基于黃酮醇類半胱氨酸熒光探針的設(shè)計、合成及性能研究

曹小燕　路宏朝　張強　任傳清　劉建利

摘 要 以丹皮酚和糠醛為原料，黃酮醇為熒光團，丙烯酸酯為識別基團，設(shè)計并合成了一種黃酮醇類半胱氨酸熒光探針2-（2-呋喃基）-7-甲氧基色酮-3-丙烯酸酯（HFAC），采用核磁共振（1H NMR、13C NMR ）和高分辨質(zhì)譜（HRMS-ESI）確證其結(jié)構(gòu)。吸收光譜和發(fā)射光譜結(jié)果表明，探針HFAC對半胱氨酸（Cys）具有高效的檢測識別能力。同時，熒光實驗證實了探針HFAC是一種“關(guān)-開”型熒光探針，525 nm處的熒光強度與Cys濃度在20～400 μmol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性方程為y=0.4608x + 3.994（R²=0.9987），檢出限為379 nmol/L，并在365 nm紫外光下發(fā)出亮綠色熒光。A549細胞熒光成像實驗表明，探針HFAC具有低毒性、良好的細胞膜通透性和生物相容性，具有快速檢測細胞內(nèi)/外源生物硫醇Cys的能力。

關(guān)鍵詞 黃酮醇; 半胱氨酸; 熒光探針; 細胞成像

1 引 言

細胞內(nèi)生物硫醇主要包括半胱氨酸（Cys）、高半胱氨酸（Hcy）和谷胱甘肽（GSH）等，在維持機體的正常生理活動中發(fā)揮了重要作用，如調(diào)解生物體內(nèi)的氧化還原平衡、維持生物體內(nèi)正常生命活動和預(yù)防疾病等[1～5]。生物硫醇濃度異常，易引起一系列疾病，如心臟病、肝損傷、癌癥、骨質(zhì)疏松癥、腸道炎癥及心血管疾病等[6，7]。Cys是細胞內(nèi)含量豐富的含有巰基的氨基酸（30～200 μmol/L），在蛋白質(zhì)的合成、解毒、代謝和翻譯后修飾等方面發(fā)揮重要作用[8]; 若機體內(nèi)Cys缺失，易引發(fā)多種疾病，如生長發(fā)育緩慢、皮膚損傷、身體虛弱、肝損傷、嗜睡、頭發(fā)褪色、癌癥等疾病[9]。因此，在生理條件下，對Cys進行實時、高效、準(zhǔn)確的定量檢測，在疾病早期診斷和生化研究中具有重要意義。

傳統(tǒng)生物硫醇的分析方法，如高效液相色譜（HPLC）[10]、傅里葉變換紅外（FTIR）光譜[11]、質(zhì)譜（MS）[12]、電化學(xué)分析[13]和紫外/可見光譜分析[14]等，存在操作繁瑣、耗時長或設(shè)備昂貴等不足。與傳統(tǒng)分析法相比，熒光分析法具有操作簡單、便捷、靈敏度好、選擇性高等優(yōu)點[15]。由熒光團和識別基團構(gòu)筑的熒光探針，不但具有高靈敏度，還具有實時、高效和原位檢測等特點[16，17]。近十年來，文獻報道了一系列用于選擇性檢測Cys的熒光探針，其設(shè)計策略是基于巰基的強親核性，利用Cys的巰基與探針分子的識別基團發(fā)生磺酸酯鍵裂解[18]、磺酰胺斷裂[19]、邁克爾加成[20]、二硫鍵斷裂[21]、醛基或丙烯酸酯加成環(huán)化反應(yīng)[22，23]等，依據(jù)反應(yīng)前后熒光信號的變化，檢測Cys的含量。然而，已經(jīng)報道的Cys熒光探針部分具有結(jié)構(gòu)復(fù)雜、檢測耗時較長、檢測選擇性或靈敏度較差等問題。因此，設(shè)計合成能夠選擇性檢測3種硫醇（Cys、Hcy和GSH），具有較低的細胞毒性、較高的生物相容性和細胞膜通透性的熒光探針，實現(xiàn)硫醇與探針的快速響應(yīng)，具有重要的研究價值。

