西北酸菜中吸附黃曲霉毒素B1乳酸菌株的篩選鑒定及穩(wěn)定性研究

唐瓔， 孟憲剛， 鄧展瑞， 馬芮萍， 黃佳

1(甘肅省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，甘肅 蘭州，730050) 2(蘭州交通大學(xué) 化學(xué)與生物工程學(xué)院，甘肅 蘭州，730070)

黃曲霉毒素(aflatoxin，AFT)是一類毒性很強(qiáng)的真菌毒素，它主要是黃曲霉(Aspergillusflavus)和寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)次級代謝產(chǎn)生的二氫呋喃氧雜萘鄰?fù)苌?，其致癌性來源是香豆素結(jié)構(gòu)，毒性來源是二氫呋喃環(huán)結(jié)構(gòu)[1]。黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)是已發(fā)現(xiàn)的AFT中毒性及致癌性最強(qiáng)的，1993年國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(International Agency for Research on Cancer,IARC)將AFB1劃分為I類致癌物。AFB1對人畜有很強(qiáng)的致癌、致突變、致畸性,對肝臟及免疫系統(tǒng)有強(qiáng)抑制性[2-3]。目前對AFB1有效的脫毒方式有物理、化學(xué)、生物和基因干預(yù)4種方式。物理、化學(xué)、基因干預(yù)等方法會(huì)產(chǎn)生有毒副產(chǎn)物或改變物質(zhì)原有性狀，破壞食品品質(zhì)[4-6]。生物脫毒法可以有效地去除AFB1，其有很強(qiáng)的特異性。

TAHEUR等[12]從開菲爾培養(yǎng)物中分離出對AFB1吸附和生物轉(zhuǎn)化能力強(qiáng)的乳酸桿菌，當(dāng)pH值為4.8時(shí)，其在牛奶中能吸附82%的AFB1，在解吸實(shí)驗(yàn)后仍能吸附65%的AFB1。黃麗[13]從中國傳統(tǒng)乳制品中分離出1株植物乳桿菌，吸附率為59.44%，解吸后保留20.66%的吸附率。本實(shí)驗(yàn)從西北酸菜中分離出AFB1脫毒菌株，豐富AFB1脫毒菌株種類，研究菌株吸附穩(wěn)定性，體外模擬胃液消化，探究菌株-AFB1復(fù)合體代謝過程穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株來源

2019年7月～8月采集甘肅蘭州、天水、白銀、定西等地市售西北酸菜樣品，實(shí)驗(yàn)室前期研究西北酸菜發(fā)酵主導(dǎo)菌株為乳酸菌、酵母菌。CARLOS等[14]研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌對AFB1具有吸附能力，可以使AFB1脫毒；劉暢等[15]首次篩選出吸附率達(dá)81.16%的釀酒酵母Y1。試驗(yàn)從樣品中分離純化具有典型菌落特征的菌株，初步篩選西北酸菜中具有AFB1脫毒性能的菌株[16-17]。

1.1.2 主要試劑

(1)基礎(chǔ)培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基(CM188)、莫匹羅星鋰鹽(P-109)、半胱氨酸鹽酸鹽(P-03)、MC培養(yǎng)基(CM156)、磷酸鹽緩沖液(CM1022)、乳酸桿菌生化鑒定套裝(S021)、嗜熱鏈球菌生化鑒定套裝(S022)、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(CM107)、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(CM123)、馬鈴薯-葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(CM123A)、緩沖蛋白胨水(CM201)，北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

(2)基因提取、擴(kuò)增試劑

DNA提取試劑盒、核酸多重PCR檢測試劑盒，大連寶生物工程有限公司；核酸染料GS101-01，GELStain；AFB1標(biāo)準(zhǔn)品，TMstandard；二氯甲烷、甲醇、乙晴、苯、鹽酸均為色譜純、Sigma;NaCl(分析純)，科密歐。

(3)酶類

胃蛋白酶，Sigma，USA。

1.2 儀器設(shè)備

1300 SERLES A2-1379型生物安全柜，賽默白世爾(蘇州)儀器有限公司；QTRAP 4500超高效液相色譜儀串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，SCIEX；KH30R-II高速冷凍離心機(jī)，湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司；DJS-2016R全溫度恒溫?fù)u床，上海世平實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；PTY-623電子天平，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；PYC-16恒溫培養(yǎng)箱，美國精騏有限公司；T100 PCR儀、PowerPac Basic電泳儀、GEL DOC XR+凝膠成像系統(tǒng)，BIO-RAD。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 AFB1脫毒菌株的初篩

