沉默PRMT5基因?qū)θ烁伟┘毎飳W行為的影響

周 健 陳雪健 王 偉 李 寧 孫振宇，2 徐力善

肝細胞肝癌(HCC)是肝癌中最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，是全球癌癥相關(guān)死亡的第三大主要原因[1-2]。數(shù)據(jù)統(tǒng)計顯示，全世界每年有782 500新發(fā)肝癌病例和745 500死亡病例，僅中國就占病例總數(shù)和死亡總數(shù)的50%以上[3]。以目前的增長速度來看，HCC發(fā)病率有超過乳腺癌和結(jié)直腸癌發(fā)病率的趨勢[4]。手術(shù)切除和肝移植是治療HCC的有效方法[5]。但是，外科手術(shù)后的高復(fù)發(fā)率以及轉(zhuǎn)移影響了HCC患者的預(yù)后[6-8]。由于對終末期HCC的治療手段有限，因此，探究致癌基因在HCC發(fā)生發(fā)展過程中的作用機制顯得格外重要，并為尋找新的治療靶點提供理論依據(jù)。

在哺乳動物中，根據(jù)甲基化產(chǎn)物可將蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(PRMTs)分為Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ三種類型，PRMT5屬于其中的Ⅱ型，位于哺乳動物細胞質(zhì)和細胞核中，是一種可以將甲基轉(zhuǎn)移到組蛋白和一些非組蛋白精氨酸殘基上的酶，催化精氨酸殘基上蛋白質(zhì)底物的對稱二甲基精氨酸的形成，其活性在腫瘤細胞的發(fā)生發(fā)展過程中起到重要作用[9-13]。鑒于PRMT5的這種重要作用，因此它被認為是肝癌的潛在治療靶點[11-12]。已有的研究表明PRMT5在多種類型的腫瘤中高表達，包括白血病、淋巴瘤、肺癌、胃癌、結(jié)直腸癌和乳腺癌等[14-16]。但是，PRMT5在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用機制尚未完全闡明。因此，本研究探討PRMT5在肝癌細胞中的作用機制，為肝癌尋找新的治療靶點。

1 材料與方法

1.1 試劑及抗體

DMEM培養(yǎng)液RPMI 1640培養(yǎng)液(美國Gibco公司)、胎牛血清(美國Hyclone公司)、預(yù)染標準分子量蛋白Mark(美國Thermo scientific公司)、Western blot及IP細胞裂解液(中國Beyotime公司)、PVDF膜(美國Millipore公司)、Lipofectamine 2000試劑(美國Thermo scientific公司)、凋亡檢測試劑盒(美國BD公司)、抗體β-actin、PRMT5、P-AKT、AKT均購自美國CST公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

人正常肝細胞LO2，人肝癌細胞Huh7和HepG2均購自黑龍江省分子醫(yī)學生物工程研究中心。細胞用含有10%胎牛血清的DMEM或RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，細胞培養(yǎng)箱條件為5%CO2，37℃的恒溫培養(yǎng)。細胞傳代用0.25%胰蛋白酶消化，每2～3天傳代1次。選用對數(shù)生長期細胞進行試驗。

1.3 凋亡檢測

取對數(shù)生長期的肝癌細胞系Huh7、HepG2，接種于6孔板中，再置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁后于Huh7、HepG2細胞系加入siRNA將PRMT5敲減，用胰蛋白酶溶液消化細胞。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后用PBS洗滌2次，胰酶消化，離心收集細胞。PBS緩沖液重懸后1 000 r/min離心5 min，棄上清，重復(fù)2次。棄去PBS，細胞中分別加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC及5 μL PI，暗室室溫反應(yīng)15 min。用流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡情況。實驗重復(fù)3次。