3-羥基黃酮類化合物如槲皮素和山奈酚，是一類具有抗氧化、抗炎和抗癌活性的天然產(chǎn)物，可見光激發(fā)下可發(fā)生激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移（ESIPT）染料，具有優(yōu)良的光化學(xué)和光物理學(xué)性質(zhì)，廣泛應(yīng)用于金屬離子（陽離子或陰離子）和小分子物質(zhì)的特異識別及生物成像研究[24～28]。Ren等[29]將丙烯酸吡啶基團引入探針的識別部位，對Cys具有較高的靈敏度和選擇性，檢出限為0.48 μmol/L。Li等[30]在3-羥基黃酮的2位引入噻吩基團，基于ESIPT機理，在生理條件下實現(xiàn)了對Cys的選擇性檢測，檢出限為42.3 nmol/L。因此，本研究基于3-羥基黃酮的熒光特性，2位引入呋喃雜環(huán)拓展熒光母核的共軛結(jié)構(gòu)，3位引入丙烯酸酯作為熒光淬滅基團和識別部位，設(shè)計、合成了探針2-（2-呋喃基）-7-甲氧基色酮-3-丙烯酸酯（HFAC）?；?-羥基黃酮的羰基和羥基的鄰近，能形成分子內(nèi)氫鍵，易于發(fā)生激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移（ESIPT）機制，賦予其優(yōu)異的熒光性能，實現(xiàn)水溶液體系中對Cys的選擇性識別和細胞成像研究，為生物體內(nèi)Cys的選擇性檢測提供實驗基礎(chǔ)。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

UV-2600紫外可見分光光度計（日本島津公司）; Cary Eclipse熒光分光光度計（美國安捷倫公司）; DRX-600核磁共振波譜儀（德國Bruker公司）; Bruker microTOF-Q II 高分辨質(zhì)譜儀（德國道爾頓公司）; IX73倒置熒光顯微鏡（日本奧林巴斯株式會社）。全部化合物紫外-可見吸收光譜和熒光發(fā)射光譜的測定均于室溫下進行。 TLC為自制硅膠板; 柱色譜分離硅膠（200～300目，青島海洋公司）。

所用試劑均為國產(chǎn)分析純（阿拉丁試劑公司）; 實驗用水為超純水。

2.2 熒光探針的合成

探針2-（2-呋喃基）-7-甲氧基色酮-3-丙烯酸酯（HFAC）的合成路線如圖1所示。

2.2.1 2-（2-呋喃基）-3-羥基-7-甲氧基色酮（1）的合成 參考文獻[31]的方法，將192 mg 2-呋喃甲醛（2 mmol）溶于10 mL乙醇中，加入415.2 mg丹皮酚（2.5 mmol）和10 mL 1 mol/L NaOH溶液，反應(yīng)混合物于50℃下攪拌6 h后，反應(yīng)液傾入30 mL冰水中，以1 mol/L HCl調(diào)節(jié)至中性。減壓抽濾、洗滌得到黃色固體沉淀物。黃色固體干燥后無需純化，加入15 mL乙醇和10 mL 1 mol/L NaOH 溶液，0℃下攪拌反應(yīng)30 min后，慢慢滴加30% H2O2（1 mL），并繼續(xù)攪拌30 min，室溫攪拌過夜。反應(yīng)液中緩慢滴加1 mol/L HCl，調(diào)節(jié)溶液至中性，固體沉淀物經(jīng)減壓抽濾、冷水沖洗，用無水乙醇重結(jié)晶，得到化合物1（0.32 g， 62%）。1H NMR （600 MHz， CDCl3） δ （ppm）： 8.11 （d， J= 9.4 Hz， 1H）， 7.67 （s， 1H）， 6.97 （s， 2H）， 6.87 （s， 1H）， 6.63 （s， 1H），3.91 （s， 3H）。13C NMR （150 MHz， CDCl3） δ（ppm）： 172.06， 164.45， 157.17， 144.67， 144.61， 138.40， 136.35， 126.88， 115.26， 115.19， 115.17， 112.83， 100.20， 77.44， 77.23， 77.02， 56.11。HRMS（ESI） m/z calcd. for C14H10O5 （M + Na）+： 281.0528; Found： 281.0420。

