā)現(xiàn)100 μg/mL的姜黃素可使副溶血性弧菌的泳動(dòng)運(yùn)動(dòng)能力顯著降低；Bai Jinrong等[32]證明0.312 5、0.625 mg/mL和1.250 mg/mL的莽草酸可抑制金黃色葡萄球菌的運(yùn)動(dòng)能力。本研究中,亞抑制濃度的肉桂醛可顯著降低副溶血性弧菌的運(yùn)動(dòng)性,從而降低了副溶血性弧菌侵染宿主引起感染的可能性。Guo Du等[26]研究發(fā)現(xiàn),百里醌可通過(guò)降低鞭毛合成基因flaA、flaM和flaL的相對(duì)轉(zhuǎn)錄量來(lái)抑制副溶血性弧菌的運(yùn)動(dòng)性,而反式肉桂醛是否是通過(guò)降低flaA、flaM和flaL基因相對(duì)轉(zhuǎn)錄量來(lái)阻礙副溶血性弧菌鞭毛的合成,從而抑制副溶血性弧菌的運(yùn)動(dòng)能力,還有待進(jìn)一步探討。

細(xì)菌的生物被膜可使細(xì)菌產(chǎn)生對(duì)抗生素的抗性[33],并且生物被膜形成的封閉基質(zhì)還能夠增加細(xì)菌對(duì)環(huán)境壓力的耐受性[34]。在該研究中,采用結(jié)晶紫染色法將結(jié)晶紫與胞外多糖結(jié)合,檢測(cè)洗脫液的SBF指數(shù),進(jìn)行生物被膜定量檢測(cè),并通過(guò)場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡對(duì)樣品進(jìn)行電子照射,定性地觀察由副溶血性弧菌形成的生物被膜。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,隨著反式肉桂醛質(zhì)量濃度的增加,副溶血性弧菌生物被膜的形成量相比于對(duì)照組下降明顯,并且生物被膜結(jié)構(gòu)松散。證明了反式肉桂醛對(duì)副溶血性弧菌的生物被膜形成能力具有良好的抑制作用。Kang Jiamu等[35]利用結(jié)晶紫染色法發(fā)現(xiàn),0.25～2.00 mg/mL的沒(méi)食子酸可顯著抑制福氏志賀菌生物被膜的生成量；Fan Qiuxia等[36]利用場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),1/16 MIC和1/32 MIC的輔酶Q0可以使單增李斯特菌形成的生物被膜變薄、結(jié)構(gòu)變松散；張芳等[37]用1、5、10 μg/mL的白藜蘆醇處理單增李斯特菌后,其生物被膜形成量分別減少10.40%、21.03%和39.10%。在本研究中,反式肉桂醛能夠有效抑制副溶血性弧菌的生物被膜生成量,這會(huì)使得副溶血性弧菌對(duì)環(huán)境壓力的抵抗能力降低,從而降低其危害性。群體感應(yīng)是影響細(xì)菌生物被膜形成的主要因素之一[38],細(xì)菌間的群體感應(yīng)由細(xì)菌合成、分泌的AI-2信號(hào)分子所調(diào)控,而由luxS基因編碼合成的LuxS蛋白是AI-2分子合成的關(guān)鍵酶[39]。反式肉桂醛是否能通過(guò)抑制luxS基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄量來(lái)抑制其生物被膜的形成,還需要進(jìn)行進(jìn)一步探究。

黏附及侵入宿主腸上皮細(xì)胞是食源性致病菌感染宿主的必要途徑[40]。有研究表明,病原菌的黏附作用可使細(xì)菌黏附在宿主細(xì)胞表面,并且黏附作用為致病菌侵入宿主細(xì)胞進(jìn)而引發(fā)宿主的感染提供了有利條件[41]。副溶血性弧菌能夠通過(guò)口腔進(jìn)入人體胃腸道,進(jìn)而黏附及侵入腸上皮細(xì)胞引發(fā)感染。因此,抑制副溶血性弧菌黏附及侵入腸上皮細(xì)胞的能力是降低其毒力的有效方法。本研究結(jié)果表明,反式肉桂醛能夠降低副溶血性弧菌黏附及侵入Caco-2細(xì)胞的能力。在先前的研究中,Shi Chao等[21]證明了1/16 MIC、1/32 MIC、1/64 MIC檸檬醛可有效降低阪崎克羅諾腸桿菌黏附及侵入Caco-2細(xì)胞的能力；Inamuco等[11]研究表明,雖然香芹酚不會(huì)影響沙門(mén)氏菌的黏附能力,但會(huì)使其侵入腸上皮細(xì)胞的能力降低。本研究結(jié)果表明,反式肉桂醛可降低副溶血性弧菌侵染宿主細(xì)胞的能力,降低副溶血性弧菌對(duì)人體的感染能力。Sun Yi等[2]研究發(fā)現(xiàn),副溶血性弧菌黏附及侵入宿主細(xì)胞的能力與副溶血性弧菌的運(yùn)動(dòng)能力有關(guān),因此推測(cè),副溶血性弧菌黏附及侵入Caco-2細(xì)胞能力的減弱是由于反式肉桂醛阻礙了副溶血性弧菌鞭毛的合成,導(dǎo)致其運(yùn)動(dòng)性減弱。

綜上所述,反式肉桂醛對(duì)副溶血性弧菌有良好的抑制效果,其對(duì)副溶血性弧菌的MIC為50～200 μg/mL；并且亞抑制濃度的反式肉桂醛可抑制副溶血性弧菌的多種毒力因子,包括副溶血性弧菌的泳動(dòng)運(yùn)動(dòng)能力、生物被膜形成能力、黏附及侵入Caco-2細(xì)胞能力。以上研究結(jié)果表明,反式肉桂醛具有降低副溶血性弧菌對(duì)人體的感染能力的潛力,這為反式肉桂醛的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用于控制副溶血性弧菌引起的食源性疾病提供了理論依據(jù)。