HPLC法測定黑果腺肋花楸不同形態(tài)果實中的原花青素含量

胡祺鵬， 趙鵬宇， 安仁波， 金莉莉

( 延邊大學 藥學院， 吉林 延吉 133002 )

0 引言

黑果腺肋花楸(Aroniamelanocarpa)為薔薇科腺肋花楸屬多年生落葉灌木，果實為球形，果皮呈紫黑色，果肉呈暗紅色.黑果腺肋花楸原產于北美洲東北部，目前在我國遼寧、吉林、黑龍江等地有引種栽培[1].研究表明，黑果腺肋花楸含有黃酮、花青素和原花青素、糖類、揮發(fā)油、維生素類、鈣、鐵等多種成分[2-4]，其中多酚類化合物(原花青素)具有抗氧化、降血糖、改善血液循環(huán)、保護心臟、抗腫瘤、減輕婦女經前綜合征等功效[5-9]，因此黑果腺肋花楸具有良好的藥食兩用價值[10].

原花青素是一類以黃烷-3-醇為主要結構單元的縮合多酚類化合物，這些黃烷醇單元之間通常以4 → 8位或4 → 6位的碳―碳鍵連接，生成聚合度不同的復合體.研究表明，在食品中的原花青素中，二聚體的有8種、三聚體的有32種、四聚體的有128種、五聚體的有512種[11].目前，測定花青素的方法有紫外分光光度法、香草醛- 鹽酸法、鐵鹽催化比色法、正丁醇- 鹽酸法、高鐵鹽- 鐵氰化鉀比色法、高錳酸鉀分光光度法、HPLC法等[12]；但由于原花青素的組成較為復雜，難以使用同一種方法測定其每一組分的含量，因此對于原花青素的測定方法至今未有統一的標準.HPLC法是一種靈敏、高效的色譜技術[13]，目前已有學者采用正丁醇- 鹽酸- HPLC法、硫解- HPLC法等方法對原花青素的含量進行了測定，并取得了較好的結果[14-15].本文選用HPLC法測定黑果腺肋花楸新鮮果實、果實粉末和烘干果實中原花青素的含量，旨為開發(fā)利用黑果腺肋花楸提供參考.

1 實驗儀器、材料與方法

1.1 實驗儀器

WZ -180SP旋轉蒸發(fā)器,上海申科技有限公司； Chromaster 5430二極管陣列檢測器,鄭州長城科工貿有限公司； MP200B電子天平,上海精科天平儀器廠； Chromaster 5310柱溫箱,上海寶山顧村電光儀器廠； LC -10A日立高效液相色譜儀,日本島津公司； FC - 203B pH調節(jié)計,德國賽多利斯科技有限公司； Chromaster 5210自動進樣器,瑞士Bruker公司.

1.2 實驗材料

原花青素標準品(UV≥95%)，上海如吉生物科技發(fā)展有限公司(CAS:4852-22-6)；黑果腺肋花楸果實，購于吉林省汪清縣藍莓基地，經延邊大學藥學院呂惠子教授鑒定為黑果腺肋花楸果實；黑果腺肋花楸烘干果實(新鮮果實在烘箱中60 ℃烘干制得)；黑果腺肋花楸果實粉末(新鮮果實自然風干粉碎后制得)；無水乙醇(分析純)、檸檬酸(分析純)，天津科密歐化學試劑有限公司；甲醇(色譜純)，遼寧泉瑞試劑有限公司；超純水，用超純水機制備(吉林省新通州教儀有限公司).

1.3 實驗方法

1.3.1浸膏的制備 將30 g新鮮的黑果腺肋花楸果實粉碎，使用經檸檬酸酸化的乙醇(體積分數為60%、pH=3)回流提取3次(提取溫度60 ℃，提取時間1 h)；合并3次提取液后進行減壓濃縮，獲得浸膏10.4 g.使用同樣的提取方法和提取條件對烘干果實及果實粉末進行提取，得到各浸膏9.2 g.

1.3.2對照品溶液的制備 在室溫下稱取原花青素對照品5.0 mg置于5 mL容量瓶中，加入甲醇定容至5 mL，得到1 mg/mL對照品溶液；吸取1 mg/mL對照品溶液5 mL置于10 mL容量瓶中，再加入經檸檬酸酸化的超純水(pH=3)定容至10 mL，得到0.5 mg/mL對照品溶液.按上述方法依次配制0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 mg/mL對照品溶液.

1.3.3供試品溶液的制備 在室溫下稱取各浸膏0.02 g，分別置于1 mL容量瓶中，加入經檸檬酸酸化的超純水(pH=3)定容至1 mL，得到20 mg/mL 供試品溶液.根據對照樣品溶液中的原花青素含量確定稀釋倍數.