2.2.2 探針2-（2-呋喃基）-7-甲氧基色酮-3-丙烯酸酯（HFAC）的合成[31] 將化合物1（0.258 g）溶于20 mL二氯甲烷溶液中，在冰浴條件下，緩慢滴加0.5 mL三乙胺，滴加完畢后，繼續(xù)攪拌30 min; 再滴加丙烯酰氯（0.24 mL）的二氯甲烷溶液（10 mL），繼續(xù)在冰水浴條件下攪拌1 h，緩慢恢復(fù)至室溫，攪拌4 h，采用TLC檢測反應(yīng)完全后，緩慢滴加10 mL水淬滅反應(yīng)，用二氯甲烷萃取，無水Na2SO4干燥，減壓濃縮柱層析分離（石油醚-乙酸乙酯（1∶2，V/V）），得到灰白色粉末0.172 g，產(chǎn)率為55%。1HNMR （600 MHz， CDCl3） δ （ppm）： 8.12 （d， J= 8.8 Hz， 1H）， 7.64 （s， 1H）， 7.09 （s， 1H）， 6.99～6.86 （m， 2H）， 6.70 （d， J= 17.3 Hz， 1H）， 6.58 （s， 1H）， 6.45 （d， J= 17.3 Hz， 10.5 Hz， H）， 6.10 （d， J=10.3 Hz， 1H）， 3.91 （s， 3H）。 13C NMR （150 MHz， CDCl3） δ（ppm）： 171.24， 164.63， 163.19， 157.11， 147.62， 146.00， 144.16， 133.92， 131.25， 127.61， 127.23， 117.76， 115.89， 114.97， 112.70， 100.42， 77.44， 77.23， 77.02， 56.13。HRMS（ESI） m/z calcd. for C17H12O6 （M + Na）+： 335.0634; Found： 335.0526。

2.3 紫外-可見吸收光譜和熒光光譜的測定

準(zhǔn)確稱取1.65 mg探針HFAC溶于DMSO中，配成1.0 mmol/L的母液，4℃冷藏保存， 備用。各種氨基酸溶于水中，配制成1.0 mmol/L的母液，備用。測定光譜時，用磷酸鹽緩沖溶液-乙腈（4∶6，V/V，pH 7.4）將探針HFAC儲備液稀釋至20.0 μmol/L，分別加入400.0 μmol/L不同的氨基酸溶液，在室溫條件下， 測定熒光光譜和紫外-可見吸收光譜。采用相同的稀釋方法，測定探針HFAC與不同濃度氨基酸的熒光光譜， 激發(fā)和發(fā)射狹縫均為5 nm。

2.4 細胞毒性實驗

以A549細胞為模型，采用3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）法[32]，考察探針HFAC的細胞毒性。將A549細胞（3 × 104 cell）接種于96孔板，每孔加入200 μL培養(yǎng)基（DMEM含10%胎牛血清），在5% CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，待細胞充分貼壁，然后換液，加入90 μL新的培養(yǎng)基和10 μL不同濃度的探針HFAC（0～50 μmol/L），繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基，加入110 μL新鮮培養(yǎng)基（含10 μL MTT，5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄去培養(yǎng)基，加入100 μL DMSO，振蕩10 min。用酶標(biāo)儀測定各孔570 nm下的OD值，依據(jù)公式（1）計算探針HFAC的細胞毒性。

