GFAP聯(lián)合cfDNA測定在復(fù)雜性熱性驚厥腦損傷中的臨床研究

凌寅杰朱焰 施明杰 路攀 袁琛

[摘要] 目的 研究復(fù)雜性熱性驚厥患兒靜脈血GFAP濃度、靜脈血和腦脊液的cfDNA含量，并評價兩者的相關(guān)性。方法 選擇2019年1～12月在湖州市第一人民醫(yī)院住院治療的78例CFS患兒作為研究組，選擇同期因發(fā)熱疑似伴顱內(nèi)感染，最終經(jīng)腦脊液檢查、腦電圖、頭顱MRI和病情觀察排除顱內(nèi)感染的住院患兒27例為對照組。分別測定兩組患兒入院第1天和第5天的靜脈血GFAP濃度，測定兩組患兒入院當(dāng)天的靜脈血和腦脊液cfDNA含量。結(jié)果 研究組患兒靜脈血GFAP水平（第1天和第5天）均較對照組水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。研究組患兒與對照組患兒之間的腦脊液cfDNA完整度具有顯著性差異，且研究組患兒的腦脊液cfDNA含量較對照組顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）?；純红o脈血GFAP水平與腦脊液cfDNA水平呈正相關(guān)關(guān)系。 結(jié)論 通過GFAP聯(lián)合cfDNA含量測定，證實CFS患兒在分子和細(xì)胞層面存在驚厥后腦損傷。驚厥導(dǎo)致腦損傷的持續(xù)性，而非短暫消失，并可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡，引起腦脊液cfDNA濃度明顯增加。

[關(guān)鍵詞] GFAP;cfDNA;復(fù)雜性熱性驚厥;腦脊液;相關(guān)關(guān)系

[中圖分類號] R720.597? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2020）17-0029-04

Clinical study of GFAP combined with cfDNA determination in brain damage caused by complex febrile seizures

LING Yinjie? ?ZHU Yan? ?SHI Mingjie? ?LU Pan? ?YUAN Chen

Department of Pediatrics， Huzhou First Peoples Hospital in Zhejiang Province， Huzhou? ?313000， China

[Abstract] Objective To study the GFAP concentration of venous blood， cfDNA content in venous blood and cerebrospinal fluid in children patients with complex febrile seizures， and to evaluate the correlation between the two. Methods From January 2019 to December 2019， 78 children patients with CFS who were hospitalized for treatment in Huzhou First People's Hospital were selected as the study group. 27 hospitalized children patients suspected to be complicated with intracranial infection due to fever during the same period， who were excluded from intracranial infection through cerebrospinal fluid examination， electroencephalogram， skull MRI， and disease observation， were selected as the control group. The venous blood GFAP concentration in the two groups of children patients was determined on Day 1 and Day 5 of admission. The venous blood and cerebrospinal fluid（cfDNA） contents of the two groups of children patients were determined on the day of admission. Results The venous blood GFAP levels in the study group（Day 1 and Day 5） were higher than those in the control group， and the difference was statistically significant（P<0.05）. There were significant differences in cerebrospinal fluid cfDNA integrity in children patients between the study group and the control group. The content of cfDNA in cerebrospinal fluid in the study group was increased significantly compared with that in the control group， and the difference was statistically significant（P<0.05）. There was a positive correlation between venous blood GFAP levels and cerebrospinal fluid cfDNA levels in children patients. Conclusion GFAP combined with cfDNA determination confirms that children patients with CFS have brain damage after seizures at the molecular and cellular levels. Seizures cause persistent， not temporary disappearance of brain damage， and can lead to the death of nerve cells， causing a significant increase in cerebrospinal fluid cfDNA concentration.

