低溫脅迫下斑馬魚(yú)胚胎成纖維細(xì)胞(ZF4)應(yīng)激顆粒的探究

程鵬麗， 胡瑞芹， 李根芳， 陳良標(biāo)

(1. 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心;2. 水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室; 3. 海洋生物科學(xué)國(guó)際聯(lián)合研究中心 中國(guó)科學(xué)技術(shù)部， 上海 201306)

真核細(xì)胞中，mRNA調(diào)控在細(xì)胞的許多區(qū)域和細(xì)胞周期的多個(gè)階段中進(jìn)行。mRNA的重要貯存庫(kù)是RNA顆粒，包括p-body[1-2]、應(yīng)激顆粒(Stress granules,SGs)[3-5]以及其他類型的含mRNA的細(xì)胞質(zhì)顆粒。這些RNA顆粒的分類是由它們的組成、大小和細(xì)胞來(lái)源決定的。RNA顆粒的一個(gè)顯著特點(diǎn)是沒(méi)有膜包裹，從而使RNA和相關(guān)的RNA結(jié)合蛋白在動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)下自由穿梭于顆粒之間，所以這種聚集體是不穩(wěn)定的[6]。因此，從細(xì)胞中分離含RNA的顆粒以及在體外進(jìn)一步表征仍然是亟待解決的問(wèn)題。在這些RNA顆粒中，近年來(lái)對(duì)應(yīng)激顆粒的研究也逐漸增多。

應(yīng)激顆粒是細(xì)胞在受到環(huán)境脅迫 (如熱休克、氧化性刺激、病毒感染等) 時(shí)，未翻譯的mRNA與一些RNA結(jié)合蛋白如G3BP (GTPase-activating protein SH3 domain binding protein )[7]，TIA-1 (T-cell-restricted intracellular antigens1)[8]等結(jié)合，在經(jīng)過(guò)蛋白與蛋白的相互作用而形成的致密顆粒[9-10]。G3BP1、TIA-1通常作為經(jīng)典的應(yīng)激顆粒形成的標(biāo)記蛋白。研究表明，低溫脅迫可誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞和酵母形成應(yīng)激顆粒[11]，并且應(yīng)激顆粒的形成對(duì)細(xì)胞存活起到積極影響。哺乳動(dòng)物細(xì)胞處于穩(wěn)態(tài)條件下，G3BP1會(huì)使USP10的抗氧化功能失活。USP10是G3BP1的綁定配體。亞砷酸鹽、缺氧、熱休克等外界環(huán)境脅迫下能誘導(dǎo)SGs的形成，此時(shí)還可激活A(yù)TM。SGs的形成使G3BP1對(duì)USP10的抑制活性失活，USP10隨后被ATM誘導(dǎo)的磷酸化或ATM磷酸化蛋白激活，減少ROS產(chǎn)生和ROS依賴性的細(xì)胞凋亡，以此達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的目的[12]。

哺乳動(dòng)物細(xì)胞中應(yīng)激顆粒相關(guān)的研究層出不窮，但魚(yú)類細(xì)胞中有關(guān)應(yīng)激顆粒的研究卻極少。僅在研究斑馬魚(yú)FUS(融合肉瘤)的細(xì)胞質(zhì)定位和早期胚胎發(fā)育時(shí)，對(duì)經(jīng)典應(yīng)激顆粒標(biāo)志物如TIAL-1 (T細(xì)胞內(nèi)抗原like-1)[13-14]進(jìn)行過(guò)鑒定。魚(yú)類細(xì)胞在低溫脅迫下，應(yīng)激顆粒的形成和解聚的研究還未見(jiàn)報(bào)道。因此本實(shí)驗(yàn)旨在探究在不同低溫脅迫條件下，斑馬魚(yú)胚胎成纖維細(xì)胞(ZF4)應(yīng)激顆粒的形成與解聚情況，期望可以為低溫下ZF4細(xì)胞應(yīng)激顆粒的形成彌補(bǔ)理論上的空缺。

