PD-L1與MTA1在口腔鱗癌中的表達與臨床意義

張連齊 李吉辰 樸松林 賽音烏力吉 元冬梅 沈禹辰

口腔鱗癌(Oral squamous cell carcinoma，OSCC)約占口腔癌的90%，主要為舌鱗癌、口底鱗癌、牙齦鱗癌，發(fā)病率逐年升高，全球每年新增發(fā)病人數(shù)約20萬，其中死亡高達17萬例之多[1]，手術(shù)治療及放化療效果有限，5年生存率僅在40%～50%，主要原因是癌癥的轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)[2]。免疫治療逐步被人們認知，在多種腫瘤的診治中效果顯著[3]。程序性死亡配體1(Programmed death-Ligand1，PD-L1)屬于免疫球蛋白超家族中一員，在多種癌癥如乳腺癌等中可明顯的觀察到PD-L1的異常表達[4-5]。PD-L1參與上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial mesenchymal transformation，EMT)、腫瘤細胞在體內(nèi)的侵襲、增殖及逃逸進程[6-8]。轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1(Metastasis associated gene1，MTA1)屬腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因家族，可參與細胞正常的生理功能[9]，也可調(diào)控卵巢癌等多種腫瘤的表達[10-11]。同時，MTA1間接調(diào)控EMT的作用與PD-L1相近[12]。本研究旨在研究口腔鱗癌中PD-L1與MTA1的表達的相互關(guān)系，并結(jié)合實驗數(shù)據(jù)分析，為口腔鱗癌的基礎(chǔ)研究及診治開辟新途徑、尋找新方向、實現(xiàn)新突破。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所應(yīng)用的實驗病理切片取自于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科2009年—2019年間保存完好的45例口腔鱗癌患者手術(shù)石蠟組織標(biāo)本，20例口腔正常粘膜組織取材于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科一病房手術(shù)患者，所有取材患者均自愿為本次實驗提供標(biāo)本，取材后進行石蠟包埋已備后續(xù)應(yīng)用。所有蠟塊標(biāo)本的具體病例資料于醫(yī)院系統(tǒng)內(nèi)保存完整并可進行查閱?；颊吣挲g35～75歲，平均55±7.65歲，男性患者26例，女性患者19例，高中分化患者29例，中低分化患者16例，其中以舌鱗癌、牙齦鱗癌及口底鱗癌為主。根據(jù)保存的病例資料對患者的個人其他信息進行仔細查閱，樣本內(nèi)患者都未參與手術(shù)治療及放化療等相關(guān)治療。國際抗癌聯(lián)盟(UICC)2010版為本實驗參考指南。

1.2 主要試劑及主要儀器

1.2.1 試劑 兔抗人PD-L1多克隆抗體、兔抗人MTA1多克隆抗體購自北京博奧森生物有限公司；SP法免疫組化試劑盒(KIT-900)及DAB底物試劑盒(DAB-0031)購自福州邁新生物技術(shù)有限公司，PBS緩沖液自制。

1.2.2 儀器 石蠟切片機(CUT 6062)購自德國SLEE公司；光學(xué)顯微鏡(CH20)購自日本Olympus公司；移液槍購自美國Thermo公司；醫(yī)用微波爐(M3-L238E)、電烤箱(T4-L326F)及電冰箱(BCD-432WGPZ)均購自中國Midea。

1.3 HE及免疫組化實驗方法

(1)將所有石蠟標(biāo)本以5 μm連續(xù)切片；(2)HE染色：切片并酒精復(fù)水，蒸餾水沖洗后蘇木素染色及自來水依次沖洗5 min后進行返藍，15 min后蒸餾水沖洗后滴加伊紅染液染色3 min，沖洗后鏡下觀察；(3)SP免疫組化：烤箱68℃烤片，脫蠟并梯度酒精水化，3%雙氧水室溫孵育10 min，PBS沖洗2 min，連續(xù)三次后行微波抗原修復(fù)，PBS沖洗2 min，4℃下，滴加兔抗人PD-L1一抗(1∶100)及兔抗人MTA1一抗(1∶100)，孵育過夜，取出降至室溫，PBS沖洗2 min，重復(fù)三次，37℃下，加入二抗IgG(1∶200)孵育30 min，PBS沖洗2 min，三次后采用DAB顯色5 min，脫水、通明、封片。

