甘草甜素對周圍神經損傷模型大鼠神經再生的干預效果及其可能機制

郭艷峰 周 濤 戴巧英 潘樂坤 劉吉祥

(河北省邯鄲市第一醫(yī)院神經外科，邯鄲市 056002，電子郵箱：gyf8265@163.com)

周圍神經損傷是由各種原因導致的周圍神經支配區(qū)域發(fā)生的運動、營養(yǎng)、感知障礙等，可對患者的身體健康造成嚴重的威脅[1-2]。周圍神經損傷包括多種類型，如牽拉損傷、缺血性損傷、壓迫性損傷以及其他醫(yī)源性損傷等。流行病學調查數據顯示，隨著機動車輛逐漸普及，交通事故頻發(fā)，周圍神經損傷發(fā)生率逐年上升[3]。尋找一種安全有效的治療措施對周圍神經損傷患者的康復具有重要意義。中藥是一種多成分復合物，有助于神經的修復和再生[4]。甘草甜素是甘草的主要活性物質，具有抗氧化、清除自由基、抗炎以及調節(jié)免疫等諸多藥理作用，其抗炎作用對缺血性損傷造成的中樞神經損傷具有一定的改善作用[5-6]。目前國內外有關甘草甜素對周圍神經保護作用的研究較少。本研究通過建立周圍神經損傷大鼠模型，探究甘草甜素對周圍神經損傷模型大鼠神經再生的促進作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取50只SD健康雄性大鼠，由廣西醫(yī)科大學實驗動物中心提供(動物許可證號：SCXK桂2014-0001)，月齡3～5(3.9±0.6)個月，體重200～251(230.5±9.8)g。所有大鼠均飼養(yǎng)于干凈籠子，室溫(22.1±1.8)℃，相對濕度35%～40%，每天光照12 h，飲純凈水，適應性飼養(yǎng)1周。本研究獲得我院倫理委員會批準。

1.2 主要試劑 甘草甜素購自西安拉維亞生物科技有限公司(批號：H20150801)溶液配置：將50 mg甘草甜素粉末溶于1 mL無水乙醇中，制備50 mg/mL的一級儲存液備用，取10 μL 一級儲存液與990 μL磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)混合制備成500 μg/mL的二級儲存液備用。PBS、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)緩沖液、TBST液購自上海國藥集團化學試劑有限公司(批號：H20180201、H20180402、H20180901)。生長相關蛋白43(growth associated protein 43,GAP-43)抗體和神經營養(yǎng)因子受體p75(p75 neurotrophin receptor,p75NTR)抗體購自上海江萊生物科技有限公司(批號：H20170801、H20180302)；噻唑藍購自南京探求生物技術有限公司(批號：TQSJ031)、二甲基亞砜購自上海艾銳化工有限公司(批號：H20180701)；IP細胞裂解液購自南京生航生物技術有限公司(批號：20150301)。

1.3 主要儀器 臺式離心機(Sigma公司，型號：1-13)；倒置熒光顯微鏡(Nikon公司，型號：108)；酶標儀(Bio-Rad公司，型號：680)；CO2細胞培養(yǎng)箱(上海潤度生物科技有限公司，型號：Herocell 180)。

1.4 方法

1.4.1 分組、建模及干預：(1)分組。將大鼠按完全隨機數字表法分為正常對照組、模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，各10只。(2)正常對照組大鼠不做處理，其余4組大鼠建立周圍神經損傷大鼠模型。采用40 mg/kg 2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠后，取仰臥位固定，消毒后在大鼠右臀做一2 cm左右切口，將肌肉逐層分離，暴露大鼠坐骨神經，并于大鼠坐骨結節(jié)下0.5 cm的位置將坐骨神經干完全切斷，行解剖對位后使用無損傷縫線將兩斷端神經吻合，并逐層縫合創(chuàng)口。(3)干預。建模后第3天開始，低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠分別給予10 mg/kg、20 mg/kg、30 mg/kg甘草甜素溶液2 mL灌胃，1次/d，正常對照組、模型組大鼠給予等體積生理鹽水進行灌胃處理。各組大鼠均連續(xù)用藥干預15 d。