1.3.4HPLC條件選擇 經過預實驗確定HPLC的最佳條件，即：流動相中水和甲醇的體積比為75∶25，柱溫為40 ℃，檢測波長為280 nm，進樣量為10 μL，流速為1 mL/min.

1.3.5線性關系考察 取對照品溶液10 μL，按1.3.4確定的色譜條件進樣分析，并測定其峰面積，然后以濃度(x)為橫坐標、峰面積(y)為縱坐標進行線性回歸分析.

1.3.6重復性實驗 取供試品溶液，按1.3.4所確定的最佳色譜條件連續(xù)進樣6次(每次10 μL)，并測定進樣中原花青素的峰面積和保留時間，計算RSD值.

1.3.7精密度實驗 取系列對照品溶液，按1.3.4 所確定的最佳色譜條件連續(xù)進樣6次(每次10 μL)，并測定進樣中原花青素的峰面積和保留時間，計算RSD值.

1.3.8穩(wěn)定性實驗 取供試品溶液，按1.3.4 所確定的最佳色譜條件以0、2、4、8、12、24 h為間隔時間連續(xù)進樣6次(每次10 μL)，并測定進樣中原花青素的峰面積和保留時間，計算RSD值.

1.3.9加樣回收率實驗 取供試品溶液6份，分別加入對照品溶液1 mL，然后按1.3.4 所確定的最佳色譜條件進樣，并計算進樣中原花青素的平均加樣回收率和RSD值.

2 實驗結果與分析

2.1 原花青素的測定結果

原花青素的測定結果見圖1.由圖1可知，對照品和供試品溶液中的各成分分離狀況良好.以濃度(x)為橫坐標、峰面積(y)為縱坐標進行線性回歸，得到原花青素的回歸方程：y=23 470x+241.12，R2=0.998 9 (n=6)， 如圖2所示.由圖2可以看出，進樣量在0.06～1.1 μg/mL范圍內與峰面積呈線性關系.

按1.3.4確定的色譜條件對各批樣品進行測定并計算原花青素的含量，結果見表1.

2.2 方法學考察結果

2.2.1重復性考察 取同一批新鮮黑果腺肋花楸果實浸膏0.02 g，平行6份(精密稱定)；按1.3.3方法制備供試品溶液，分別進行進樣測定.測定結果顯示，原花青素峰面積的RSD值為0.78%(<1%)，該結果表明方法的重復性良好.

2.2.2精密度考察 取對照品溶液，按1.3.4色譜條件連續(xù)進樣6次，以此考察各峰的相對保留時間及相對峰面積的一致性.結果顯示，原花青素峰面積的RSD值為0.99%(<1%),表明測定原花青素含量的儀器其精密度良好.

2.2.3穩(wěn)定性考察 取新鮮黑果腺肋花楸果實浸膏0.02 g，按1.3.3方法制備供試品溶液，按1.3.4 確定的色譜條件分別進樣0、2、4、8、12、24 h.結果顯示，原花青素相對峰面積的RSD值為0.85%(<1%)，該結果表明供試品溶液中的原花青素成分在24 h內穩(wěn)定.

2.2.4加樣回收率考察 取新鮮黑果腺肋花楸果實浸膏0.02 g，平行6份(精密稱定)；在浸膏中分別加入對照品溶液(按供試品中已知量的80%、100%、120%)，按1.3.3方法制備供試品溶液，按1.3.4確定的色譜條件進樣分析.經計算，原花青素的平均加樣回收率為99.27%，RSD值為0.85%(<1%)，該結果表明利用本文方法測定原花青素含量的準確度較好.加樣回收率的試驗結果見表2.

3 結論

本文采用HPLC法測定了不同形態(tài)黑果腺肋花楸果實中的原花青素含量，結果顯示：新鮮黑果腺肋花楸果實中的原花青素含量為8.6 mg/g，黑果腺肋花楸果實粉末中的原花青素含量為7.0 mg/g，黑果腺肋花楸烘干果實中的原花青素含量為5.2 mg/g.新鮮黑果腺肋花楸果實中的原花青素含量最高的原因可能是原花青素在40 ℃以下時其穩(wěn)定性較好[4]，而黑果腺肋花楸果實粉末和黑果腺肋花楸烘干果實中的原花青素含量相對較低的原因可能是在烘干(60 ℃)和加工(粉末)果實過程中破壞了果實中的原花青素成分.本文研究結果可為黑果腺肋花楸的開發(fā)利用提供參考.