AFB1-MRS溶液：將AFB1標(biāo)準(zhǔn)品用V(苯)∶V(乙晴)=96∶4的溶液稀釋到目標(biāo)濃度，加入MRS(pH 7.4)溶液中，75 ℃水浴加熱20 min，蒸發(fā)溶液中苯-乙晴，制備質(zhì)量濃度為10 ng/mL的AFB1-MRS溶液。

將具備典型菌落特征的菌株分離純化，懸浮于磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS) (pH 7.4)中，制備成活菌濃度為109CFU/mL的菌懸液，接種于質(zhì)量濃度為10 ng/mL的AFB1-MRS溶液中，孵育72 h后，離心(12 000 r/min，15 min，4 ℃)，收集上清液，對上清液中殘留的AFB1含量用超高效液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜(ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)方法進(jìn)行分析，測量菌株脫去毒素的效率。選擇脫毒率最高的菌株進(jìn)行下一步鑒定和脫毒機(jī)制研究。按公式(1)計(jì)算AFB1脫毒率：

(1)

式中：S，AFB1脫毒率，%；C，接種菌株孵育后樣品中殘留AFB1的峰面積；F，對照樣品AFB1的峰面積。

1.3.2 樣品前處理方法及UPLC-MS/MS測定方法條件

樣品前處理方法：12 000 r/min離心15 min分離發(fā)酵液，上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后過免疫親和柱，用超純水洗濾2遍，然后用甲醇洗脫，收集洗脫液。

UPLC-MS/MS方法條件：

液相色譜：C18柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；柱箱溫度：40 ℃；流動(dòng)相(乙酸銨/甲醇)液相色譜梯度洗脫條件見表1[18]。

表1 液相色譜梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution conditions for liquidchromatography

質(zhì)譜條件：電離方式：電噴霧電離(electrospray ionization,ESI+)；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測模式(multiple reaction monitoring,MRM)；氣簾氣(CUR)：35 psi；碰撞氣(CAD)：medium；離子化電壓(IS)：5 500 V；離子源溫度：550 ℃；噴霧氣(GSI)：55 psi；輔助加熱器(GS2)：60 psi。MRM參數(shù)見表2。

表2 AFB1的質(zhì)譜檢測條件Table 2 Mass spectrum parameter of AFB1

1.3.3 制備熱滅活菌

將活菌懸液樣品在121 ℃高壓濕熱滅活20 min，滅菌物同時(shí)涂布MRS平板，36 ℃培養(yǎng)48 h作對照，驗(yàn)證滅菌效果。

1.3.4 菌株生長曲線

篩選菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基中，36 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)，每隔2 h測定菌株發(fā)酵液OD600值，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，發(fā)酵液OD600值為縱坐標(biāo)，繪制菌株生長曲線[19]。

1.4 高效脫毒菌株的鑒定

1.4.1 形態(tài)學(xué)鑒定

將1.3.1中篩選到的AFB1脫毒能力最強(qiáng)的菌株，活化2代后接種到營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、MRS瓊脂培養(yǎng)基，36 ℃培養(yǎng)48～72 h后，形成菌株單菌落，革蘭氏染色后，油鏡觀察菌株形態(tài)。

1.4.2 菌株生理生化鑒定

依據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》[20]、《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[21]，采用細(xì)菌生化鑒定試劑盒，對篩選出的菌株進(jìn)行生理生化鑒定試驗(yàn)。

1.4.3 16S rRNA基因序列分析及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

依據(jù)細(xì)菌DNA提取試劑盒說明書提取目標(biāo)菌株DNA，采用試劑盒提供通用引物27F(5′-AGACTATGATCGTCGCACTG-3′)，1541R(5′-AAGGAGGTGTACCTGCC-3′)由大連寶生物工程有限公司PCR擴(kuò)增試劑盒提供。PCR反應(yīng)體系見表3。

表3 PCR反應(yīng)體系條件Table 3 PCR reaction system condition

將PCR產(chǎn)物送到上海生工生物有限公司測序，測序結(jié)果提交到NCBI進(jìn)行BLAST分析，將目標(biāo)序列與搜索到的同源序列在GenBank下載其模式菌株，用MEGA軟件中的N-J法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 菌株-AFB1復(fù)合體穩(wěn)定性研究

根據(jù)HERNANDEZ-MENDOZA等[22]研究，多數(shù)乳酸菌、酵母菌對AFB1脫毒機(jī)制是利用細(xì)胞壁的某些成分吸附AFB1，形成菌體-AFB1復(fù)合體，起到脫毒的效果[23]。菌株吸附通過非共價(jià)鍵連接AFB1毒素，吸附穩(wěn)定性由菌株特異性決定，試驗(yàn)通過PBS洗脫，體外模擬胃部消化環(huán)境，研究已篩選到的優(yōu)勢菌株吸附穩(wěn)定性。