1.4.2 GAP-43和p75NTR蛋白表達水平的檢測：干預15 d后，稱重大鼠，采用40 mg/kg 2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，斷頭法處死，于脊柱后方中間部位做一切口，將椎管完全咬開，完好無損的暴露脊髓，切取部分損傷側脊髓，立即置于液氮速凍待檢。使用PBS清洗標本3次，棄掉緩沖液后加入IP細胞裂解液裂解0.5 h，獲取蛋白并測定其濃度。以20 μg/孔蛋白質上樣，于SDS-PAGE緩沖液中電泳10 min，在10%的牛奶中進行電轉膜，搖床上常溫封閉1.5 h；37℃孵育一抗(均1 ∶500)過夜，次日使用TBST液清洗3次，10 min/次，常溫孵育二抗(1 ∶1 000)1 h，TBST液清洗3次，10 min/次，加入顯影劑顯色，使用凝膠成像分析系統(tǒng)對GAP-43、p75NTR條帶灰度值進行分析，以β-肌動蛋白(β-actin)為內參蛋白，目的蛋白條帶灰度值/內參條帶灰度值=目的蛋白相對表達量。

1.4.3 細胞增殖能力檢測：以40 μg/mL脂多糖誘導B淋巴細胞增殖，以5 μg/mL刀豆球蛋白A誘導T淋巴細胞增殖。于無菌操作臺上取各組大鼠脾組織，于液氮中速凍后，用甲醛浸泡固定，然后進行組織切片，置入含有RPMI 1640培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中使用機械-酶消化法制成單細胞懸液，并使用RPMI 1640培養(yǎng)液將細胞濃度調整為1×107個/mL。37℃、5% CO2環(huán)境下分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，將培養(yǎng)后的細胞制成細胞懸液，接種于96孔的培養(yǎng)板中，每孔加入細胞懸液90 μL，各組細胞均加入10 μL的培養(yǎng)液，每組設置5個復孔，將細胞置于37℃ 、5% CO2細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，每孔加入20 μL噻唑藍繼續(xù)孵育4 h，棄上清液，每孔加入150 μL 二甲基亞砜，振蕩10 s，采用酶標儀測定于570 nm波長處讀取細胞OD值，計算細胞增殖率，增殖率=(實驗組OD值-對照組OD值)/對照組OD值×100%。

1.4.4 神經元細胞凋亡檢測：取大鼠損傷脊髓，提取神經元細胞，將各組細胞轉至6孔板，在37℃、5% CO2下培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，0.25%胰蛋白酶消化，2 000 r/min離心5 min，收取細胞，PBS重復洗滌2次，2 000 r/min離心5 min，收集細胞，加入1 mL 碘化丙啶染液，常溫避光放置1 h后，于流式細胞儀上檢測細胞凋亡情況。

1.4.5 比目魚肌肌肉指數及有髓神經纖維直徑、數量的測定：完全暴露各組大鼠損傷側后肢三頭肌，向上分離并于跟腱止點位置將三頭肌切斷，沿比目魚肌向下分離三頭肌，同時切取比目魚肌，切除結締組織后去除表面血液，稱取重量，計算比目魚肌肌肉指數，比目魚肌肌肉指數=比目魚肌重量/大鼠麻醉處死時體重×100%。取大鼠神經遠端0.6～0.7 cm坐骨神經干組織，液氮冷凍后用甲醛浸泡固定，制作組織切片后進行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色，400倍視野下照相，使用Image-ProPlus 6.0軟件統(tǒng)計單位面積內的髓神經纖維直徑、數量。

1.5 統(tǒng)計學分析 數據采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以(x±s)表示，多組間比較采單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2結 果

2.1 各組大鼠脊髓組織GAP-43、p75NTR蛋白相對表達水平比較 模型組，低劑量組、中劑量組、高劑量組、對照組大鼠GAP-43蛋白相對表達水平依次升高，p75NTR蛋白相對表達水平依次降低(均P<0.05)。見表1及圖1。

表1 4組大鼠脊髓組織GAP-43、p75NTR蛋白相對表達水平比較(x±s)