1.4 蛋白質(zhì)印跡分析

收集對數(shù)生長期的肝癌細胞，加入混有蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液，置于冰上操作。裂解30 min后，將裂解液轉(zhuǎn)移至1.5 mL的EP管中，放入4℃ 12 000 r/min離心機中離心5 min，取上清分裝于0.5 mL離心管，-20℃保存。以BCA方法檢測蛋白濃度。將蛋白樣品加6×上樣緩沖液，水浴鍋沸水煮10 min。每孔30～50 μg蛋白的上樣量行聚丙烯酰胺凝膠電泳，應(yīng)用恒壓80 V，代溴酚藍進入分離膠后調(diào)整電壓120 V繼續(xù)電泳，至溴酚藍電泳至分離膠底部，終止電泳。以4℃，300 mA的電流進行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜時間依據(jù)分子量而定，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%的BSA封閉PVDF膜1 h，TBST洗滌后，加入抗體PRMT5、P-AKT、AKT、β-actin，一抗稀釋濃度1∶1 000，在4℃冰箱中孵育過夜。第二天應(yīng)用TBST清洗PVDF膜3次，二抗稀釋濃度1∶2 000孵育1 h，PBST洗3次后上掃描儀BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)分析儀顯影檢測灰度值。實驗重復(fù)3次。

1.5 siRNA干擾

通用生物公司設(shè)計PRMT5 siRNA，序列為：(siRNA1：CCAGAAGAGGAGAAGGAUAtt，UAUCCUUCUCCUCUUCUGGtt；siRNA2：GGAUAAAGCUGUAUGCUGUtt，ACAGCAUACAGCUUUAUCCtt；siRNA3：CCUCCAAGCUGUACAAUGAtt，UCAUUGUACAGCUUGGAGGtt)。實驗分為5組，分別為對照組、空白載體組、siRNA1、siRNA2、siRNA3。常規(guī)培養(yǎng)肝癌細胞，按3×105/孔的細胞量接種于6孔板中。在6孔板中加入2 mL含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，當細胞長至60%～70%時，更換無雙抗的Opti-MEM 1 mL，并配置轉(zhuǎn)染溶液。A：10 μL PRMT5 siRNA加入到Opti-MEM 250 μL中，輕輕混勻，室溫放置5 min。B：將4 μL Lipofectamine 2000脂質(zhì)體加入到Opti-MEM 200 μL中，輕輕混合均勻。將上述A、B溶液混勻，在室溫下靜置30 min，形成siRNA-Lipofectamine復(fù)合物，將復(fù)合物逐滴加入6孔板內(nèi)，6 h后更換完全培養(yǎng)基，然后將細胞于37℃，5% CO2的細胞孵箱中孵育48 h，收集細胞進行檢測。實驗重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 PRMT5在肝癌細胞系中的表達

與正常肝LO2細胞系相比，PRMT5在肝癌HepG2和Huh7細胞系中高表達(圖1A)，量化結(jié)果顯示(圖1B)，與正常肝LO2細胞系相比，PRMT5在肝癌細胞系HepG2和Huh7中高表達(P<0.05)。

圖1 PRMT5的表達水平Figure 1 The expression of PRMT5 protein in LO2，HepG2 and Huh7 cellsNote：A.The expression of PRMT5 protein in LO2，HepG2 and Huh7 cells；B.The gray histogram of PRMT5 protein band.*P<0.05，when compared with the LO2 cells.

2.2 抑制PRMT5的表達對肝癌細胞凋亡的影響

為了確定PRMT5在HCC細胞系增殖中的作用，我們使用了siRNA技術(shù)將HCC細胞系(HepG2和Huh7)中的PRMT5敲減，siRNA1(P<0.05)、siRNA2(P<0.05)、siRNA3(P<0.01)均不同程度的抑制了PRMT5的表達(圖2)，選擇效果最佳的siRNA3進行進一步實驗。應(yīng)用siRNA3敲減PRMT5表達后，應(yīng)用流式細胞技術(shù)檢測凋亡，在兩種細胞系中，沉默PRMT5的表達均會促進肝癌細胞凋亡(圖3)。

圖2 敲減PRMT5后蛋白表達量Figure 2 The expression of PRMT5 protein in HepG2 and Huh7 cells after knocked down PRMT5 geneNote：A.The expression of PRMT5 protein in HepG2 and Huh7 cells after knocked down PRMT5 gene；B.The figure of quantification of protein relative expression.*P<0.05，**P<0.01，when compared with the control group.