Cell viability（%） =[（OD_Exp-OD_Blank）/（OD_Control-OD_Blank）] × 100 （1）

2.5 細胞熒光成像

依據(jù)文獻[33]的方法，將A549細胞（3 × 105）接種于6孔板中，于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。棄去培養(yǎng)基，細胞用PBS洗滌3次，分別加入無血清培養(yǎng)基，分4組：（1）對照組 A549細胞與PBS共孵育30 min; （2）藥物組 A549細胞與探針HFAC（20 μmol/L）共孵育30 min; （3）抑制劑組 A549細胞與N-乙基馬來酰亞胺（NEM，1.0 mmol/L）共孵育30 min后，再加入探針HFAC（20 μmol/L）共孵育30 min; （4）Cys組 A549細胞與N-乙基馬來酰亞胺（NEM，1.0 mmol/L）共孵育30 min后，再加入Cys（100或 200 μmol/L）共孵育30 min，繼續(xù)加入探針HFAC（20 μmol/L）孵育30 min。孵育后的細胞用PBS洗滌3次， 在熒光倒置顯微鏡下觀察細胞成像。

3 結(jié)果與討論

3.1 探針HFAC的紫外-可見吸收光譜和熒光發(fā)射光譜

依據(jù)文獻[31]方法合成了探針HFAC，通過核磁共振氫譜（1H NMR）、碳譜（13C NMR）和高分辨質(zhì)譜（HRMS-ESI）對結(jié)構(gòu)進行了表征，結(jié)果詳見2.2節(jié)和電子版文后支持信息圖S1～S6。

采用紫外-可見吸收光譜考察探針HFAC對Cys的響應(yīng)情況。如圖2A所示，探針HFAC最大吸收峰位于330 nm處，加入20倍量Cys后，隨著反應(yīng)時間延長，最大吸收峰明顯紅移至360 nm，并且強度逐漸增強，等吸光點為345 nm。在激發(fā)波長360 nm時，探針沒有熒光信號（圖2B）; 隨著生物硫醇（Cys、Hcy和GSH等）的加入，反應(yīng)體系在525 nm處出現(xiàn)熒光峰，且熒光強度變化差異顯著。探針HFAC加入Cys后，隨著反應(yīng)時間延長，525 nm處熒光強度迅速增強（圖3A），在0～10 min內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（y=19.92x + 20.26， R2= 0.9950），20 min后達到最大值（圖3B），溶液在365 nm紫外光下發(fā)出強烈的亮綠色熒光（圖2B插圖）。探針HFAC加入Hcy后，引起525 nm處熒光強度變化較弱; GSH及其它硫醇類化合物的熒光信號未出現(xiàn)明顯改變（圖2B和3B）。光譜信號變化說明，探針HFAC具有良好的光穩(wěn)定性，與Cys作用前后展現(xiàn)了熒光的“關(guān)-開”過程，有利于Cys的選擇性熒光檢測，斯托克位移為165 nm。

3.2 探針HFAC對Cys的檢測性能

進一步考察了不同濃度的Cys對探針HFAC檢測性能的影響。由圖4A可知， Cys濃度在20～400 μmol/L范圍內(nèi)與探針在525 nm處HFAC的熒光強度呈良好的線性關(guān)系，線性方程為y=0.4608x + 3.994（R2=0.9987）（圖4B）， 檢出限（S/N=3）為37.9 nmol/L，遠低于生物體內(nèi)Cys的含量（30～200 μmol/L）[8]。上述實驗結(jié)果表明，探針HFAC可用于定量檢測Cys濃度。

3.3 探針HFAC的抗干擾能力

生物體內(nèi)存在多種含巰基氨基酸，可能對探針HFAC的專一性檢測產(chǎn)生干擾。為了評價探針HFAC對Cys響應(yīng)的特異性，測試了探針HFAC對19種氨基酸的熒光光譜響應(yīng)。如圖5所示，可能干擾的氨基酸與探針HFAC（20 μmol/L）在室溫條件下反應(yīng)30 min后，Tyr、Lle、Trp、Ser、Ala、Asp、Gly、Leu、Phe、His、Lys、Arg、Val、Thr、Glu、Pro、Met和GSH未引起反應(yīng)液在525 nm處熒光強度的明顯改變（圖5）; 再加入Cys（400 μmol/L），在室溫條件下反應(yīng)10 min后，反應(yīng)混合液在525 nm處的熒光強度明顯增強，并且與對照組近似。但是Hcy（400 μmol/L）與探針HFAC（20 μmol/L）在室溫條件下反應(yīng)30 min后， 525 nm處熒光強度增強了20%; 再加入Cys（400 μmol/L），繼續(xù)在室溫條件下反應(yīng)10 min后，混合液在525 nm處的熒光強度與對照組相當(dāng)，表明Hcy對探針HFAC選擇性識別Cys存在干擾。為了進一步探索探針HFAC對Cys的高效選擇性，借助假一級動力學(xué)模型[34]，考察探針HFAC識別生物硫醇（Cys、Hcy和GSH）的速率（見電子版文后支持信息圖S7）。當(dāng)生物硫醇（Cys 2 mmol/L、Hcy 2 mmol/L和GSH 4 mmol/L）明顯過量時，其一級動力學(xué)速率常數(shù)分別為2.14 ×103 s1、 3.98 ×104s1和4.23 ×105 s1。上述結(jié)果進一步證實， 探針HFAC能夠選擇性識別Cys，具有較強的專一性，可用于溶液體系中低濃度生物硫醇Cys的選擇性檢測。

