眼科疾病中細胞表型轉(zhuǎn)化的研究進展

韓雪，馮卓蕾

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院眼科，哈爾濱 150001)

細胞表型轉(zhuǎn)化目前在眼科疾病中主要有上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)和內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(endothelial-mesenchymal transition，EndMT)。EMT與EndMT相似，表現(xiàn)出三點特征：上皮/內(nèi)皮標志物表達下調(diào)；出現(xiàn)間質(zhì)細胞標志物表達；上皮/血管內(nèi)皮細胞增殖，細胞間連接消失，細胞極性改變，細胞遷移性及侵襲性增強[1]。研究表明，這種間充質(zhì)轉(zhuǎn)化機制與胚胎發(fā)育、腫瘤轉(zhuǎn)移、創(chuàng)傷修復(fù)及組織器官纖維化有關(guān)，其中，細胞表型轉(zhuǎn)化作為組織纖維化的發(fā)病機制之一，在多種細胞因子作用下參與眼部多種疾病的形成[2]。在角膜組織結(jié)構(gòu)中，角膜基質(zhì)與角膜內(nèi)皮細胞在受到損傷時，角膜基質(zhì)細胞具備的干細胞活性及角膜內(nèi)皮細胞的不可再生性決定了角膜內(nèi)皮細胞通過轉(zhuǎn)變細胞表型來完成組織修復(fù)過程[3]。在白內(nèi)障及青光眼術(shù)后，由于相關(guān)細胞表型的轉(zhuǎn)化引發(fā)相關(guān)并發(fā)癥，術(shù)后病情恢復(fù)難度增加；而新生血管性眼部疾病往往導(dǎo)致嚴重的后果，包括新生血管性青光眼導(dǎo)致的頑固性高眼壓、視網(wǎng)膜新生血管導(dǎo)致的玻璃體積血以及增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變等。細胞表型轉(zhuǎn)化的發(fā)現(xiàn)豐富了眼科相關(guān)疾病發(fā)病機制的理論和內(nèi)容，現(xiàn)就眼科疾病中細胞表型轉(zhuǎn)化的研究進展予以綜述。

1 角膜疾病中細胞表型轉(zhuǎn)化的參與機制

1.1Fuchs角膜內(nèi)皮營養(yǎng)不良(Fuchs′ endothelial corneal dystrophy，F(xiàn)ECD) FECD是一種遺傳性、進行性的角膜后部疾病，可導(dǎo)致雙側(cè)角膜內(nèi)皮細胞逐漸丟失、角膜內(nèi)皮細胞分泌后彈力層成分增多、角膜水腫，在晚期可導(dǎo)致大皰性角膜病變[4]。雖然FECD是由角膜內(nèi)皮功能障礙所致的疾病，但最終角膜的結(jié)構(gòu)層次均會受到影響[5]。FECD以內(nèi)皮細胞計數(shù)減少、殘余內(nèi)皮細胞形狀和大小改變以及角膜滴狀變性為特征。雖然角膜內(nèi)皮細胞常被認為處于生長停滯狀態(tài)，內(nèi)皮細胞通過遷移覆蓋內(nèi)皮層缺陷的區(qū)域完成角膜內(nèi)皮損傷的修復(fù)，但有證據(jù)表明角膜后緣和角膜內(nèi)皮存在干細胞標記，內(nèi)皮損傷后表達增殖標志物[6]。

