腦脊液環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增和GeneXpert MTB/RIF在結(jié)核性腦膜炎早期診斷中的效能分析

樊麗超 陳宇 朱雅娟 曹宏麗

[摘要] 目的 分析和比較腦脊液環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）和GeneXpert MTB/RIF（簡(jiǎn)稱GeneXpert）在結(jié)核性腦膜炎早期診斷中的效能。 方法 選取沈陽(yáng)市胸科醫(yī)院2018年6月～2019年6月疑診結(jié)核性腦膜炎的患者189例，采集患者抗結(jié)核治療前的腦脊液標(biāo)本分別進(jìn)行液體培養(yǎng)（MGIT）、LAMP和GeneXpert檢測(cè)。以液體培養(yǎng)法（MGIT）為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算2種檢測(cè)技術(shù)在結(jié)核性腦膜炎診斷中的敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、一致率、Kappa值。 結(jié)果 LAMP的敏感度為79.6%，特異度為94.3%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為83.0%，陰性預(yù)測(cè)值93.0%，一致率90.5%，Kappa值=0.749。GeneXpert的敏感度為98.0%，特異度為88.6%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為75.0%，陰性預(yù)測(cè)值為99.2%，一致率為91.0%，Kappa值=0.787。 結(jié)論 LAMP和GeneXpert對(duì)結(jié)核性腦膜炎檢測(cè)的靈敏度較液體培養(yǎng)（MGIT）明顯提高，可以在一定程度上提高臨床醫(yī)生對(duì)疑似結(jié)核性腦膜炎患者的診治能力，值得在基層結(jié)核病院實(shí)驗(yàn)室廣泛推廣。

[關(guān)鍵詞] 結(jié)核性腦膜炎;腦脊液;環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增

[中圖分類號(hào)] R529.3? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2020）17-0128-04

Effectiveness analysis of CSF loop-mediated isothermal amplification and GeneXpert MTB/RIF in the early diagnosis of tuberculous meningitis

FAN Lichao? ?CHEN Yu? ?ZHU Yajuan? ?CAO Hongli

Department of Tuberculosis， the Tenth People's Hospital of Shenyang（Shenyang Chest Hospital）， Shenyang? ?110044， China

[Abstract] Objective To analyze and compare the efficacy of cerebrospinal fluid loop-mediated isothermal amplification（LAMP） and GeneXpert MTB/RIF（GeneXpert） in the early diagnosis of tuberculous meningitis. Methods A total of 189 patients with suspected tuberculous meningitis from Shenyang Chest Hospital from June 2018 to June 2019 were selected. Cerebrospinal fluid samples from patients before antituberculosis treatment were collected for mycobacterium growth indicator tube（MGIT）， LAMP， and GeneXpert tests. Using the mycobacterium growth indicator tube（MGIT） as the standard， the sensitivity， specificity， positive predictive value， negative predictive value， agreement rate， and Kappa value of the two detection techniques in the diagnosis of tuberculous meningitis were calculated. Results The sensitivity of LAMP was 79.6%， the specificity was 94.3%， the positive predictive value was 83.0%， the negative predictive value was 93.0%， the agreement rate was 90.5%， and the Kappa value was 0.749. The sensitivity of GeneXpert was 98.0%， the specificity was 88.6%， the positive predictive value was 75.0%， the negative predictive value was 99.2%， the agreement rate was 91.0%， and the Kappa value of 0.787. Conclusion The LAMP and GeneXpert in the detection of tuberculous meningitis have significantly higher sensitivity than that of mycobacterium growth indicator tube（MGIT）， which can improve the diagnosis and treatment ability of clinicians to patients with suspected tuberculous meningitis. It is worthy of widespread promotion in the laboratory of primary tuberculosis hospital.

