神經(jīng)酰胺從頭合成途徑關(guān)鍵代謝酶的研究進(jìn)展

李玉慧, 陳 成

(天津大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 天津 300072)

神經(jīng)酰胺(Ceramide)由神經(jīng)鞘氨醇長鏈堿基和可變長鏈的脂肪酸組成[1-2](圖1)，神經(jīng)鞘氨醇長鏈堿基和不同的脂肪酸組合形成不同的神經(jīng)酰胺，因此神經(jīng)酰胺不是一種物質(zhì)，而是結(jié)構(gòu)相似的一類物質(zhì)，脂肪酸鏈的長度、不飽和數(shù)以及位置都會影響神經(jīng)酰胺的性質(zhì)。神經(jīng)酰胺不僅是真核生物細(xì)胞膜的重要組成成分，還在細(xì)胞信號傳遞過程中充當(dāng)?shù)诙攀沟闹匾巧玔3]，在細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化等細(xì)胞代謝中發(fā)揮著十分重要的生物學(xué)作用。正是因?yàn)樯窠?jīng)酰胺參與了眾多體內(nèi)代謝活動，所以說其含量一旦異常，便會對個體健康造成極其嚴(yán)重的影響[4-5]。

圖1 神經(jīng)酰胺化學(xué)結(jié)構(gòu)式

神經(jīng)酰胺的合成主要包括3條途徑，分別為：從頭合成途徑、鞘磷脂酶途徑以及補(bǔ)救途徑[4-5](圖2)。從頭合成途徑以絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶(Serine palmitoyltransferase，SPT)將L-絲氨酸和棕櫚酰-CoA縮合為3-酮二氫鞘氨醇為起始步驟，之后3-酮二氫鞘氨醇還原酶(3-Ketodihydrosphingosine reductase，KDSR)將3-酮二氫鞘氨醇還原為二氫鞘氨醇，隨后二氫鞘氨醇在神經(jīng)酰胺合酶(Ceramide synthase，CERS)的作用下生成二氫神經(jīng)酰胺，最后二氫神經(jīng)酰胺被二氫神經(jīng)酰胺去飽和酶(Dihydroceramide desaturase，DES)作用生成神經(jīng)酰胺；鞘磷脂酶途徑由鞘磷脂酶(Sphingomyelinase，SMase)將鞘磷脂水解生成神經(jīng)酰胺；補(bǔ)救途徑先將復(fù)雜的鞘脂轉(zhuǎn)化為鞘氨醇，然后通過鞘氨醇的再?；缮窠?jīng)酰胺。

圖2 神經(jīng)酰胺的合成途徑示意圖[6]

從圖2中可以看出，神經(jīng)酰胺的從頭合成途徑可以為調(diào)控其水平提供更多可能的靶點(diǎn)，因此目前對該途徑中的關(guān)鍵代謝酶的研究越來越多。2019年5月和7月分別發(fā)表在Cell和Science上的兩篇文章，就CerS6和DES1進(jìn)行深入研究后表明了它們與肥胖癥和糖尿病的重大關(guān)聯(lián)，說明了神經(jīng)酰胺從頭合成途徑中代謝酶的重要作用，由此本文主要對該合成途徑中涉及的4種酶的結(jié)構(gòu)，功能，疾病相關(guān)性的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，旨在為深入研究該條途徑提供理論參考。

1 SPT的研究進(jìn)展

SPT屬于α-氧胺合成酶(AOS)家族，該家族是磷酸吡多醛(PLP)依賴性的酶。SPT負(fù)責(zé)將L-絲氨酸和棕櫚酰-CoA脫羧縮合生成3-酮二氫鞘氨醇[7](圖3)，這一步是限速步驟，在所有的生物體內(nèi)保守。

圖3 絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶催化的反應(yīng)[7]