1.4 免疫組化結(jié)果判定

口腔鱗癌組織中，抗原陽性表達的PD-L1細胞被染成棕黃色，主要定位于細胞的胞膜、胞質(zhì)；抗原陽性表達的MTA1細胞亦被染成棕黃色，主要定位于細胞的胞核，偶有在胞漿。實施雙盲法隨機取5個不重疊視野于400倍鏡下觀察，共計200個細胞陽性細胞數(shù)。以陽性細胞率及染色強度行半定量評分，陽性細胞率以≤10%、10%～50%、50%～80%、>80%分別記為0、1、2、3分；按呈現(xiàn)的具體染色程度加以評分，標(biāo)準(zhǔn)如下：無染色、淺黃色、棕黃色、棕褐色分別記0、1、2、3分；結(jié)果以二者相乘之積做最終判定：<3分計為陰性(-)，≥3分計為陽性(+)[13]。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SAS 9.4統(tǒng)計軟件完成數(shù)據(jù)處理，率的比較采用卡方檢驗和連續(xù)性校正卡方檢驗，口腔鱗癌組織中PD-L1與MTA1表達的關(guān)聯(lián)性分析應(yīng)用卡方檢驗計算φ系數(shù)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 口腔鱗癌組織中PD-L1與MTA1表達比較

口腔鱗癌組織中，陽性表達的PD-L1主要在細胞膜和細胞質(zhì)，陽性表達的MTA1主要在細胞核，少量存在于細胞漿，癌細胞均被染成棕褐色。PD-L1在口腔鱗癌組織及正常口腔粘膜組織中的陽性表達率分別為75.56%和15.00%，MTA1在口腔鱗癌組織及正?？谇徽衬そM織中的陽性表達率分別為66.67%和10.00%，兩種蛋白在口腔鱗癌及正?？谇徽衬そM織中的表達差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖1)。

圖1 PD-L1與MTA1在正常口腔粘膜組織及口腔鱗癌組織中的表達分布情況(200倍)Figure 1 The expression of PD-L1 and MTA1 in oral squamous cell carcinoma and normal oral mucosa tissues(200×)Note：A.The expression of PD-L1 in normal oral mucosa tissues；B-D.The expression of PD-L1 in well，moderate and poor differentiated oral squamous cell carcinoma tissues；E.The expression of MTA1 in normal oral mucosa tissues；F-H.The expression of MTA1 expression in well，moderate and poor differentiated oral squamous cell carcinoma tissues.The magnification is 200.

2.2 口腔鱗癌組織中PD-L1及MTA1的表達與患者臨床病理特征的關(guān)系

結(jié)果顯示，PD-L1與MTA1的表達與口腔鱗癌的TNM分期有關(guān)(P<0.05)，而與患者的性別、年齡、吸煙史、腫瘤的體積及組織分化程度無關(guān)(P>0.05)(表1)。

表1 PD-L1與MTA1的表達與口腔鱗癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 PD-L1和MTA1表達的關(guān)聯(lián)性分析

總樣本內(nèi)，有34例陽性表達的PD-L1蛋白(MTA1陽性26例，陰性8例)；陰性表達的PD-L1蛋白占11例(MTA1陽性4例，陰性7例)。二者表達存在關(guān)聯(lián)性(φ=0.366，P=0.037)(表2)。