FECD發(fā)展晚期，Claudin 10的表達顯著下調(diào)，Claudin家族在維持不同類型上皮細胞及內(nèi)皮細胞間緊密連接中起重要作用[7]。因此可以推測角膜內(nèi)皮細胞屏障及泵功能均有所損害。在調(diào)控方面，已有研究表明，Claudin具有調(diào)控細胞增殖和分化的功能，Claudin的表達和功能受多種轉(zhuǎn)錄因子、激素和細胞因子的控制[8]。同樣，在多種細胞因子作用下，活性氧類的過量產(chǎn)生可導(dǎo)致DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的損傷，并作為多種途徑的信號分子，導(dǎo)致細胞損傷[9]。炎癥因子及活性氧類均可加重EMT進程，EMT的發(fā)生導(dǎo)致細胞外基質(zhì)(extracelluar matrix，ECM)積聚，而ECM的累積使后彈力層增厚，進而加重角膜滴狀變性[10]。在早期FECD中，內(nèi)皮細胞較正常細胞產(chǎn)生更多的高活性重組人膠原蛋白8和豐富且異常的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；在晚期FECD中，細胞內(nèi)外均可見粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、擴張線粒體及上皮標志物；這些發(fā)現(xiàn)表明，在FECD中內(nèi)皮細胞通過轉(zhuǎn)變細胞表型使其具有成纖維細胞和上皮細胞的特征[11]。FECD中某些內(nèi)皮細胞的成纖維細胞特征可能提示其在成熟和分化過程中的表型改變(如EndMT)，在EndMT過程中，單個內(nèi)皮細胞可能從內(nèi)皮細胞層分離并遷移到內(nèi)皮下間隙，分化為一系列間充質(zhì)樣細胞類型[12]。

1.2角膜創(chuàng)傷修復(fù) 由于角膜創(chuàng)傷和屈光手術(shù)的不斷增多，角膜創(chuàng)傷愈合成為一個重要的臨床問題。角膜不同層次細胞的創(chuàng)傷愈合程度不同?；|(zhì)傷口的愈合是通過角膜基質(zhì)細胞向成纖維細胞和肌成纖維細胞的一系列轉(zhuǎn)化，以及固有及循環(huán)免疫系統(tǒng)細胞的參與，角膜上皮基質(zhì)損傷會引發(fā)復(fù)雜的基質(zhì)反應(yīng)，可導(dǎo)致肌成纖維細胞發(fā)育成熟，表達波形蛋白、平滑肌肌動蛋白和肌間線蛋白，繼而引起角膜基質(zhì)的重建，而角膜基質(zhì)創(chuàng)傷愈合過程通常導(dǎo)致角膜瘢痕形成[13]。有研究表明，角膜及其周圍組織的神經(jīng)可以通過增加分泌神經(jīng)生長因子調(diào)節(jié)多種細胞因子的分泌，從而間接參與角膜損傷的修復(fù)過程，角膜基質(zhì)細胞向成纖維細胞及肌成纖維細胞的轉(zhuǎn)化是導(dǎo)致角膜基質(zhì)混濁或纖維化的關(guān)鍵因素[14-15]。肌成纖維細胞是一種適合于在穿透性損傷后恢復(fù)角膜完整性的細胞，因為肌成纖維細胞有收縮傷口、分泌ECM以及與周圍基質(zhì)產(chǎn)生黏附結(jié)構(gòu)的能力。肌成纖維細胞前體纖維細胞在角膜上皮細胞損傷后立即從角膜緣血管進入基質(zhì)，角膜上皮損傷后的12～24 h，周圍和后基質(zhì)中殘留的活化基質(zhì)細胞開始增殖和遷移，這些增殖的基質(zhì)細胞產(chǎn)生角膜成纖維細胞，而這些細胞可以重新填充耗盡的基質(zhì)，并產(chǎn)生未成熟和完全分化的肌成纖維細胞[12]。

創(chuàng)面愈合過程受可溶性細胞活性因子、ECM的內(nèi)在化學(xué)性質(zhì)以及角膜細胞微環(huán)境的生物物理屬性的調(diào)節(jié)，而可溶性細胞活性因子包括生長因子、細胞因子、蛋白酶和神經(jīng)肽[16]。在角膜上皮愈合中，肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)作為旁分泌生長因子可介導(dǎo)EMT[17]?；|(zhì)損傷后，基質(zhì)細胞分化為紡錘形成纖維細胞，通過增加肌動蛋白的表達獲得遷移表型，產(chǎn)生牽引力，使基質(zhì)細胞增殖并遷移至損傷區(qū)域，通過凋亡重新填充已耗盡的基質(zhì)細胞區(qū)域[18]。基質(zhì)細胞-纖維細胞-成纖維細胞的轉(zhuǎn)化由轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor beta，TGF-β)和血小板源性生長因子(platelet-derived growth factor，PDGF)所誘發(fā)，HGF是一種能夠與TGF-β1誘導(dǎo)器官纖維化所抗衡的因子，HGF激活Smad7信號通路以防止Smad2磷酸化導(dǎo)致TGF-β信號通路的抑制[19]。因此，外源性HGF是促進角膜基質(zhì)創(chuàng)面愈合和患者預(yù)后的潛在治療工具。