[Key words] GFAP; cfDNA; Complex febrile seizures; Cerebrospinal fluid; Correlation

復(fù)雜性熱性驚厥（complex febrile seizures，CFS），是兒童期常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。目前CFS的具體發(fā)病機(jī)制不清，如離子通道機(jī)制、腦脊液的酸堿平衡異常、神經(jīng)遞質(zhì)失調(diào)等[1]。單純性熱性驚厥的患兒演變?yōu)榘d癇的概率約2%～5%，而CFS則是其3.6倍[2]。除了增加罹患癲癇的風(fēng)險外，CFS還可以造成不同程度的腦損傷。神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白（Glial fibrillary acidicprotein，GFAP）可作為驚厥后腦損傷的標(biāo)志物[3]，但不能評價是否存在神經(jīng)細(xì)胞壞死。循環(huán)游離DNA（circulating cell-free DNA，cfDNA）是存在于人體中，在細(xì)胞外處于游離狀態(tài)的DNA分子，其在人體血液和組織液等中均可檢出。cfDNA的相關(guān)檢測在產(chǎn)前診斷中已經(jīng)取得了很多研究進(jìn)展，另外通過對外傷、中風(fēng)、顱內(nèi)腫瘤和自身免疫性疾病患者的研究發(fā)現(xiàn)，其體內(nèi)的cfDNA水平大大高于健康人[4-6]。而對于cfDNA在CFS患者中的研究報道較少。

本研究通過對78例CFS患兒和27例疑似顱內(nèi)感染患兒的靜脈血和腦脊液cfDNA含量，以及不同時期靜脈血GFAP濃度進(jìn)行測定，首次探討cfDNA含量與CFS腦損傷的關(guān)系，同時對于兩組患兒靜脈血及腦脊液cfDNA含量與靜脈GFAP濃度的相關(guān)性進(jìn)行統(tǒng)計分析，為臨床上的診斷及預(yù)后提供參考。

1資料與方法

1.1臨床資料

選擇2019年1～12月在湖州市第一人民醫(yī)院住院診斷為復(fù)雜性熱性驚厥的患兒共78例設(shè)為研究組，同期因發(fā)熱疑似伴顱內(nèi)感染，最終經(jīng)腦脊液檢查、腦電圖、頭顱MRI和病情觀察排除顱內(nèi)感染的住院患兒27例為對照組。研究組男48例，女30例，平均年齡（17.2±1.5）個月，平均發(fā)熱時間（4.2±0.4）d;對照組男16例，女11例，平均年齡（18.1±1.5）個月，平均發(fā)熱時間（3.9±0.5）d，兩組患兒的性別、年齡、平均發(fā)熱時間無顯著性差異（P>0.05），可進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。所有參與本研究的患兒家屬均簽署知情同意書，本研究經(jīng)湖州市第一人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2納入標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)國內(nèi)《熱性驚厥診斷治療與管理專家共識》（2016）[7]，CFS無嚴(yán)格限定年齡，在驚厥發(fā)作時，發(fā)熱超過38℃或者至少在發(fā)作后出現(xiàn)發(fā)熱，同時符合以下四項的一項及以上：①一次驚厥持續(xù)時間大于>15 min。②24 h內(nèi)反復(fù)發(fā)作2次及以上。③局灶性發(fā)作。④發(fā)作后可有異常的神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn)或既往有神經(jīng)系統(tǒng)缺陷。

1.3排除標(biāo)準(zhǔn)

①中樞神經(jīng)系統(tǒng)急性或慢性疾病，如感染、外傷、出血、占位等。②患有嚴(yán)重的其他系統(tǒng)基礎(chǔ)疾病（如紫紺性心臟病、肝腎功能不全等）。③嚴(yán)重的遺傳代謝性疾病[8]。

1.4 方法

1.4.1 靜脈血GFAP濃度測定? 所有研究組、對照組患兒于入院第1天和第5天，分別采集靜脈血2 mL。待血液靜置后，在離心機(jī)中以4000 r/min 的速度離心5 min，留取血清后用-20℃冰箱中冷凍、保存、待測。采用ELISA法進(jìn)行血清GFAP檢測，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明，檢測試劑盒購于上?，庬嵣锟萍脊尽?/p>