真核生物中，SPT是定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的酶，是由SPT1和SPT2構(gòu)成的異二聚體，SPT2包含PLP結(jié)合所需的賴氨酸殘基，SPT1缺少賴氨酸殘基[8-9]，但是這兩個亞基對于產(chǎn)生功能活躍的異二聚體均是必需的。盡管SPT1在異二聚體中具有明顯的非催化作用，但已顯示該亞基高度保守區(qū)域內(nèi)的單個氨基酸突變會下調(diào)SPT活性，從而導(dǎo)致遺傳性感覺神經(jīng)病1型疾病(HSAN1，ORPHA：36386)[10-11]。對HSAN1患者分析顯示，SPT1的兩個突變熱點(diǎn)分別為Cys133(C133W或C133Y)和Val144(V144D)[12]。

研究人員報道了鞘氨醇單胞菌中結(jié)合PLP的SPT高分辨率結(jié)構(gòu)[12]， SPT單體由3個結(jié)構(gòu)域組成：N端結(jié)構(gòu)域、催化中心和C端結(jié)構(gòu)域(圖4)，同時研究還表明PLP與Lys265結(jié)合，也就是說Lys265對發(fā)揮酶活至關(guān)重要[12]。因?yàn)樵撗芯渴荢PT結(jié)構(gòu)的首次報道，不僅為分析突變位點(diǎn)的致病機(jī)制提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，還為之后的研究提供了方法學(xué)上的指導(dǎo)[13]，為更好地研究該家族的催化機(jī)制提供了見解。該研究組使用已解析的結(jié)構(gòu)對人類酶建模，并將人類SPT1的Cys133映射到細(xì)菌SPT的Asn100上，將Val144映射到ASP111上，發(fā)現(xiàn)二者均靠近二聚體界面(圖4-A)，因此突變會導(dǎo)致復(fù)雜的結(jié)構(gòu)變化，進(jìn)而影響酶活性[13]。SPT除了可以利用L-絲氨酸作為底物外還可以利用其它的氨基酸，研究表明突變使SPT失去了對絲氨酸的底物偏好性，導(dǎo)致絲氨酸和非絲氨酸衍生的鞘脂不平衡，所以出現(xiàn)了疾病HSAN1[14]。這兩項(xiàng)研究不得不使我們產(chǎn)生思考：突變可以使結(jié)構(gòu)產(chǎn)生變化，同時突變也導(dǎo)致了SPT底物偏好性的變化，那么SPT的底物特異性和結(jié)構(gòu)之間究竟是如何關(guān)聯(lián)的？

A為SPT的單體結(jié)構(gòu)圖。N端用淺藍(lán)色表示，C端用淺粉紅色表示，中間包含催化中心的區(qū)域用黃橙色表示，PLP的結(jié)合位點(diǎn)用磚紅色小球表示；映射到細(xì)菌上的突變位點(diǎn)ASN100和ASP111用綠色球體表示。B為SPT異二聚體的整體結(jié)構(gòu)圖。一個單體的顏色分布和圖A相同，另一個單體用青色表示。N端和C端分別用“N”和“C”標(biāo)記

雖然目前已經(jīng)解析了細(xì)菌中SPT的三維結(jié)構(gòu)，也確定突變會導(dǎo)致SPT的底物偏好性產(chǎn)生變化，但是突變影響SPT底物偏好性產(chǎn)生變化后的下游事件尚不清楚，即信號是如何被逐級放大的還需要進(jìn)行更深入的研究。

2 KDSR的研究進(jìn)展

KDSR在神經(jīng)酰胺從頭合成途徑中的主要功能是在還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)的協(xié)助下將3-酮二氫鞘氨醇還原為二氫鞘氨醇(圖5)。

圖5 3-酮二氫鞘氨醇還原酶催化的反應(yīng)

KDSR屬于短鏈脫氫酶，是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的3次跨膜蛋白，N端具有一個跨膜區(qū)，即1～21位氨基酸。C端包含兩個跨膜區(qū)，分別為271～291位氨基酸和294～314位氨基酸，中間部分(22～270位氨基酸)是包含酶活性位點(diǎn)(186～190位氨基酸，YXXXK)的片段，面向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外的胞質(zhì)側(cè)[15](圖6-A)。目前尚無KDSR的三維結(jié)構(gòu)信息，但是我們利用結(jié)構(gòu)預(yù)測網(wǎng)站對其進(jìn)行了預(yù)測，結(jié)構(gòu)中α螺旋和β折疊交替排列形成典型的羅斯曼折疊：β-α-β-α-β，符合脫氫酶家族的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)(圖6-B)。