2 白內(nèi)障、青光眼術(shù)后并發(fā)癥與細胞表型轉(zhuǎn)化的聯(lián)系

2.1后發(fā)性白內(nèi)障 晶狀體具有簡單但高度有序的結(jié)構(gòu)，其特征是前面單層的立方晶狀體上皮細胞覆蓋著一團拉長和分化的纖維細胞，這些細胞均包裹在一層厚厚的基底膜(晶狀體囊膜)內(nèi)。白內(nèi)障作為全球第一位致盲眼病，是一種晶狀體混濁使其透明度降低的過程[20]。后發(fā)性白內(nèi)障是由于晶狀體上皮細胞殘留并且在房水中細胞因子和生長因子的作用下，上皮細胞向成纖維細胞轉(zhuǎn)化使后囊膜細胞增殖變厚的過程。白內(nèi)障手術(shù)作為一種創(chuàng)傷性手術(shù)，植入的人工晶狀體作為異物可引起炎癥反應(yīng)，使前房中充斥炎癥反應(yīng)因子以及晶狀體上皮細胞向成纖維細胞轉(zhuǎn)化進而向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化(即發(fā)生EMT)，均可誘發(fā)后發(fā)性白內(nèi)障的發(fā)生[21]。

白內(nèi)障手術(shù)破壞了血房水屏障，使前房中生長因子、細胞因子的含量增加，進一步促使EMT的發(fā)生，加速后發(fā)性白內(nèi)障的發(fā)展進程[22]。當(dāng)人工晶狀體與晶狀體上皮細胞接觸時，晶狀體上皮細胞開始纖維化增殖，在手術(shù)創(chuàng)傷應(yīng)激下，晶狀體上皮細胞Lumican表達增加，Lumican的表達可調(diào)節(jié)晶狀體上皮細胞EMT的發(fā)生[23]。在晶狀體上皮細胞中，活化的TGF-β可增加間充質(zhì)標志物(如纖維連接蛋白-1、平滑肌肌動蛋白和Ⅰ型膠原α2重組蛋白)的表達[24]。TGF-β還可降低EMT細胞中上皮標志物晶狀體蛋白αβ、縫隙連接蛋白43等的表達[25]。表皮生長因子與腫瘤壞死因子具有的協(xié)同作用，不僅促進晶狀體上皮細胞增殖，而且刺激成纖維細胞增殖[26]。房水中正常水平PDGF可維持晶狀體上皮細胞的正常功能，而PDGF水平一旦超出正常范圍，則會引起晶狀體上皮細胞異常改變，并促使其向成纖維細胞轉(zhuǎn)化[27]。

2.2青光眼術(shù)后濾過泡瘢痕化 青光眼作為一種終身性疾病，可對視神經(jīng)造成不可逆的損傷，在病情進展過程中，對于藥物不能較好控制病情的患者可選擇手術(shù)治療。青光眼濾過手術(shù)是目前治療青光眼的首選手術(shù)方法。術(shù)后濾過泡瘢痕大量形成是青光眼手術(shù)治療失敗的主要原因。傷口愈合的過度反應(yīng)所導(dǎo)致的組織纖維化可能損害濾過性氣泡的形成，并減少房水流出，從而逆轉(zhuǎn)最初眼壓降低的趨勢[28]。由于手術(shù)可引起組織創(chuàng)傷，創(chuàng)傷區(qū)炎癥和細胞因子的聚集使成纖維細胞移行至創(chuàng)傷區(qū)并增殖，上皮細胞在炎癥環(huán)境中發(fā)生表型變化，導(dǎo)致增殖和遷移增加，組織重塑并分泌大量ECM，導(dǎo)致術(shù)區(qū)組織異常修復(fù)形成瘢痕，且結(jié)膜下濾過泡空間被纖維組織填充，進一步導(dǎo)致濾過手術(shù)失敗[29]。細胞因子的積聚則會改變細胞增殖基因的表達以及細胞骨架和基質(zhì)蛋白的基因表達，從而導(dǎo)致纖維化[30]。