1.4.2靜脈血和腦脊液cfDNA濃度及完整性測定? ? 兩組患兒于入院當(dāng)天抽取靜脈血3 mL，通過腰椎穿刺術(shù)留取腦脊液3 mL，將所采標(biāo)本置于EDTA管中，離心（2500 rpm，5 min）后取上清液，利用FirePureTM Circulating Free DNA Mini Kit試劑盒（蘇州）提取cfDNA，每個標(biāo)本最終洗脫體積為50 μL。提取的DNA經(jīng)NanoDrop ND-1000核酸定量儀測定吸光度（A260/A280），取比值為1.6～1.8的樣本并對各樣本濃度進(jìn)行測定。cfDNA完整性檢測采用定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）技術(shù)測定血漿ALU115基因（115bp）和ALU247基因（247bp）濃度，以ALU115/ALU247表示cfDNA的完整性。RT-PCR方法見參考文獻(xiàn)[9]。RT-PCR檢測ALU長短片段含量：根據(jù)TaKaRa公司SYBR Green Real-time PCR試劑盒的流程進(jìn)行操作。引物序列：ALU-115bp上游5-CCTGAGGTCAGGAGTTCGAG-3，下游5-CCCGAGTAGCTGGGATTACA-3;ALU247 bp上游5-GTGGCTCACGCCTGTAATC-3，下游5-CAGGCTGGAGTGCAGTGG-3，以上2對PCR引物均由上海生工生物工程公司合成。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火31 s，72℃延伸 32 s，40個循環(huán)，反應(yīng)液配制在冰上進(jìn)行，每個樣品重復(fù)3次。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料用百分率表示，采用χ2檢驗，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01為差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義。數(shù)據(jù)組間相關(guān)系數(shù)利用Correl方程[10]計算。

2 結(jié)果

2.1 兩組患兒靜脈血GFAP水平

研究組患兒靜脈血GFAP水平（第1天和第5天）均較對照組水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。其中研究組患兒隨著病程推移，靜脈血GFAP水平逐漸升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2.2 兩組患兒cfDNA完整度比較

兩組cfDNA完整度檢測發(fā)現(xiàn)，研究組患兒與對照組患兒之間的靜脈血cfDNA完整度無顯著性差異（P>0.05）;研究組患兒與對照組患兒之間的腦脊液cfDNA完整度具有顯著性差異（P<0.05）。見表2。

2.3 兩組患兒cfDNA含量比較

通過熒光定量分析方法發(fā)現(xiàn)，相對于對照組，研究組患兒的腦脊液cfDNA含量顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），而兩組的靜脈血cfDNA含量無顯著性差異（P>0.05）。見表3。

注：組間顯著性差異，a表示P<0.05，b為P>0.05

2.4 研究組患兒靜脈血GFAP濃度與其靜脈血和腦脊液的cfDNA水平相關(guān)關(guān)系

利用Correl方程對研究組患兒靜脈血GFAP濃度與其靜脈血和腦脊液的cfDNA水平進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示患兒靜脈血GFAP水平與靜脈血cfDNA水平的Correl系數(shù)為0.1805，無相關(guān)關(guān)系（P>0.05）。而患兒靜脈血GFAP水平與腦脊液cfDNA水平的Correl系數(shù)為0.9716，呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。

3討論

單純性熱性驚厥（Simple febrile seizures，SFS）指小兒伴有發(fā)熱的驚厥發(fā)作，并排除顱內(nèi)感染和癲癇等疾病，預(yù)后良好。但復(fù)雜性熱性驚厥的特點為反復(fù)發(fā)作、長時間發(fā)作等，可對患兒產(chǎn)生驚厥后腦損傷，導(dǎo)致認(rèn)知功能下降，甚至繼發(fā)癲癇[11]。