表2 口腔鱗癌組織中PD-L1和MTA1表達的關(guān)聯(lián)性

3 討論

近年來由于腫瘤細胞學(xué)和分子生物學(xué)的進展，腫瘤微環(huán)境逐漸進入人們研究的視野，在機體的免疫機制中作用突出，同時腫瘤免疫逃逸在學(xué)者中的的重要研究地位也愈發(fā)重要，免疫靶向治療藥物的作用也是有目共睹。PD-L1屬一類免疫共刺激分子，主要表達于腫瘤細胞表面[14]。在PD-1/PD-L1信號通路中，T細細增殖受到抑制，從而使其不能對腫瘤細胞完成正確的識別及殺傷作用，使其嚴(yán)重“失能”，加劇腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移[15]。在多種惡性腫瘤中PD-L1呈明顯的高表達狀態(tài)，如乳腺癌、非小細胞肺癌等[16]。PD-L1可通過PI3K/AKT通路途徑促進EMT進程，EMT狀態(tài)反過來可通過PI3K/AKT通路提升PD-L1蛋白的表達，雙向的共促進方式增強惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移作用[17]。相對于傳統(tǒng)的治療方法，靶向治療和預(yù)測性生物標(biāo)記物是治療復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性疾病臨床療效的重要手段。檢查點抑制劑是最有前途的治療方法之一，通過阻斷PD-1或PD-L1對腫瘤細胞產(chǎn)生強烈的免疫反應(yīng)而對多種癌癥有效[18]。然而，在實際的臨床實踐中，耐藥性的問題逐漸顯露，成為了PD-1/PD-L1抑制劑發(fā)揮療效過程中重要的絆腳石[19]?；谀壳癙D-1/PD-L1抑制劑的局限性，將PD-1/PD-L1抑制劑與其他治療方法相結(jié)合逐漸成為另一個重要的發(fā)展方向，例如結(jié)合放射療法的抑制劑。探索新的免疫治療策略，控制疾病的進展，從而為患者帶來更可持續(xù)的生存效益。在眾多可促進腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的角色當(dāng)中，MTA1備受關(guān)注，同時與PD-L1關(guān)系密切。MTA1屬于轉(zhuǎn)移相關(guān)基因家族成員之一，在乳腺癌大鼠中被發(fā)現(xiàn)而得名。MTA1無論是作為NURD復(fù)合體的一部分，或獨立地存在都可間接調(diào)控腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程[20]，同時MTA1使細胞角蛋白纖維系統(tǒng)發(fā)生改變，進而使腫瘤細胞獲得侵襲轉(zhuǎn)移的特征[21]。MTA1在乳腺癌、胃癌、肺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌等高表達且與患者的臨床分期，遠處轉(zhuǎn)移及生存率低顯著相關(guān)[22-24]。EMT與癌癥密不可分，參與多種調(diào)控機制[25-26]。MTA1表達升高可間接促進EMT[27]，同時激活PI3K/AKT信號通路也可提高MTA1蛋白水平來促進EMT及腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移過程[28]。目前MTA1相關(guān)藥物暫時還未出現(xiàn)，但是有研究表明阻斷MTA1的相關(guān)途徑可以有效降低乳腺癌的發(fā)生。同時我們可以猜想MTA1相關(guān)藥物與PD-1/PD-L1抑制劑聯(lián)合應(yīng)用的前景效果。本實驗中，PD-L1與MTA1在口腔鱗癌組織中的陽性率分別為75.56%與66.67%，PD-L1與MTA1的表達與腫瘤的TNM分期有關(guān)，這使二者有望在口腔鱗癌的基礎(chǔ)研究及早期診治等方面發(fā)揮至關(guān)重要的作用，而二者的表達與腫瘤的分化程度無明顯相關(guān)這一結(jié)論與徐凱等[29-31]研究的與腫瘤分化程度相關(guān)不一致，本實驗的標(biāo)本數(shù)量有限可造成該結(jié)果的產(chǎn)生，同時也需要進一步實驗加以驗證差異的結(jié)果。MTA1參與免疫調(diào)節(jié)過程，其可以誘導(dǎo)CD8+T細胞和CD4+T細胞分泌干擾素γ產(chǎn)生抑癌作用[32]，然而當(dāng)免疫微環(huán)境中存在干擾素γ表達上升時，腫瘤細胞則會產(chǎn)生所謂的抗免疫抑制作用，進而使PD-L1的表達上調(diào)[33]，那么此時微環(huán)境中的干擾素γ的抑癌作用與PD-L1的促癌作用的相互關(guān)系及MTA1與PD-L1的共同表達結(jié)果有待于進一步研究。這也是本實驗將二者一同在口腔鱗癌組織中檢測的目的，本實驗只是做出簡單判斷，還需要檢測更多指標(biāo)繼續(xù)驗證此次實驗結(jié)果。

綜上所述，高表達的PD-L1和MTA1與口腔鱗癌的TNM分期關(guān)系密切，檢測口腔鱗癌中PD-L1與MTA1的表達可以預(yù)測腫瘤的惡性程度。加深對二者的研究有一定的必要性，可能對口腔鱗癌的研究產(chǎn)生深遠的影響，同時在口腔鱗中PD-L1與MTA1的相互作用機制仍有待人們進一步深入發(fā)掘，研究前景十分廣泛。