1 材料與方法

1.1 材料和細(xì)胞培養(yǎng)方法

ZF4細(xì)胞系(購(gòu)于American Type Culture Collection)培養(yǎng)所用的完全培養(yǎng)基由含有10%的胎牛血清 (Gibco)和1%的Penicillin-Streptomycin Solution(含有青霉素和鏈霉素)，以及89% DMEM/F12(含1%谷氨酰胺，Hyclone)配制而成，在28 ℃，5%CO2，95%濕度下進(jìn)行培養(yǎng)。2～3 d換1次培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至80%～90%用0.25% Trypsin(Gibco)消化，傳代后繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2 主要試劑和儀器

胎牛血清購(gòu)自Gibco公司；培養(yǎng)基DMEM，含有青霉素(10 000 IU)和鏈霉素(10 000 μg /mL)的混合液-雙抗、胰蛋白酶購(gòu)自Hyclone 公司；SYBR Green購(gòu)自TaKaRa公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司；一抗TIAL1購(gòu)自NOVUS公司，貨號(hào)NBP1-79932；二抗(羊抗兔)購(gòu)自華安生物公司；其他常規(guī)試劑均購(gòu)自生工生物工程 (上海) 股份有限公司。

倒置熒光顯微鏡購(gòu)自Carl Zeiss Jena 公司； 細(xì)胞常溫培養(yǎng)箱(Galaxy 170R)購(gòu)自Eppendorf公司； 細(xì)胞低溫培養(yǎng)箱(Galaxy 170S)購(gòu)自Eppendorf公司。

1.3 低溫脅迫及脅迫后恢復(fù)策略

低溫脅迫實(shí)驗(yàn)用梯度降溫來(lái)觀察應(yīng)激顆粒的形成。分別選取18 ℃、13 ℃以及10 ℃進(jìn)行低溫脅迫。實(shí)驗(yàn)組ZF4細(xì)胞在18 ℃低溫下分別進(jìn)行處理5、12和24 h； 13 ℃低溫下分別進(jìn)行處理2、3、4和5 h； 10 ℃低溫下分別進(jìn)行處理40 min、1、2、3和4 h；對(duì)照組ZF4細(xì)胞在28 ℃常溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

低溫恢復(fù)實(shí)驗(yàn)也分為實(shí)驗(yàn)組ZF4細(xì)胞及對(duì)照組ZF4細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組ZF4細(xì)胞先在13 ℃低溫下處理4 h，然后放回28 ℃分別培養(yǎng)5、10、15和20 min。對(duì)照組ZF4細(xì)胞在常溫培養(yǎng)箱(28 ℃)培養(yǎng)。

1.4 細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察TIAL1在細(xì)胞中的定位

將實(shí)驗(yàn)組ZF4細(xì)胞及對(duì)照組ZF4細(xì)胞分別從培養(yǎng)箱中取出，移除培養(yǎng)基，用DPBS洗滌2次，然后用 4% 的多聚甲醛在低溫下固定20 min；用PBS洗滌2 次，加triton X-100穿孔10 min；再用PBS洗滌3次，然后用2% 的BSA (PBS 配)封閉細(xì)胞 1 h；用1∶3000稀釋的TIAL1兔一抗室溫孵育2 h；再用PBS 洗滌3次，每次5 min；用1∶500稀釋的二抗避光孵育1 h；用PBS洗滌3次，每次5 min；最后用含有DAPI的抗猝滅劑避光封片，放置于濕盒中，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.5 RT-qPCR檢測(cè)g3bp1和tial1的轉(zhuǎn)錄水平

實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞進(jìn)行總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄后，進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)。RT-qPCR按照每個(gè)樣品3次生物學(xué)重復(fù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。內(nèi)參為β-actin。本實(shí)驗(yàn)所用的20 μL反應(yīng)體系為：SYBR Green 10 μL，cDNA 2 μL，上下游引物各1 μL，去離子水6 μL。程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性20 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)；最后72 ℃再延伸10 min。本實(shí)驗(yàn)RT-qPCR所用引物均由生工生物工程 (上海) 股份有限公司合成(表1)。