3.4 pH值和乙腈比例的影響

考察了pH值及乙腈含量對探針HFAC的穩(wěn)定性及探針HFAC與Cys響應(yīng)的影響。探針HFAC與Cys作用前后，525 nm處熒光強度與pH值關(guān)系曲線如圖6A所示，在pH 3～11范圍內(nèi)，探針HFAC的熒光信號不受溶液pH值的影響; 加入Cys后，反應(yīng)體系在525 nm處熒光強度隨溶液pH值（6～12）的增大而呈現(xiàn)先增后降的趨勢; 在pH 7～11范圍內(nèi)，反應(yīng)液在525 nm處熒光強度達到最大值，變化較弱。考慮到人體生理pH=7.35～7.45，為了方便后續(xù)熒光成像研究，選擇測試時pH值為7.4。由圖6B可知，探針HFAC的熒光信號不受溶液體系中乙腈含量的影響。加入Cys后，反應(yīng)體系在525 nm處熒光強度隨檢測溶液中乙腈含量（10%～50%，V/V）的增加而呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢， 乙腈含量為40%（V/V）時， 525 nm處熒光強度達到最大。本研究選擇乙腈-PBS（4∶6，V/V，pH 7.4）為檢測介質(zhì)。

3.5 探針HFAC與Cys的作用機理

為了闡明探針HFAC與Cys的作用機理，采用高分辨質(zhì)譜分析了探針HFAC以及探針HFAC和Cys發(fā)生反應(yīng)后的產(chǎn)物。結(jié)果表明，探針HFAC的分子離子峰為m/z 335.0527，在HFAC和過量Cys反應(yīng)后的質(zhì)譜圖上觀察到了m/z 259.0601和122.0270，分別對應(yīng)黃酮醇化合物1和過量的Cys，已經(jīng)完全反應(yīng)（電子版文后支持信息圖S5、S6 和S8），推測其反應(yīng)機理如圖7所示。首先Cys和探針HFAC的丙烯?；碾p鍵發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)，隨后Cys中的氨基進攻酯基，發(fā)生分子內(nèi)的加成-消除反應(yīng)，生成羥基黃酮母體化合物1和較穩(wěn)定七元環(huán)化合物。而Hcy和GSH由于其自身分子鏈較長以及探針羰基的空間位阻效應(yīng)，阻礙Hcy或GSH與探針HFAC的響應(yīng)，響應(yīng)熒光信號較弱或不發(fā)熒光，與文獻[35]報道一致。

3.6 探針HFAC的細胞成像實驗

文獻[8]已經(jīng)證實，活細胞內(nèi)存在大量Cys和GSH，細胞內(nèi)的濃度分別為30～200 μmol/L和1～10 mmol/L?？疾炝颂结楬FAC對A549細胞內(nèi)Cys的熒光成像能力。首先測定了探針HFAC的細胞毒性。如圖8所示，在0～50 μmol/L濃度范圍內(nèi)，探針HFAC對非小細胞肺癌A549細胞未表現(xiàn)出明顯的細胞毒性。A549細胞本身無熒光（圖9A）; 當(dāng)探針HFAC（20 μmol/L）與A549細胞共孵育30 min，細胞呈現(xiàn)明顯的亮綠色熒光（圖9B）。為了進一步探究探針HFAC對細胞內(nèi)生物硫醇Cys的選擇性響應(yīng)，