[Key words] Tuberculous meningitis; Cerebrospinal fluid; Loop-mediated isothermal amplification

結(jié)核性腦膜炎（tuberculous meningitis，TBM）是腦膜非化膿性炎癥，多數(shù)由結(jié)核分枝桿菌經(jīng)血液循環(huán)或直接途徑侵入蛛網(wǎng)膜下間隙而引起，是結(jié)核病中最嚴(yán)重的類型之一，該病發(fā)病急緩不定，但病程都較長(zhǎng)，致殘率和死亡率高，故早期診斷和盡早合理規(guī)范的治療，對(duì)改善患者的預(yù)后，降低后遺癥的發(fā)病率至關(guān)重要[1]。

傳統(tǒng)的TBM診斷金標(biāo)準(zhǔn)為腦脊液抗酸染色陽(yáng)性或腦脊液結(jié)核菌培養(yǎng)陽(yáng)性，但抗酸染色陽(yáng)性率極低，結(jié)核菌培養(yǎng)耗時(shí)長(zhǎng)，對(duì)TBM的早期診斷價(jià)值有限。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術(shù)是可以檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的一種新型的恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，該方法操作簡(jiǎn)單，報(bào)告快速，不需要昂貴的儀器設(shè)備，比較適合在基層實(shí)驗(yàn)室推廣應(yīng)用[2]。而GeneXpert MTB/RIF（簡(jiǎn)稱GeneXpert）是一種新的利福平耐藥實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增技術(shù)，目前在肺結(jié)核的檢測(cè)中敏感度和特異度較高，并且可用于腦脊液的檢測(cè)[3]，本文對(duì)沈陽(yáng)市胸科醫(yī)院收治的189例疑診TBM的患者進(jìn)行了腦脊液LAMP和腦脊液GeneXpert檢測(cè)，以腦脊液液體培養(yǎng)（MGIT）為金標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)價(jià)兩種檢測(cè)手段檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的敏感度和特異度，探討其對(duì)結(jié)核性腦膜炎的診斷價(jià)值。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2018年6月～2019年6月沈陽(yáng)市胸科醫(yī)院結(jié)核七病區(qū)疑診TBM的患者189例，采集患者抗結(jié)核治療前的腦脊液標(biāo)本分別進(jìn)行液體培養(yǎng)（MGIT）、LAMP和GeneXpert檢測(cè)。

1.2 研究方法

1.2.1 腦脊液的采集和檢測(cè)? 所有患者均取入院后第一次腰穿腦脊液3 mL，標(biāo)本采集前患者或家屬均簽署用于本次臨床試驗(yàn)采取標(biāo)本的知情同意書(shū)。所有實(shí)驗(yàn)部分均由沈陽(yáng)市胸科醫(yī)院結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室完成。

1.2.2 MGIT液體培養(yǎng)? 收集患者抗結(jié)核治療前的腦脊液，經(jīng)4%NaOH溶液處理，取0.1 mL接種于酸性羅氏培養(yǎng)基，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，MGIT960液體培養(yǎng)系統(tǒng)由美國(guó)BD公司生產(chǎn)，將腦脊液標(biāo)本按照BACTECTM MGIT生產(chǎn)規(guī)范（MGITTM Procedure Manual）要求進(jìn)行培養(yǎng)[4]。

1.2.3 LAMP法? 收集患者抗結(jié)核治療前的腦脊液，采用熒光目測(cè)試劑盒[榮研生物科技（中國(guó)）有限公司]，腦脊液吸入吸附劑試管中混勻裂解（90℃，5 min）。將吸附管裝到樣本處理管上，搖晃5～10次后提取核酸，加上滴注蓋，輕壓樣本處理管將樣本滴入反應(yīng)管中。充分混合后進(jìn)行LAMP反應(yīng)，于67℃反應(yīng)40 min，然后放入恒溫?zé)晒夂怂釘U(kuò)增LF-160的熒光目視檢測(cè)單元，通過(guò)紫外線激發(fā)熒光觀察反應(yīng)結(jié)果[5]。

1.2.4 GeneXpert? GeneXpert檢測(cè)儀及試劑盒由美國(guó)Cepheid公司生產(chǎn)，具體操作按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。收集患者抗結(jié)核治療前的腦脊液，向1 mL腦脊液中加入1 mL樣本處理充分混勻，放置15 min并間斷搖晃，然后用無(wú)菌吸管將2 mL液體移入塑料試劑盒中，后者插入GeneXpert檢測(cè)平臺(tái)中，輸入樣品相關(guān)信息后運(yùn)行儀器會(huì)自動(dòng)進(jìn)行樣品的過(guò)濾和洗滌，超聲溶菌釋放出DNA后與PCR反應(yīng)試劑混合，半巢式實(shí)時(shí)擴(kuò)增并檢測(cè)熒光信號(hào)，根據(jù)循環(huán)閾值的高（CT<16）、中（1628）的判定標(biāo)準(zhǔn)，2 h后儀器自動(dòng)給出檢測(cè)結(jié)果[6]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算LAMP和GeneXpert的敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、一致率和Kappa值。