1.5.1 PBS洗脫對菌株吸附穩(wěn)定性影響

將篩選到的菌株經(jīng)脫毒試驗(yàn)，離心得到沉淀，重懸于等體積的PBS溶液(pH 7.4)中，30 ℃振蕩20 min，5 000 r/min離心15 min，收集上清液，重復(fù)上述步驟6次，累積收集上清液，用UPLC-MS/MS法測定其中AFB1質(zhì)量濃度。利用公式(2)計(jì)算菌株脫毒穩(wěn)定性：

(2)

式中：M，菌株保留吸附率，%；ρ1，累積上清液中AFB1質(zhì)量濃度，ng/mL；ρ2，初始菌株復(fù)合AFB1質(zhì)量濃度，ng/mL。

1.5.2 模擬體外胃液消化對菌株吸附穩(wěn)定性影響

將吸附率高的菌株脫毒試驗(yàn)后離心得到的沉淀，重懸于胃液模擬物(體積分?jǐn)?shù)90%生理鹽水、體積分?jǐn)?shù)5% 3 mg/mL胃蛋白酶鹽酸溶液、體積分?jǐn)?shù)5% 0.1 mol/L HCl溶液)[24]，36 ℃，200 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)3 h，每隔0.5 h，累計(jì)收集上清液，用UPLC-MS/MS法測定其中AFB1含量。利用1.5.1公式(2)計(jì)算菌株脫毒穩(wěn)定性。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種的篩選

從35份西北酸菜樣品中分離出37株具有菌落特征的菌株，初步篩選出20株具有AFB1脫毒能力的菌株。菌株脫毒效率在18.37%～65.06%，不同菌株對AFB1脫毒能力有差異。由表4可知，菌株C2、C6、L12、P25活菌脫毒能力略高于熱滅活菌株；其余菌株熱滅活菌株脫毒能力高于活菌株，菌株編號為L25-2、P6、P16、C26-1活菌株與熱滅活菌株在脫毒率存在統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(P<0.05)。編號為L34-2的菌株脫毒能力最強(qiáng)，活菌脫毒率為66.41%，熱滅活菌株脫毒率為65.06%，選擇L34-2菌株進(jìn)行菌種鑒定和脫毒機(jī)制的進(jìn)一步研究。

表4 菌株AFB1脫毒效率 單位：%

2.2 菌株形態(tài)學(xué)及生理生化鑒定

從35份西北酸菜樣品中分離到1株活菌AFB1脫毒率為66.41%的菌株L34-2，菌落呈乳白色，表面光滑濕潤，半透明，中央凸起，MRS平板培養(yǎng)有溶鈣圈，菌落大小為0.2～0.6 mm、G+，細(xì)胞短桿狀或短桿狀，呈鏈狀排列，無芽孢。菌株L34-2依據(jù)《乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》[26]、《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[20]及《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[21]進(jìn)行生理生化鑒定，將L34-2菌株初步鑒定為乳酸桿菌。菌株形態(tài)學(xué)見圖1，生理生化反應(yīng)見表5。

a-菌落形態(tài)；b-革蘭氏染色菌株形態(tài)圖1 菌株L34-2形態(tài)學(xué)特征Fig.1 Morphological properties of L34-2

表5 菌株L34-2生理生化特征Table 5 Physiological and biochemical characteristics ofstain L34-2

2.3 菌株L34-2生長曲線

菌株36 ℃培養(yǎng)，0～2 h時(shí)，菌株處于生長延滯期，2～6 h處于生長對數(shù)期，8～20 h，菌株生長處于平衡期，20 h后菌株OD600值緩慢下降，見圖2。

圖2 菌株L34-2生長曲線(36 ℃)Fig.2 Growth curve of L34-2

2.4 菌株16S rRNA基因序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

菌株16S rRNA基因序列經(jīng)PCR擴(kuò)增后，有1條長度大約1 500 bp左右的核苷酸片段被擴(kuò)增出，如圖3所示。

圖3 L34-2菌株P(guān)CR 16S rRNA擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.3 PCR amplification of 16S rRNA sequencesof strain L34-2

將PCR基因擴(kuò)增片段分離純化后測序。測序基因序列運(yùn)用BLAST程序比對，在GenBank中下載與L34-2同源性較高的模式菌株。通過MEGA 7軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，選用2%核苷酸置換率，用N-J法構(gòu)建發(fā)育樹，并用bootstrap進(jìn)行1 000次重復(fù)支持率。系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果如圖4所示，菌株L34-2與布氏乳桿菌(Lactobacillusbuchneri)(登錄號：FJ867641.1)相似度達(dá)到99%，結(jié)合L34-2菌株形態(tài)學(xué)特征、生理生化特點(diǎn)，鑒定L34-2菌株為布氏乳桿菌(Lactobacillusbuchneri)。將L34-2基因序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫，注冊號為：HM151332。