表1 本研究所使用的引物

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果均來(lái)自至少3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，圖中所示結(jié)果均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)。T-test 法用于檢測(cè)低溫處理的顯著性，兩兩之間的顯著差異(P< 0.05)利用 two-tailed 法多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫下ZF4細(xì)胞應(yīng)激顆粒形成的探究

為了探究低溫脅迫對(duì)斑馬魚(yú)胚胎成纖維細(xì)胞(ZF4)應(yīng)激顆粒形成的影響。將ZF4細(xì)胞在不同低溫環(huán)境下處理不同時(shí)間，利用細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)和RT-qPCR實(shí)驗(yàn)，探究ZF4細(xì)胞應(yīng)激顆粒的形成情況。

2.1.1 探究18 ℃低溫脅迫對(duì)ZF4細(xì)胞應(yīng)激顆粒形成的影響

對(duì)照組細(xì)胞在28 ℃正常培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞在18 ℃低溫下分別處理5、12和24 h，然后用TIAL1對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞分別進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)，同時(shí)用RT-qPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)低溫脅迫下應(yīng)激顆粒形成過(guò)程中g(shù)3bp1和tial1的mRNA 表達(dá)情況。結(jié)果表明：正常溫度(28 ℃)培養(yǎng)的ZF4細(xì)胞，幾乎沒(méi)有應(yīng)激顆粒形成。而與對(duì)照組細(xì)胞相比，在 18 ℃低溫處理下，隨著處理時(shí)間的增加，ZF4細(xì)胞應(yīng)激顆粒逐漸形成。在18 ℃處理24 h時(shí)，應(yīng)激顆粒的形成最明顯(圖1-A)，表現(xiàn)為應(yīng)激顆粒的數(shù)量增多和直徑最大。與細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)一致，18 ℃處理24 h時(shí)g3bp1和tial1的mRNA水平均顯著升高(圖1-B、C)。

A中DAPI表示對(duì)細(xì)胞核的染色(藍(lán)色)；TIAL1表示對(duì)應(yīng)激顆粒的標(biāo)記(紅色)；Merge表示兩次染色的合并；圖中右下角方框代表箭頭所指細(xì)胞的局部放大。B中、C中“*”: P<0.05; “**”: P <0.01; “***”: P <0.001；下同。28 ℃為control

2.1.2 探究13 ℃低溫脅迫對(duì)ZF4細(xì)胞應(yīng)激顆粒形成的影響

對(duì)照組細(xì)胞在28 ℃正常培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞在13 ℃低溫下分別處理3、4和5 h，然后用TIAL1分別進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)，同時(shí)用RT-qPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)低溫脅迫下應(yīng)激顆粒形成過(guò)程中g(shù)3bp1和tial1的mRNA 表達(dá)情況。結(jié)果表明：與對(duì)照組細(xì)胞相比，隨著13℃低溫處理時(shí)間的增加，應(yīng)激顆粒逐漸形成。在13 ℃低溫處理4 h時(shí)，應(yīng)激顆粒的形成最明顯(圖2-A)，表現(xiàn)為應(yīng)激顆粒數(shù)量增多和直徑最大。與細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)一致，13 ℃處理4 h時(shí)g3bp1和tial1的 mRNA水平均顯著升高(圖2-B、C)。