2 結(jié)果

2.1 腦脊液LAMP檢測(cè)結(jié)果及腦脊液GeneXpert檢測(cè)結(jié)果

將189例患者的腦脊液標(biāo)本進(jìn)行液體培養(yǎng)（MGIT）、LAMP和GeneXpert檢測(cè)，液體培養(yǎng)陽(yáng)性49例（25.93%），LAMP陽(yáng)性47例（24.87%），GeneXpert陽(yáng)性64例（33.86%）（表1、2）。

2.2 以液體培養(yǎng)檢測(cè)結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)判斷LAMP和GeneXpert檢測(cè)技術(shù)的診斷效能

以液體培養(yǎng)結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，LAMP的敏感度為79.6%，特異度為94.3%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為83.0%，陰性預(yù)測(cè)值93.0%，一致率90.5%，Kappa值=0.749，說(shuō)明兩者一致性較好。以液體培養(yǎng)結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，GeneXpert的敏感度為98.0%，特異度為88.6%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為75.0%，陰性預(yù)測(cè)值為99.2%，一致率為91.0%，Kappa值=0.787，說(shuō)明兩者一致性較好（表3）。

3討論

TBM是結(jié)核病最嚴(yán)重的類型之一，據(jù)統(tǒng)計(jì)，2017年全世界有1000萬(wàn)人罹患結(jié)核，其中每年估計(jì)有10多萬(wàn)例TBM新病例。面對(duì)如此嚴(yán)峻的疫情，TBM的診斷和治療情況卻不是很樂(lè)觀，因?yàn)門BM的臨床癥狀不典型，腦脊液載菌量低，導(dǎo)致病原學(xué)診斷率很低[7]。有文獻(xiàn)報(bào)道，早期確診的結(jié)核性腦膜炎病死率低于10%，而晚期確診的結(jié)核性腦膜炎病死率高達(dá)60%以上[8]。因此早期診斷對(duì)TBM患者至關(guān)重要，LAMP和GeneXpert等新的診斷技術(shù)的出現(xiàn)，有望提高結(jié)核性腦膜炎的早期診斷效率，以改善TBM患者的預(yù)后，提高治愈率，降低致殘率和死亡率。

本研究中腦脊液LAMP法檢測(cè)的敏感度為79.6%，特異度為94.3%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為83.0%，陰性預(yù)測(cè)值93.0%，一致率90.5%，Kappa值=0.749，說(shuō)明兩者一致性較好。因此可認(rèn)為L(zhǎng)AMP的檢測(cè)結(jié)果接近液體培養(yǎng)（MGIT）結(jié)果，且比液體培養(yǎng)（MGIT）可檢測(cè)出更多的病原學(xué)陽(yáng)性患者。劉洋等[9]采用LAMP檢測(cè)結(jié)核性胸膜炎患者的胸腔積液標(biāo)本，靈敏度高達(dá)75.8%，顯著高于涂片法的39.6%，證明LAMP檢測(cè)可廣泛應(yīng)用于肺外結(jié)核標(biāo)本的檢測(cè)，且陽(yáng)性率更高。

孫雯雯等[10]報(bào)道，在環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)早期診斷結(jié)核性腦膜炎的研究中，在LAMP法檢測(cè)陽(yáng)性的病例中，有2例最后排除結(jié)核性腦膜炎診斷，提示本研究存在一定的假陽(yáng)性率，主要原因可能是LAMP技術(shù)的高敏感性使樣品與反應(yīng)體系污染，因此為了避免假陽(yáng)性的出現(xiàn)，在操作工程中需實(shí)行分區(qū)操作，注意防止樣品間的交叉污染，嚴(yán)格控制可能導(dǎo)致污染的機(jī)會(huì)，避免假陽(yáng)性的出現(xiàn)。

另外，本實(shí)驗(yàn)也分析了LAMP檢測(cè)與液體培養(yǎng)不一致的18例結(jié)果，其中LAMP檢測(cè)陽(yáng)性而液體培養(yǎng)檢測(cè)陰性為8例，LAMP檢測(cè)陰性同時(shí)液體培養(yǎng)陽(yáng)性者10例。分析原因可能為：①液體培養(yǎng)陽(yáng)性而LAMP陰性：標(biāo)本性狀的影響，操作者采樣位置的影響，因LAMP只需要60 μL的標(biāo)本，采樣時(shí)有可能會(huì)錯(cuò)過(guò)陽(yáng)性部位。②液體培養(yǎng)陰性而LAMP陽(yáng)性：液體培養(yǎng)法檢出為活菌，而LAMP檢測(cè)的對(duì)象為結(jié)核分枝桿菌DNA，無(wú)論細(xì)菌是否存活皆能檢出[11]。