圖4 菌株L34-2系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of stain L34-2

2.5 菌株脫毒穩(wěn)定性研究

2.5.1 PBS洗脫對菌株L34-2 AFB1脫毒穩(wěn)定性研究

用PBS反復(fù)洗滌菌體-AFB1復(fù)合物，檢測AFB1釋放量，菌體洗脫后殘留吸附AFB1含量評價(jià)菌種L34-2對AFB1吸附能力穩(wěn)定性。由圖5可知，第1次洗脫過程中，AFB1釋放量最大，從初始吸附率66.4%降至60.1%；洗脫3次后，菌體-AFB1復(fù)合物吸附率保留54.5%，PBS洗脫6次后，吸附率保留53.7%。洗脫3和6次，菌體-AFB1復(fù)合物吸附率相似，單因素方差分析第3次及第6次洗脫后吸附率，兩者沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異(P=0.06>0.05)，如表6所示。洗脫3次后，復(fù)合物AFB1釋放量趨于平衡，再洗脫只有微量的AFB1釋放出來。布氏乳桿菌L34-2菌體吸附AFB1是一個(gè)可逆的過程，該菌株在洗脫6次后，仍保留較高的吸附率，吸附率為53.7%，菌體-AFB1復(fù)合物的穩(wěn)定性取決于菌株自身的結(jié)合能力，具有菌株特異性，菌體L34-2吸附AFB1具有較好的穩(wěn)定性。

圖5 洗脫對AFB1吸附穩(wěn)定性影響Fig.5 Effect of elution on AFB1-strain complex

表6 洗脫次數(shù)單因素方差分析Table 6 One factor analysis of variance for elution test

2.5.2 體外模擬胃液消化對菌株吸附穩(wěn)定性的影響

體外模擬胃液消化過程，研究動(dòng)物消化過程對菌株-AFB1復(fù)合體穩(wěn)定性的影響，評估復(fù)合體在食用后的食品安全性能。由圖6可知，菌株L34-2-AFB1復(fù)合體模擬體外胃液消化0.5～1 h時(shí)，解吸出8%吸附的AFB1毒素，消化1.5 h時(shí)，菌株-AFB1復(fù)合體釋放率最大，解吸出19.3%吸附的AFB1霉素。消化2～3 h，菌株-AFB1復(fù)合物釋放量趨于穩(wěn)定。根據(jù)單因素方差分析消化2與3 h后保留吸附率，兩者沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異(P=0.07>0.05)，如表7所示，說明復(fù)合體經(jīng)胃液消化后，會(huì)有一定量AFB1被釋放出來，但是仍有大部分菌株-AFB1復(fù)合體保持吸附，胃液消化2 h后，釋放量趨于平衡，胃液消化3 h后，保留吸附率為45.9%，占初始吸附的69.1%。體外模擬胃液消化實(shí)驗(yàn)表明，菌株-AFB1復(fù)合體具有較好的穩(wěn)定性。

圖6 胃液消化對AFB1吸附穩(wěn)定性影響Fig.6 Effect of gastric juice digestion on AFB1-strain complex

表7 消化時(shí)間單因素方差分析Table 7 One factor analysis of variance for variance

3 結(jié)論與討論

本研究從35份西北酸菜樣品中篩選到1株活菌AFB1吸附率達(dá)66.41%的菌株L34-2，經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化及基因測序，鑒定為布氏乳桿菌(Lactobacillusbuchneri)。菌株L34-2吸附穩(wěn)定性研究結(jié)果表明，菌株吸附AFB1有較好的穩(wěn)定性，菌株-AFB1復(fù)合體在消化過程中仍有較強(qiáng)的吸附性，能保障食品安全。本研究從日常食用的西北酸菜中篩選AFB1吸附率高的布式乳桿菌，與多數(shù)生物降解AFB1篩選枯草芽孢桿菌、假單胞菌屬等菌株比較，菌株更適合在食品及飼料中吸附AFB1，更適應(yīng)機(jī)體消化系統(tǒng)。與TAHEUR等[12]篩選高吸附率的乳酸桿菌比較，菌株L34-2未優(yōu)化吸附率為66.41%，后續(xù)研究將通過優(yōu)化菌株發(fā)酵條件，提高菌株吸附能力及穩(wěn)定性。