選用生物巰基抑制劑NEM（1 mmol/L）[34]與A549細胞預(yù)孵育30 min后，再加入探針HFAC孵育30 min，細胞不顯示熒光（圖9C）。為了驗證探針HFAC是否可以在活細胞內(nèi)對外源引入的Cys進行細胞成像， A549細胞和NEM（1 mmol/L）預(yù)孵育30 min，再加入Cys（100 μmol/L或 200 μmol/L）孵育30 min，隨后加入探針HFAC（20 μmol/L）繼續(xù)孵育30 min，暗場下可見到細胞繼續(xù)發(fā)出明顯的亮綠色熒光（圖9D和9E），并且與Cys濃度存在相關(guān)性。上述實驗結(jié)果與熒光光譜實驗結(jié)果一致，表明探針HFAC具有低毒性、良好的生物相容性和細胞膜通透性，可選擇性檢測細胞內(nèi)/外的Cys。

4 結(jié) 論

基于ESIPT機制設(shè)計合成了一種新型“關(guān)-開”型熒光探針HFAC，并對其結(jié)構(gòu)進行了表征。在生理pH值（pH 7.4）條件下，探針HFAC在乙腈-PBS緩沖溶液體系中能夠高靈敏、快速、選擇性識別Cys，并具有良好的光穩(wěn)定性，檢出限為37.9 nmol/L，斯托克位移165 nm。此外，探針HFAC具有低毒性、良好的生物相容性和細胞膜通透能力，可用于細胞內(nèi)/外Cys的選擇性檢測和熒光成像研究，在生物活性分析方面具有潛在的應(yīng)用價值。

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Design and Synthesis of Flavone-based Fluorescent Probe

for Cysteine Detection and Its Application in Living Cells Imaging

CAO Xiao-Yan*1， LU Hong-Zhao2， ZHANG Qiang1， REN Chuan-Qing1， LIU Jian-Li3

1（Key Laboratory of Catalysis in Shaanxi Province， Shaanxi University of Technology， Hanzhong 723000， China）

2（School of Biological Science and Engineering， Shaanxi University of Technology， Hanzhong 723000， China）

3（Biomedicine Key Laboratory of Shaanxi Province， College of Life Science， Northwest University， Xi′an 710069， China）

Abstract A highly selective and sensitive fluorescent probe 2-（2-furyl）-7-methoxychromone-3-acrylate （HFAC） was designed and synthesized with paeonol and furfural as raw material， 3-hydroxyflavone as fluorophore and acrylate group as recognition unit. The probe HFAC was characterized by 1H NMR， 13C NMR and HRMS-ESI. The results of absorption and fluorescence spectral analysis indicated that the probe had high sensitivity and selectivity towards cysteine （Cys）， and the detection was not affected by other biothiols such as homocysteine， glutathione and others. Meanwhile， it was confirmed that HFAC was a reaction type “off-on” fluorescent probe， the fluorescence intensity at 525 nm had a high linear relationship with Cys concentration in the range of 20-400 μmol/L with a regression equation of y=0.4608x + 3.994 （R2=0.9987） and a detection limit of 37.9 nmol/L， and the color of the reaction solution changed from colorless to bright green at UV light of 365 nm. Fluorescence bioimaging experiment proved that probe HFAC had excellent cell membrane permeability， low cytotoxicity and biocompatibility， which was desirable for fast detection and visualization of both endogenous and exogenous Cys in A549 cells.

Keywords Flavonol; Cysteine; Fluorescent probe; Bioimaging

（Received 21 November 2019; accepted 15 May 2020）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （No.21502109） and the Funds of Research Programs of Shaanxi University of Technology （No. SLG1811）.

2019-11-21收稿; 2020-05-15接受

本文系國家自然科學(xué)基金項目（No.21502109）和陜西理工大學(xué)校級科研項目（No.SLG1811）資助

E-mail： ruoshuizhihan@163.com