研究人員發(fā)現(xiàn)了進(jìn)行性對稱性紅斑角化癥(Progressive symmetric erythrokeratoderma，PSEK，ORPHA：316)的致病因子為KDSR[6]，這一發(fā)現(xiàn)暗示了神經(jīng)酰胺類信號分子的功能失常和角化癥的潛在聯(lián)系[16]。 另一項(xiàng)研究[17]表明KDSR 病理突變除可導(dǎo)致皮膚角化癥外，還可導(dǎo)致血小板減少癥，進(jìn)一步表明了 KDSR引發(fā)PSEK病理機(jī)制的復(fù)雜性。Bariana等[18]發(fā)現(xiàn)了KDSR的另一突變位點(diǎn)R154W，并利用斑馬魚模型確認(rèn)了KDSR突變會導(dǎo)致血小板減少，Park等[19]同樣有利用斑馬魚模型進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)了KDSR突變I105R誘導(dǎo)斑馬魚脂肪變性并產(chǎn)生肝損傷。近幾年研究中涉及的部分突變?nèi)绫?所示，但是目前并沒有明確的基因型與表型相關(guān)性的研究，同時可以發(fā)現(xiàn)，近年來關(guān)于KDSR的研究所用的模式生物均為斑馬魚，但其實(shí)在此類研究中更偏向的模式生物為小鼠，這也為我們的研究提供了一個思路。

A為KDSR的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)圖[6]；B為KDSR的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測圖。部分突變位點(diǎn)用橙色球體表示

KDSR是本實(shí)驗(yàn)室在神經(jīng)酰胺從頭合成途徑中研究的酶，對其的研究主要集中在結(jié)構(gòu)和功能上，目前其結(jié)構(gòu)尚在優(yōu)化之中，但是可以看出和之前預(yù)測的結(jié)構(gòu)基本保持一致。我們嘗試?yán)眯∈筮M(jìn)行KDSR的功能性研究，在小鼠體內(nèi)將編碼KDSR的基因敲除，本意是想確定KDSR缺失后對下游信號通路產(chǎn)生的影響，但是敲除后直接致使小鼠死亡，雖然導(dǎo)致后續(xù)實(shí)驗(yàn)無法進(jìn)行，但這也正說明了哺乳動物體內(nèi)KDSR的重要性。

表1 KDSR中的突變位點(diǎn)及其導(dǎo)致的疾病類型

3 CERS的研究進(jìn)展

CERS負(fù)責(zé)將二氫鞘氨醇N-酰化以形成二氫神經(jīng)酰胺(圖7)。哺乳動物中的CERS有6種，均定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中[20]，每種都使用特定鏈長的?；?CoA生成二氫神經(jīng)酰胺[18](表2)。

表2神經(jīng)酰胺合酶的酰基-CoA特異性以及組織分布[21]

圖7 神經(jīng)酰胺合酶催化的反應(yīng)

研究表明，CERS具有6個跨膜區(qū)(TMD)[22]，第4個TMD不能完全跨過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜(圖8)。N端和C端位于相對兩側(cè)[20, 23]，N端面向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，包含糖基化位點(diǎn)。C端面向胞質(zhì)側(cè)并含有磷酸化位點(diǎn)[24-25]，CERS的磷酸化可能是控制各種?；滈L度的鞘脂的分布和水平的關(guān)鍵調(diào)控點(diǎn)，中間的結(jié)構(gòu)域包括Hox樣結(jié)構(gòu)域、TLC結(jié)構(gòu)域、Lag1p基序。6種CERS為同工酶，但是可以明顯看到CerS1缺少Hox樣結(jié)構(gòu)域，那么該結(jié)構(gòu)域的重要性、發(fā)揮作用的機(jī)制尚需深入探索。

圖8 CERS的域結(jié)構(gòu)圖[21]