目前GeneXpert檢測(cè)痰標(biāo)本用于肺結(jié)核的診斷已得到國(guó)際上的認(rèn)可，文獻(xiàn)報(bào)道GeneXpert的靈敏度和特異度均很高，肺結(jié)核診斷總特異性為98.4%，總靈敏度為90.4%。但其對(duì)腦脊液、胸腹腔積液、關(guān)節(jié)液和心包積液等不同標(biāo)本的敏感度有較高的異質(zhì)性，需要更深的更大樣本量的研究[12]。在本研究中GeneXpert的敏感度為98.0%，特異度為88.6%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為75.0%，陰性預(yù)測(cè)值為99.2%，一致率為91.0%，Kappa值=0.787，說(shuō)明兩者一致性較好。GeneXpert能夠快速檢測(cè)腦脊液中的結(jié)核分枝桿菌以及利福平耐藥，靈敏度較高，但陰性結(jié)果無(wú)法排除TBM的診斷[13]。目前國(guó)內(nèi)外已經(jīng)有多個(gè)研究，對(duì)超過(guò)1000份腦脊液進(jìn)行GeneXpert檢測(cè)，評(píng)價(jià)GeneXpert診斷TBM的靈敏度約為80%，但是這些研究的腦脊液標(biāo)本量較少，2009年英國(guó)感染學(xué)會(huì)《中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)核病診斷和治療指南》建議，對(duì)于TBM患者，應(yīng)該在抗結(jié)核藥物治療前留取不少于6 mL腦脊液進(jìn)行病原學(xué)檢查，因此如果可能希望能夠每例獲得6 mL腦脊液通過(guò)離心富集結(jié)核菌進(jìn)一步評(píng)價(jià)GeneXpert的檢測(cè)價(jià)值。

在本研究中，采用LAMP和GeneXpert檢測(cè)腦脊液敏感度和特異度較高，甚至高于國(guó)外的一些研究，考慮與納入的研究樣本有關(guān)，我科室收治的患者為遼寧省內(nèi)疑難重癥病例，多為晚期TBM，患者病情重，腦脊液載菌量高有關(guān)，所以LAMP和GeneXpert檢測(cè)的陽(yáng)性率較高。

綜上所述，LAMP作為一種新型的核酸擴(kuò)增技術(shù)，所需的儀器設(shè)備簡(jiǎn)單，價(jià)格低廉?？梢葬槍?duì)靶基因設(shè)計(jì)引物，有較高特異性，且整個(gè)擴(kuò)增過(guò)程較快，約60 min即可完成，操作步驟簡(jiǎn)單，肉眼即可判斷結(jié)果，對(duì)檢驗(yàn)人員要求較低[14]。與傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)檢測(cè)手段相比，其操作更加容易、便捷、生物安全性更好。GeneXpert可檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌感染和RIF耐藥基因，擴(kuò)增的靶基因?yàn)槔Ｆ侥退幓蛳嚓P(guān)基因的81個(gè)堿基對(duì)的高突變熱點(diǎn)區(qū)域，整個(gè)過(guò)程用時(shí)短，約2 h可完成，操作簡(jiǎn)單，幾乎為全自動(dòng)化檢測(cè)，全天可完成超過(guò)1000個(gè)樣本[15]。且GeneXpert陽(yáng)性率明顯高于液體培養(yǎng)，在有條件的醫(yī)療機(jī)構(gòu)，有較廣泛的應(yīng)用前景。LAMP和GeneXpert對(duì)TBM檢測(cè)的靈敏度較液體培養(yǎng)（MGIT）明顯提高，并且與液體培養(yǎng)結(jié)果一致性較好，GeneXpert同時(shí)可提供利福平耐藥情況，LAMP操作簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉，可以在一定程度上提高臨床醫(yī)生對(duì)疑似TBM患者的診治能力，值得在基層結(jié)核病院實(shí)驗(yàn)室廣泛推廣。

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（收稿日期：2020-02-05）