在炎癥早期，PDGF、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、TGF-β等加速了多形核細胞和巨噬細胞在術(shù)后區(qū)域的積聚[31]。在分裂素(如PDGF)誘導(dǎo)的原代和侵襲性成纖維細胞傷口愈合的增殖階段，TGF-β介導(dǎo)由上皮/內(nèi)皮細胞分化而來的成纖維細胞向具有高度收縮性的肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化，而肌成纖維細胞是傷口愈合的核心[32]。在組織損傷后，肌成纖維細胞有幾個潛在來源，上皮細胞和內(nèi)皮細胞均可通過脫分化轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細胞參與組織修復(fù)[30]。

3 新生血管性眼部疾病中細胞表型轉(zhuǎn)化的參與過程

3.1增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變(proliferative diabetic retinopathy，PDR) 慢性高血糖是糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)發(fā)生的關(guān)鍵因素，是導(dǎo)致主要組織器官損傷的重要原因[33]。當(dāng)DR進展為PDR時標志著新生血管的形成，視網(wǎng)膜新生血管的發(fā)生、發(fā)展與細胞的激活、增殖和分化調(diào)控失常有關(guān)[34]。新生血管形成是PDR的病理基礎(chǔ)，是DR嚴重的微血管并發(fā)癥。隨著糖尿病患者數(shù)量的急劇增多，PDR已經(jīng)成為成人失明的重要原因[35]。在DR中，視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞是血管新生的關(guān)鍵。在糖尿病狀態(tài)下，視網(wǎng)膜組織缺氧、誘發(fā)血管內(nèi)皮細胞激活、ECM降解、血管內(nèi)皮細胞增殖和遷移，進一步導(dǎo)致不成熟的血管管腔結(jié)構(gòu)和血管外膜的形成，最終形成不完善的新生血管[36]。目前研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮細胞在糖尿病狀態(tài)下發(fā)生表型的變化，即EndMT[37]。Cao等[38]研究證實，高糖作用下，人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞內(nèi)皮標志物表達下調(diào)，出現(xiàn)間質(zhì)標志物表達，細胞增殖，同時遷移能力增強，發(fā)生EndMT。

在高糖誘導(dǎo)下的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞中微RNA(microRNA，miRNA/miR)-29a和miR-29b的表達顯著降低，miR-29a和miR-29b可負調(diào)控Notch 2的表達，而Notch 2的過表達又逆轉(zhuǎn)了miR-29a/b對EndMT的抑制作用[39]。心肌纖維化研究顯示，Notch信號通路可能啟動EndMT[40]。因此，基于控制miR-29a/b表達的治療可能是未來治療PDR的一個方向。

在血管重構(gòu)過程中，特別是在腫瘤血管系統(tǒng)以及與血管通透性增加和內(nèi)皮功能障礙相關(guān)的疾病中，血管內(nèi)皮細胞中的血管生成素(angiopoietin，Ang)-2水平升高，除Ang-2/Ang-1比值增加外，在敗血癥的研究中還報道了血管生成素受體Tie2水平降低[41]。這種變化可能使內(nèi)皮細胞連接中的Ang-1/Tie2信號向Ang-2信號轉(zhuǎn)移，從而減少Tie2磷酸化，使內(nèi)皮細胞啟動炎癥細胞因子信號，血管通透性和結(jié)構(gòu)遭到破壞；在這些條件下，Ang-2阻斷抗體顯示出有益的血管穩(wěn)定作用，表明Ang-2在導(dǎo)致血管結(jié)構(gòu)受損的過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[42]。當(dāng)內(nèi)皮細胞進行胞外分泌時，Ang-2與Tie2結(jié)合，從而競爭性地抑制Ang-1，并與VEGF協(xié)同促進血管生長的改變；當(dāng)Ang-1和Ang-2與VEGF協(xié)同作用促進血管生成時，Ang-1促進正常血管生長，Ang-2則上調(diào)與血管不穩(wěn)定和炎癥相關(guān)的異常因子，進而誘發(fā)新生血管的形成[43]。間充質(zhì)干細胞表達Ang-1和高水平的Ang-2，具有很強的誘導(dǎo)損傷部位原有血管重構(gòu)和支持新血管形成的能力[44]。由此推測，Ang-2與DR血管新生中的EndMT有關(guān)。