哺乳動物體內(nèi)的6種神經(jīng)酰胺合酶具有底物特異性，組織分布也不盡相同(表2)，并且其含量異常時也會對個體產(chǎn)生影響。CerS1基因異常會導(dǎo)致8型進(jìn)行性肌陣攣性癲癇(ORPHA：424027)；CerS2是一種抑癌蛋白，缺乏CerS2的小鼠特征是所有組織的C24：0和C24：1神經(jīng)酰胺都被消耗掉，并在7～10個月大的時候發(fā)展為肝腺瘤(HCA)和肝細(xì)胞癌(HCC)[26-27]；CerS3的關(guān)鍵生理功能已被定位在睪丸和皮膚中[28]，CerS3完全缺乏的小鼠在出生后不久便會死于皮膚病[29]，CerS3基因突變的人易患先天性非球形魚鱗狀紅皮病(ORPHA：79394 )以及魚鱗病-矮小身材-短毛-微球菌綜合征(ORPHA：363992)；人乳腺癌和肝癌[30]的惡性轉(zhuǎn)化和生長伴隨著CerS4表達(dá)的升高；CerS5被確定為結(jié)直腸癌(CRC)的標(biāo)志物[31]。除了癌癥之外，2016年的一項(xiàng)研究通過遺傳抑制CerS5可以減少內(nèi)源性C16：0神經(jīng)酰胺以緩解肥胖癥及其并發(fā)癥，表明了CerS5和肥胖癥之間的關(guān)系[32]。在胃癌中，CerS6被描述為一種新型癌蛋白，之后進(jìn)一步證明了無論在體外還是體內(nèi)，CerS6基因敲除均可減少胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[33]。關(guān)于CerS6的最新研究進(jìn)展是發(fā)表在Cell上的一項(xiàng)研究[34]，小鼠在高脂肪飲食中變肥胖時，使CerS6在小鼠體內(nèi)的基因失活能對肥胖、脂肪肝和胰島素抵抗產(chǎn)生保護(hù)作用，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)與CerS6產(chǎn)生的C16：0神經(jīng)酰胺相互作用的線粒體分裂因子Mff對于CerS6的調(diào)控作用，為肥胖癥的治療提供了新方向。值得一提的是CerS2是一種抑癌蛋白，而其它幾種CERS均更傾向?qū)е录膊〉陌l(fā)生，如果利用組織分布的不同進(jìn)行解釋，其它幾種CERS雖然都致病但是組織分布不同，好像是自相矛盾的；如果以域結(jié)構(gòu)為出發(fā)點(diǎn)進(jìn)行解釋，CerS3、CerS4、CerS5、CerS6的域結(jié)構(gòu)排布相似，也不具有說服力。那么究竟是什么原因?qū)е铝薈erS2與其它幾種CERS的功能相反也是今后需要致力研究的一個方向。

由于CERS為多跨膜蛋白，將其從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中提取出來進(jìn)行純化結(jié)晶非常困難，所以目前無可用的三維結(jié)構(gòu)，但是如果想要深入了解CERS與疾病之間復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制就必須解析CERS的三維結(jié)構(gòu)。同時從上文的介紹中也發(fā)現(xiàn)CERS和疾病的聯(lián)系十分密切，因此將CERS作為疾病治療的新選擇具有重大意義，但如果可以更好地了解疾病發(fā)展中CERS表達(dá)變化的分子機(jī)制，可能會更有助于疾病的治療。

4 DES的研究進(jìn)展

DES催化雙鍵插入二氫神經(jīng)酰胺，從而將二氫神經(jīng)酰胺轉(zhuǎn)化為神經(jīng)酰胺[35](圖9)。

圖9 二氫神經(jīng)酰胺去飽和酶催化的反應(yīng)[35]