CFS的急性期治療，主要為控制驚厥和感染?，F(xiàn)在有多種血清標(biāo)志物提示驚厥后腦損傷，如神經(jīng)元特異性烯醇化酶、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、熱休克蛋白70、GFAP等[12-13]。本研究發(fā)現(xiàn)研究組患兒靜脈血GFAP水平（第1天和第5天）均較對照組水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），再次證明GFAP是驚厥后腦損傷的可靠標(biāo)志物。但研究組患兒靜脈血GFAP水平在第5天高于第1天，說明了驚厥腦損傷的持續(xù)性，而非短暫消失。目前的血清標(biāo)志物只能在實驗室層面提示腦損傷存在，但缺乏立體的判斷。有研究表明，在部分CFS患兒早期進(jìn)行頭顱MR檢測，發(fā)現(xiàn)海馬腫脹，而后逐漸演變?yōu)楹ｑR硬化和萎縮[14-16]。但該檢查對影像診斷技術(shù)要求高，且缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，容易造成誤診、漏診。這就需要從其他方向探索CFS腦損傷的相關(guān)研究。

cfDNA是一種細(xì)胞外游離狀態(tài)的DNA，可在人體血液和組織液中檢測到。其優(yōu)點在于：大部分游離DNA多長度小于200 bp，易于檢測;可重復(fù)性好;不可透過血腦屏障[17]。對cfDNA的檢測在疾病的監(jiān)控、胎兒的產(chǎn)前診斷及腫瘤的研究中已經(jīng)有了很多應(yīng)用[18-19]，但是其含量測定與CFS腦損傷關(guān)系研究甚少。通過熒光定量法，研究組患兒的腦脊液cfDNA含量較對照組顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），而兩組靜脈血cfDNA含量無顯著性差異（P>0.05），提示驚厥可明顯增加腦脊液cfDNA濃度，而對靜脈血的cfDNA含量無明顯改變。由于細(xì)胞凋亡產(chǎn)生的ALU片段長度明顯短于非細(xì)胞凋亡產(chǎn)生的[20]，所以通過兩組cfDNA完整度檢測，我們發(fā)現(xiàn)研究組患兒與對照組患兒之間的靜脈血cfDNA完整度無顯著性差異;研究組患兒與對照組患兒之間的腦脊液cfDNA完整度具有顯著性差異。同時由于血腦屏障的作用，腦脊液中的cfDNA進(jìn)入外周血，而外周血的cfDNA難以進(jìn)入腦脊液。故可以推斷CFS患兒腦脊液增加的cfDNA是通過細(xì)胞死亡產(chǎn)生的。由于無法對人類大腦進(jìn)行病理學(xué)的檢測，我們通過Correl方程分析，發(fā)現(xiàn)靜脈血GFAP水平與腦脊液cfDNA水平的Correl系數(shù)為0.9716呈正相關(guān)，意味著從分子和細(xì)胞的水平證實了CFS產(chǎn)生腦細(xì)胞損傷的部分機(jī)制。

綜上所述，對腦脊液cfDNA的測定，是明確CFS患兒存在腦損傷的依據(jù)。由于神經(jīng)細(xì)胞的不可再生，故對CFS在臨床治療中需要強(qiáng)調(diào)預(yù)防和控制驚厥的發(fā)生和發(fā)展，同時對未來治療CFS腦損傷提供作用靶點。由于本研究納入的研究對象有限，需進(jìn)一步增加樣本量，同時擬進(jìn)一步對SFS患兒的腦脊液cfDNA的測定，以期獲得更加精準(zhǔn)的研究數(shù)據(jù)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Patterson KP，Baram TZ，Shinnar S.Origins of temporal lobe epilepsy：Febrile seizures and febrile status epilepticus[J].Neurotherapeutics，2014，11（2）：242-250.

[2] Chung S.Febrile seizures[J].Korean J Pediatr，2014，57（4）：384-395.