2.1.3 探究10 ℃低溫脅迫對(duì)ZF4細(xì)胞應(yīng)激顆粒形成的影響

對(duì)照組細(xì)胞在28 ℃正常培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞分別在10 ℃低溫下分別處理40 min、1 h和2 h，然后用TIAL1分別進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)，同時(shí)用RT-qPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)低溫脅迫下應(yīng)激顆粒形成過(guò)程中g(shù)3bp1和tial1的mRNA 表達(dá)情況。結(jié)果表明：與對(duì)照組細(xì)胞相比，實(shí)驗(yàn)組在 10 ℃低溫處理下，隨著處理時(shí)間的增加，ZF4細(xì)胞應(yīng)激顆粒逐漸形成。在10 ℃處理1 h時(shí)，應(yīng)激顆粒的形成最明顯(圖3-A)，表現(xiàn)為應(yīng)激顆粒的數(shù)量增多和直徑最大。與細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)一致，10 ℃處理1 h時(shí)g3bp1和tial1的mRNA水平均顯著升高(圖3-B、C)。

經(jīng)過(guò)3次梯度降溫的低溫脅迫實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)18 ℃低溫處理24 h，13 ℃低溫處理4 h和10 ℃低溫處理1 h時(shí)ZF4細(xì)胞應(yīng)激顆粒形成最明顯。也就是說(shuō)，隨著脅迫溫度的降低，應(yīng)激顆粒的形成速度也在加快。

圖2 13 ℃低溫脅迫下，通過(guò)細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)(A)和RT-qPCR實(shí)驗(yàn)(B、C)探究應(yīng)激顆粒的形成

圖3 10 ℃低溫脅迫下，通過(guò)細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)(A)和RT-qPCR實(shí)驗(yàn)(B、C)探究應(yīng)激顆粒的形成

2.2 低溫脅迫消失后ZF4細(xì)胞應(yīng)激顆粒解聚的探究

探究ZF4細(xì)胞應(yīng)激顆粒的解聚是通過(guò)選取13 ℃低溫處理4 h作為應(yīng)激顆粒恢復(fù)實(shí)驗(yàn)的起點(diǎn)，此時(shí)應(yīng)激顆粒形成明顯。對(duì)照組為28 ℃培養(yǎng)的細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞為13 ℃低溫下處理4 h后放回28 ℃分別處理5、10、15和20 min的ZF4細(xì)胞。用TIAL1分別進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)。同時(shí)用RT-qPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)低溫脅迫下應(yīng)激顆粒解聚過(guò)程中g(shù)3bp1和tial1的mRNA 表達(dá)情況。結(jié)果表明：細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)(圖4-A)和RT-qPCR實(shí)驗(yàn)(圖4-B、C)結(jié)果一致，當(dāng)?shù)蜏孛{迫消失后，ZF4細(xì)胞中的應(yīng)激顆粒會(huì)在十幾分鐘快速解聚，應(yīng)激顆粒的解聚表現(xiàn)為應(yīng)激顆粒的快速溶解消散。

圖4 脅迫消失后，隨恢復(fù)時(shí)間變化，細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)(A)和RT-qPCR實(shí)驗(yàn)(B、C)探究應(yīng)激顆粒的解聚

3 討論與結(jié)論

應(yīng)激顆粒的形成是生物體受到外界不良環(huán)境壓力時(shí)，體內(nèi)細(xì)胞翻譯抑制而形成的細(xì)胞質(zhì)RNA顆粒。這種顆粒已經(jīng)在酵母、植物、哺乳動(dòng)物細(xì)胞中得到證實(shí)，并且可以通過(guò)細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)和電子顯微鏡進(jìn)行觀察[15-18]。當(dāng)外界脅迫消失，細(xì)胞恢復(fù)到適宜生長(zhǎng)環(huán)境后，應(yīng)激顆?？梢匝杆俳饩壑敝料19]。在低溫刺激下，哺乳動(dòng)物細(xì)胞在數(shù)小時(shí)內(nèi)產(chǎn)生應(yīng)激顆粒，但當(dāng)細(xì)胞恢復(fù)到最適宜的生長(zhǎng)溫度時(shí)，應(yīng)激顆粒在數(shù)分鐘內(nèi)就迅速解聚。在熱激或亞砷酸鹽誘導(dǎo)的氧化性應(yīng)激時(shí)，哺乳動(dòng)物細(xì)胞中SGs在15～30 min后出現(xiàn)，而解聚需要幾十分鐘。例如，Hofmann等[20]的研究就發(fā)現(xiàn)cos7(非洲綠猴腎成纖維細(xì)胞)細(xì)胞，在10 ℃10 h應(yīng)激顆粒形成明顯，而當(dāng)返回到37 ℃，應(yīng)激顆粒在5～10 min就迅速解聚消失。在釀酒酵母中，從30 ℃放到10 ℃處理4 h時(shí)，應(yīng)激顆粒才出現(xiàn)明顯，而應(yīng)激顆粒的解聚則在2.5 min左右。在Hela細(xì)胞中10 ℃低溫處理10 h，應(yīng)激顆粒出現(xiàn)明顯[21]。在ZF4細(xì)胞中，低溫脅迫下應(yīng)激顆粒的形成和解聚還未知。以上在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的研究也為本實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)提供了思路。