DES主要包括DES1和DES2兩種， DES1表現(xiàn)出較高的C4-去飽和酶活性和較低的C4-羥化酶活性，DES2是具有C4-去飽和酶和C4-羥化酶活性的雙功能酶，目前關(guān)于DES1的研究更多。Rodriguez cuenca等[35]詳細(xì)介紹了二氫神經(jīng)酰胺在新陳代謝疾病中的作用；Casasampere[36]通過對DES1抑制劑的研究表明抑制DES1活性后可以防止高脂喂養(yǎng)后小鼠的血管功能障礙和高血壓，使得該途徑代表了逆轉(zhuǎn)肥胖相關(guān)血管功能障礙的新靶標(biāo)；Casasampere[37]研究DES1抑制劑可以通過二氫神經(jīng)酰胺依賴性和非依賴性途徑激活自噬，而自噬在許多疾病中均具有關(guān)鍵作用，因此兩種途徑之間的平衡最終影響細(xì)胞的命運(yùn)；研究表明DES1是對抗淀粉樣變性的阿爾茨海默氏病的重要治療靶標(biāo)[38]。關(guān)于DES1的最新研究進(jìn)展是發(fā)表在Science上的一項(xiàng)研究[39]，通過阻止小鼠體內(nèi)DES1的活性可以減少體內(nèi)神經(jīng)酰胺總量，改善脂肪變性和胰島素抵抗，從而改變代謝疾病發(fā)展軌跡，并將DES1定位成一個“可用藥”靶點(diǎn)，對前驅(qū)糖尿病、糖尿病和心臟病這些波及數(shù)十億人口健康的疾病具有深遠(yuǎn)的影響。

DES1的抑制劑主要包括酚類化合物和鞘脂類似物：維甲酰酚胺(4-HPR)是全反式維甲酸(一種維生素A類似物)的合成衍生物[40]，是第一種抑制DES1的化學(xué)治療藥物；白藜蘆醇(3,5,4′-三羥基-反式-二苯乙烯)是一種膳食多酚，可輕度抑制DES1活性[41]；四氫大麻酚(THC)是大麻的主要生物活性成分[42]，可以抑制大鼠肝微粒體中的DES1；化合物GT11(也稱為C8-環(huán)丙烯基神經(jīng)酰胺)是報道的第一個DES1抑制劑[43]?；贒ES1脫飽和的機(jī)理，我們設(shè)計了一種名為XM462的5-噻二氫神經(jīng)酰胺[44]，XM462已被用作藥理學(xué)工具，用于顯示dhCer在人胃癌細(xì)胞系HGC27中作為自噬誘導(dǎo)劑的作用。

從近幾年的研究中可以看出DES1在體內(nèi)起消極作用，即抑制DES1的活性才可以對機(jī)體健康產(chǎn)生積極影響，因此DES1可以被定位成多種疾病的治療靶點(diǎn)。如果我們可以在現(xiàn)有的基礎(chǔ)上獲得其三維結(jié)構(gòu)，之后就可以研究對其發(fā)揮酶活重要的一些位點(diǎn)，可以更針對性地設(shè)計治療疾病的藥物，對疾病的靶向治療將是重大突破。

5 總結(jié)與展望

通過對神經(jīng)酰胺從頭合成途徑的綜述，我們發(fā)現(xiàn)雖然研究人員已經(jīng)證明了該途徑在體內(nèi)代謝中的重要性，可是由于途徑中所涉及的酶均是膜結(jié)合的蛋白，所以除了SPT之外，其它3種酶的三維結(jié)構(gòu)信息均極度缺乏，這也導(dǎo)致了我們對相關(guān)疾病的致病機(jī)制了解得不夠透徹。如果想對它們的致病性進(jìn)行深入研究或者為疾病治療開發(fā)設(shè)計新藥物，三維結(jié)構(gòu)信息是必不可少的，這也為今后的研究提供了一個方向。

本文主要對神經(jīng)酰胺從頭合成途徑疾病相關(guān)性的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，SPT突變致使功能異常導(dǎo)致HSAN1，KDSR功能異常主要導(dǎo)致PSEK，6種CERS由于其分布組織的不同，表達(dá)異常也會導(dǎo)致不同類型的疾病，DES表達(dá)異常也導(dǎo)致了多種代謝疾病?？梢园l(fā)現(xiàn)神經(jīng)酰胺從頭合成途徑一旦發(fā)生異常，便會對個體健康產(chǎn)生極其嚴(yán)重的影響，同時目前的研究主要集中在病理蛋白層面，但是病理信號是如何逐級放大到組織層面乃至機(jī)體層面尚不清楚，這表明了對該途徑進(jìn)行深入研究的必要性，如可以利用蛋白質(zhì)組學(xué)以及脂質(zhì)組學(xué)對該途徑所涉及的酶蛋白以及代謝途徑進(jìn)行研究。