[3] 李慶祿，李寧，王文智，等.GFAP、MBP在早期腦挫裂傷診斷中的價值[J].國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2014，38（20）：2756-2757.

[4] 陳建，施煒，呂成林，等.腦膠質(zhì)瘤患者血清及腦脊液中游離DNA的檢測[J].中華實驗外科雜志，2012，29（7）：1391-1393.

[5] Rainer TH，Wong LK，Lam W，et al.Prognostic use of circulating plasma nucleic acid concentrations in patients? with acute stroke[J].Clin Chem，2003，49（4）：562-569.

[6] 趙超，丁蘭，張丹，等.血漿游離DNA的臨床應(yīng)用新進(jìn)展[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2017，（33）：6580-6583.

[7] 中華醫(yī)學(xué)會兒科學(xué)會神經(jīng)學(xué)組.熱性驚厥診斷治療與管理專家共識（2016）[J].中華兒科雜志，2016，54（10）：723-724.

[8] 黃樹平，溫麗芳，黃郁波，等.小兒復(fù)雜性熱性驚厥與血清鈣、鐵、鎂的相關(guān)性探討[J].當(dāng)代醫(yī)學(xué)，2017，23（19）：22-24.

[9] El Kissi Y，Romdhane AB，Hidar S，et al.General psychopathology，anxiety，depression and self-esteem in couples undergoing infertility treatment：A comparative study between men and women[J].Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol，2013，167（2）：185-189.

[10] Jiang Xiao-feng，Liu Zhi-fei，Lin Ai-fu，et al.Coordination of bactericidal and iron regulatory functions of hepcidin in innate antimicrobial immunity in a zebrafish model[J].Sci Reap，2017，7（1）：4265-4271.

[11] McClelland S，Dube CM，Yang J，et al.Epileptogensis after prolonged febrile seizures：mechanisms，biomarkers and therapeutic opportunities[J].Neurosci Lett，2011，487（3）：155-162.

[12] 楊輔直，李偉生，蘇格炘，等.復(fù)雜型熱性驚厥患兒血清腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子及熱休克蛋白70水平的變化及意義[J].中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志，2014，13（2）：185-187.

[13] 凌寅杰，朱焰，路攀，等.GFAP和MBP的動態(tài)檢測對熱性驚厥腦損傷的評估和預(yù)后的意義[J].現(xiàn)代實用醫(yī)學(xué)，2019，35（10）：1349-1350.

[14] Chan S，Bello JA，Shinnar S，et al.Hippocampal malrotation is associated with prolonged febrile seizures：Results of the FEBSTAT study[J].AJR Am J Roentgenol，2015， 205（5）：1068-1074.

[15] Koyama R.Findings from FEBSTAT study[J].Nihon Yakurigaku Zasshi，2015，146（1）：66.

[16] 張曉楠，程敬亮，王斐斐，等.有或無海馬硬化的顳葉癲癇患者丘腦DTI變化的分析[J].實用放射學(xué)雜志，2014， 30（1）：34-38.

[17] 丁蘭，趙超，安靜，等.血漿游離DNA在臨床應(yīng)用中的新進(jìn)展[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2016，16（18）：3593-3596.

[18] 杜娟，王利民，朱金鳳.不同孕周先天畸形患兒游離DNA的含量變化規(guī)律及相關(guān)影響因素分析[J].中國優(yōu)生與遺傳雜志，2019，4（2）：403-405，419.

[19] 馬華蘭，黃俊，郭仲莉，等.先天畸形患兒游離DNA含量與孕婦產(chǎn)前篩查指標(biāo)AFP，F(xiàn)ree-HCGβ相關(guān)性分析[J].中國優(yōu)生與遺傳雜志，2019，8（3）：971-973.

[20] Lavon I，Refael M，Zelikovitch B，et al.Serum DNA call define tumor specifit genetic and epigenetic markers in gliomas of vallous grades[J].Neuro Oncol，2010，12（11）：173-180.

（收稿日期：2020-01-20）