因此，在本研究中我們選取了18 ℃、13 ℃和10 ℃作為ZF4細(xì)胞的低溫脅迫溫度，利用細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫溫度和時(shí)間的不同，應(yīng)激顆粒的形成速度也不同。并且細(xì)胞免疫熒光和RT-qPCR實(shí)驗(yàn)在18 ℃低溫處理24 h，13 ℃低溫處理4 h以及10 ℃低溫處理1 h時(shí)，ZF4細(xì)胞中應(yīng)激顆粒形成明顯。隨著脅迫溫度的降低，應(yīng)激顆粒的形成速度也在加快。應(yīng)激顆粒的形成表現(xiàn)為應(yīng)激顆粒數(shù)量增多和直徑變大。當(dāng)ZF4細(xì)胞在13 ℃低溫處理4 h后，將細(xì)胞恢復(fù)到適宜生長(zhǎng)溫度(28 ℃)時(shí)，發(fā)現(xiàn)應(yīng)激顆粒會(huì)在十幾分鐘迅速解聚。應(yīng)激顆粒的解聚主要表現(xiàn)為應(yīng)激顆粒的快速溶解消散。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)低溫脅迫下斑馬魚(yú)胚胎成纖維細(xì)胞也能形成應(yīng)激顆粒，并且脅迫消失應(yīng)激顆粒也會(huì)迅速解聚，這與哺乳動(dòng)物細(xì)胞類似。隨著脅迫溫度的降低，應(yīng)激顆粒的形成速度也在加快。魚(yú)類細(xì)胞中有關(guān)應(yīng)激顆粒的研究極少，本文首次發(fā)現(xiàn)魚(yú)類細(xì)胞在低溫下形成應(yīng)激顆粒，主要成分與哺乳動(dòng)物細(xì)胞類似，表明應(yīng)激顆粒是動(dòng)物細(xì)胞應(yīng)對(duì)低溫刺激的普遍反應(yīng)機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)也期望可以為ZF4細(xì)胞低溫下應(yīng)激顆粒的研究提供理論上的支持。近年來(lái)，有研究表明，哺乳動(dòng)物細(xì)胞中應(yīng)激顆粒的形成可以通過(guò)減少細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生來(lái)減緩細(xì)胞凋亡[12]。那么低溫脅迫下，魚(yú)類細(xì)胞中應(yīng)激顆粒的產(chǎn)生是否也是通過(guò)減緩細(xì)胞通向死亡的進(jìn)程來(lái)有利于細(xì)胞存活呢，這也可以作為魚(yú)類細(xì)胞中應(yīng)激顆粒后續(xù)研究的一個(gè)方向。低溫脅迫下，SGs的這種保護(hù)是由于其包含部分直接參與凋亡調(diào)節(jié)的因子來(lái)起作用還是通過(guò)某些細(xì)胞信號(hào)通路激活或抑制某些蛋白而改變蛋白間的相互作用來(lái)實(shí)現(xiàn)其保護(hù)細(xì)胞的功能，都有待進(jìn)一步研究探索。