圖1 5組大鼠GAP-43、p75NTR蛋白表達水平

2.2 各組大鼠T、B淋巴細胞增殖情況比較 各個時間點，模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組、對照組大鼠T、B淋巴細胞增殖率均依次降低(均P<0.05)，見表2。

表2 4組大鼠T、B淋巴細胞增殖情況比較(x±s，%)

2.3 各組大鼠神經元細胞凋亡情況比較 各個時間點，模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組、對照組大鼠神經元細胞凋亡率依次降低(均P<0.05)，見表3。

表3 4組大鼠神經元細胞凋亡情況比較(x±s，%)

2.4 各組大鼠比目魚肌肌肉指數及有髓神經纖維直徑、數量比較 模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組、對照組大鼠比目魚肌肌肉指數及有髓神經纖維直徑、數量均依次增加(均P<0.05)，見表4。

表4 4組大鼠比目魚肌肌肉指數及有髓神經纖維直徑、數量比較(x±s)

3 討 論

手術治療和藥物治療是目前臨床治療周圍神經損傷常用的方法，其中藥物治療在周圍神經重建中發(fā)揮著重要的作用[7]。但目前臨床上治療周圍神經損傷的常用藥物都有一定的不良反應，尋找一種對機體毒副作用較小的新藥物具有重要意義。甘草甜素具有抗炎、調節(jié)免疫、抗氧化、抗病毒以及抗腫瘤等藥理作用，同時對神經損傷具有一定的保護、修復作用[8-9]。本研究顯示，各劑量甘草甜素干預組大鼠比目魚肌肌肉指數及有髓神經纖維直徑、數量高于或多于模型組，提示甘草甜素能夠減輕神經支配肌肉的萎縮，增加有髓神經纖維數量，促進神經再生，從而減輕神經繼發(fā)性損傷。

GAP-43是一種神經組織特異性蛋白，主要位于生長錐突觸中[10-11]，分布于機體腦組織、海馬區(qū)、脊髓以及自主神經系統(tǒng)[12]。有研究顯示，GAP-43表達的變化與神經元的生長發(fā)育密切相關，神經元組織生長發(fā)育過程伴隨著GAP-43表達的升高，發(fā)育停止后GAP-43的表達會隨之下降[13]。還有研究表明，GAP-43在軸突再生、突觸重建、神經遞質釋放等生物過程中發(fā)揮重要的促進作用，GAP-43高表達與軸突再生以及突觸重建密切相關[14]。p75NTR屬于腫瘤壞死因子受體家族，是一種跨膜糖蛋白[15]，其能夠與神經蛋白結合，在神經元細胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用[16-17]。臨床研究表明，p75NTR的表達與癲癇、阿爾茲海默病等神經系統(tǒng)疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關[18]，適當調控p75NTR的表達能夠改善神經細胞的存活情況，從而改善病情或緩解疾病的進展[19-20]。本研究結果顯示，與模型組比較，各劑量甘草甜素干預組大鼠脊髓GAP-43蛋白表達升高，p75NTR蛋白表達下降，且神經元細胞凋亡率下降，提示甘草甜素能夠調控脊髓GAP-43、p75NTR的表達而緩解神經元組織繼發(fā)損傷，抑制神經細胞凋亡，進而促進周圍神經損傷后神經再生，并且具有一定的濃度依賴性。

有研究顯示，周圍神經損傷后機體會出現一定的免疫反應，影響神經修復、再生以及功能恢復。還有研究顯示，抑制機體免疫反應對神經組織的修復和再生具有一定的促進作用[21]。T、B淋巴細胞是評價機體免疫功能的較為常用指標。本研究結果顯示，甘草甜素干預后，大鼠脾臟T、B淋巴細胞增殖率降低，提示甘草甜素能夠抑制T、B淋巴細胞增殖，減輕周圍神經損傷大鼠免疫反應，并且具有一定的濃度依賴性。

綜上所述，甘草甜素可減輕周圍神經損傷模型大鼠比目魚肌萎縮程度，促進神經再生，這可能與其抑制T、B淋巴細胞增殖及神經元細胞凋亡，以及調控GAP-43、p75NTR蛋白表達有關。