圖3 敲減PRMT5后HepG2及Huh7細胞凋亡情況Figure 3 Apoptosis of HepG2 and Huh7 cells was detected after knocked down PRMT5 gene

2.3 PRMT5對AKT通路的影響

我們應(yīng)用siRNA技術(shù)將HCC細胞系(HepG2和Huh7)中PRMT5基因敲減，應(yīng)用Western blot檢測PRMT5、P-AKT(Ser473)、AKT蛋白的表達水平。在兩種細胞系當中，敲減PRMT5后可以使HepG2細胞P-AKT表達下降(P<0.01)，Huh7細胞P-AKT表達也下降(P<0.05)，而總AKT蛋白水平無明顯變化(圖4)。這些實驗結(jié)果表明，PRMT5可以影響AKT通路從而影響肝癌細胞增殖能力。

圖4 敲減PRMT5基因后P-AKT變化Figure 4 The expression of P-AKT protein in HepG2 and Huh7 cells after knocked down PRMT5 geneNote：A.The expression of PRMT5，P-AKT and AKT proteins in HepG2 and Huh7 cell line after knocked down PRMT5 gene；B.The relative expression of protein bands.*P<0.05，**P<0.01 when compared with the control group.

3 討論

研究表明抑制PRMT5的表達可以促進不同類型腫瘤細胞凋亡[17-19]。其他研究表明PRMT5在多種不同類型的癌癥中異常表達，是參與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展過程的重要基因[12，14，20-22]。然而，PRMT5在肝癌發(fā)病機制中的作用以及與肝癌臨床病理因素之間的關(guān)系尚未完全闡明。PRMT5是II型精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶，可催化精氨酸殘基上蛋白質(zhì)底物的對稱二甲基化。近年來，越來越多的證據(jù)表明PRMT5通過不同的信號傳導(dǎo)通路參與多種生物學過程，在染色質(zhì)重建、蛋白質(zhì)修飾、細胞周期進程、細胞侵襲、細胞代謝等方面起到重要作用[23]。其他研究結(jié)果表明PRMT5在肺癌、乳腺癌、淋巴瘤、前列腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胃癌中高表達[14，21，24-27]。我們的實驗結(jié)果證實，PRMT5在肝癌HepG2及Huh7細胞中高表達，這與先前的結(jié)論是一致的。Kanda等[28]實驗證實，敲減PRMT5能夠明顯降低胃癌細胞的增殖、侵襲和遷移能力。我們的實驗結(jié)果證實，通過應(yīng)用siRNA技術(shù)將PRMT5敲減后可以顯著促進HCC細胞凋亡。這些實驗結(jié)果表明PRMT5在腫瘤的增殖、凋亡過程中扮演著重要角色。

AKT是PRMT5/AKT信號通路中的關(guān)鍵信號分子，又稱蛋白激酶B，調(diào)控細胞周期、細胞存活、細胞代謝。AKT的功能異常與癌癥、II型糖尿病、心血管疾病等疾病密切相關(guān)[23]。研究表明PRMT5通過誘導(dǎo)上游正向調(diào)節(jié)因子磷脂酰肌醇3激酶(Phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K)的過度磷酸化和負向調(diào)節(jié)因子PTEN的過度磷酸化來激活A(yù)KT[23]。Zhang等[23]實驗檢測到人類肺癌組織中PRMT5的過表達，而鄰近肺組織中PRMT5的表達水平非常低。應(yīng)用shRNA下調(diào)PRMT5或通過特異性抑制劑阻斷PRMT5活性可顯著阻止肺癌A549和H1299細胞的增殖。并且實驗表明PRMT5與AKT相互作用，PRMT5調(diào)節(jié)了肺癌A549和H1299細胞中的AKT激酶活性。實驗結(jié)果表明PRMT5通過與AKT相互作用調(diào)節(jié)人肺癌細胞增殖。Zhu等[29]表明PRMT5表達的增加可能會激活WNT/β-catenin信號通路從而促進肝癌轉(zhuǎn)移。PRMT5和β-catenin可以競爭性結(jié)合MTDH(Metadherin)上的相同結(jié)構(gòu)域。我們的實驗結(jié)果證實應(yīng)用siRNA技術(shù)將PRMT5敲減后可以使P-AKT表達量下降，從而激活A(yù)KT通路，活化的AKT可以通過激活該通路下游諸多靶蛋白，進而調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展，從而影響肝癌細胞的活性。我們在后續(xù)工作中將進一步探究PRMT5在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用機制。

綜上所述，PRMT5可能通過調(diào)控HCC中AKT通路從而促進肝癌細胞凋亡。因此，PRMT5可能是肝癌的潛在生物標志物和治療靶點。