3.2脈絡(luò)膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV) CNV又稱視網(wǎng)膜下新生血管，是來自脈絡(luò)膜毛細血管的增殖血管，通過Bruch膜的裂口而擴展，于Bruch膜與視網(wǎng)膜色素上皮間或視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層與視網(wǎng)膜色素上皮間或視網(wǎng)膜色素上皮與脈絡(luò)膜間增殖形成[45]。濕性老年黃斑變性患者CNV的發(fā)展往往導(dǎo)致嚴重的視力喪失，當(dāng)視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)遭到破壞時，打破了血管生成因子與抑制因子的平衡，使血管生成因子占主導(dǎo)，從而引發(fā)新生血管以出芽方式在血管中生長[46-47]。

由于濕性老年黃斑變性視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)受損，視網(wǎng)膜色素上皮細胞(retinal pigment epithelium，RPE)在缺氧條件下產(chǎn)生過量的VEGF是發(fā)生CNV的關(guān)鍵[48-49]。VEGF能夠引起脈絡(luò)膜內(nèi)皮細胞的增殖和遷移[50]，破壞RPE細胞間的緊密連接[51]，從而使脈絡(luò)膜血管長入視網(wǎng)膜下腔。作為一種正面的反饋，侵襲CNV位點的巨噬細胞和RPE細胞無限制地分泌趨化因子和細胞因子，從而加速血管新生[52]。因此，CNV血管生成涉及細胞因子、趨化因子和多個細胞(包括RPE、角膜內(nèi)皮細胞和侵襲性巨噬細胞)的協(xié)同作用[53]。有研究表明，循環(huán)的骨髓來源的內(nèi)皮前體細胞定位于新生血管的位置并分化為內(nèi)皮細胞[54]。還有研究表明，CD133是人類造血前體干細胞和內(nèi)皮祖細胞標志物[55]。一旦這些祖細胞分化為更成熟的內(nèi)皮細胞，CD133的表達則降低[54]。此外，Harraz等[56]報道，CD14+單核細胞在體外可以分化為具有內(nèi)皮細胞標志的細胞，在小鼠缺血性肢體中參與形成血管內(nèi)皮。間充質(zhì)干細胞作為骨髓基質(zhì)細胞的主要細胞類型，可分化為內(nèi)皮細胞和血管平滑肌細胞，并與新的血管壁結(jié)合參與血管的形成[57]。Hou等[58]發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細胞可分化為內(nèi)皮細胞、血管平滑肌細胞、巨噬細胞和RPE，這些細胞均參與CNV的發(fā)生。在間充質(zhì)細胞中可檢測到5種標志物的表達，即CD31、α平滑肌肌動蛋白、F4/80、波形蛋白和角蛋白[59]。間充質(zhì)干細胞不僅能向血管內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)化[56]，還可以向結(jié)締組織細胞轉(zhuǎn)化[60]，說明間充質(zhì)干細胞具有多向轉(zhuǎn)化的潛能。因此，骨髓間充質(zhì)干細胞在CNV中能分化為血管內(nèi)皮細胞和血管外細胞。

4 小 結(jié)

內(nèi)皮細胞和上皮細胞的表型轉(zhuǎn)化參與多種生理、病理過程。EMT和EndMT在腫瘤轉(zhuǎn)移及組織器官纖維化過程中的作用已受到廣泛重視。在眼部疾病中，細胞表型轉(zhuǎn)化同樣參與多種病理轉(zhuǎn)變。在FECD、后發(fā)性白內(nèi)障、多種增殖性眼底病變中，EMT和EndMT參與組織纖維化、血管新生等過程。多種細胞因子參與間質(zhì)轉(zhuǎn)化，其中TGF-β是關(guān)鍵的啟動因子，VEGF、成纖維細胞生長因子等也起關(guān)鍵作用。多種細胞因子通過轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控信使RNA和DNA的表達，這一過程有多種信號通路參與。未來還應(yīng)進一步了解細胞表型轉(zhuǎn)化過程中涉及的分子機制、調(diào)控以及相關(guān)的信號通路，為眼科疾病的發(fā)病機制提供新的理論基礎(chǔ)。