機(jī)器學(xué)習(xí)助力酶定向進(jìn)化

蔣迎迎， 曲 戈， 孫周通

(中國科學(xué)院 天津工業(yè)生物技術(shù)研究所， 天津 300308)

酶定向進(jìn)化，主要指通過蛋白質(zhì)工程等手段，在實(shí)驗(yàn)室模擬并加速天然酶進(jìn)化過程，對目的基因進(jìn)行多輪反復(fù)的突變、表達(dá)和篩選，以分離或富集具有一個或多個預(yù)期性能改進(jìn)的酶突變體(圖1)。三十多年來，研究者開發(fā)了各種各樣的工具和技術(shù)，例如易錯PCR (Error-prone polymerase chain reaction, epPCR) 及DNA重組 (DNA shuffling) 等，將這一進(jìn)化過程從自然界的數(shù)百萬年縮短到幾個月甚至幾周時間[1-4]。然而篩選工作量是定向進(jìn)化的瓶頸，想要克服這一挑戰(zhàn)，不僅需要采用先進(jìn)的基因誘變技術(shù)和方法，還需借助適當(dāng)?shù)挠?jì)算手段來指導(dǎo)突變體及其文庫設(shè)計(jì)。在此基礎(chǔ)上，半理性設(shè)計(jì)與理性設(shè)計(jì)應(yīng)運(yùn)而生。半理性設(shè)計(jì)主要指憑借生物信息學(xué)方法，基于蛋白三維結(jié)構(gòu)、同源蛋白序列比對或在已有知識的基礎(chǔ)上，有目的地對蛋白質(zhì)進(jìn)行改造，其關(guān)鍵在于通過計(jì)算機(jī)模擬獲得潛在的有益突變位點(diǎn)，再利用飽和突變技術(shù)構(gòu)建適當(dāng)規(guī)模的突變文庫[5]。理性設(shè)計(jì)可通過預(yù)測蛋白質(zhì)活性位點(diǎn)，考察某位點(diǎn)突變對催化性能的影響，從而對蛋白質(zhì)進(jìn)化進(jìn)行設(shè)計(jì)指導(dǎo)和虛擬篩選。雖然定向進(jìn)化、半理性設(shè)計(jì)以及理性設(shè)計(jì)在蛋白質(zhì)工程中都取得了顯著成果，但在生物催化劑優(yōu)化過程中的特定情況下，都需要進(jìn)行大量的計(jì)算或?qū)嶒?yàn)篩選工作。

圖1 酶定向進(jìn)化流程示意圖

近年來，機(jī)器學(xué)習(xí) (Machine learning, ML) 逐漸成為助力酶定向進(jìn)化的一種新方法[6]。機(jī)器學(xué)習(xí)是從人工智能的廣闊領(lǐng)域發(fā)展而來，其目的是用機(jī)器來模擬人類的智慧，可以簡單理解為基于已有經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行成功預(yù)測的學(xué)習(xí)過程。隨著計(jì)算機(jī)存儲容量和處理能力的不斷進(jìn)步，機(jī)器學(xué)習(xí)的發(fā)展速度令人嘆為觀止[7]。機(jī)器學(xué)習(xí)的主要目標(biāo)是將一組輸入值 (如氨基酸序列) 與另一組與其相關(guān)的變量輸出值 (如催化活性) 之間進(jìn)行建模。一旦確立了這樣的數(shù)學(xué)模型，就可以通過測量觀測值來預(yù)測其所對應(yīng)的輸出值。機(jī)器學(xué)習(xí)技術(shù)通過處理實(shí)驗(yàn)已知數(shù)據(jù)，將與問題相關(guān)的性能標(biāo)準(zhǔn)最大化，來自動構(gòu)建這些復(fù)雜關(guān)系的計(jì)算模型，這一過程稱為“訓(xùn)練”。訓(xùn)練后的模型為輸入量如何映射到輸出量這一問題提供新的解決方案，并且可以預(yù)測不屬于訓(xùn)練集的新輸入值[7]。

1 機(jī)器學(xué)習(xí)的發(fā)展歷程與操作流程

作為一門多領(lǐng)域交叉學(xué)科，機(jī)器學(xué)習(xí)的發(fā)展離不開各個學(xué)科(如統(tǒng)計(jì)學(xué)、計(jì)算機(jī)學(xué)、概率論等)自身的進(jìn)步。近百年來，由于理論與技術(shù)之間的脫節(jié)，機(jī)器學(xué)習(xí)研究經(jīng)歷了2次低谷，分別為20世紀(jì)70年代以及80年代末，然而每次科學(xué)技術(shù)進(jìn)步又將其推向熱潮，充分說明機(jī)器學(xué)習(xí)與人類生產(chǎn)生活密不可分的多學(xué)科特性。

1.1 機(jī)器學(xué)習(xí)的發(fā)展歷程

當(dāng)代機(jī)器學(xué)習(xí)經(jīng)歷了70余年的研究歷史，具體發(fā)展歷程如圖2所示。1943年，Warren McCulloch和Walter Pitts教授研究并提出了基于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的計(jì)算模型理論[8]；1949年，由Donald Hebb教授在為神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)開發(fā)Hebbian學(xué)習(xí)時得到了進(jìn)一步發(fā)展；次年，享譽(yù)“人工智能之父”的Alan Turing教授預(yù)見了智能機(jī)器的可能性并給出著名的“圖靈測試”；1951年，Marvin Minsky和Dean Edmonds教授建立了第一臺神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)計(jì)算機(jī)SNARC；1956年，John McCarthy在達(dá)特茅斯會議上提出了“人工智能”這個詞，用來描述“制造智能機(jī)器的科學(xué)和工程”。人工智能作為一門新興學(xué)科而出現(xiàn)，其目標(biāo)是創(chuàng)建可以在復(fù)雜多變的環(huán)境中學(xué)習(xí)、做出反應(yīng)以及提供決策的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)[9-10]。1964年，人們設(shè)計(jì)出具有初步智能的機(jī)器，例如STUDENT機(jī)器可以實(shí)現(xiàn)一些數(shù)學(xué)定理和語句邏輯推理的機(jī)器證明[11]，另一個早期的例子是ELIZA機(jī)器可以模仿人類對話，盡管方式有限[12]；1969年，Marvin Minsky和Seymour Papert教授證明了當(dāng)時流行算法的局限性，對機(jī)器學(xué)習(xí)領(lǐng)域具有深遠(yuǎn)影響。自此，基于人工智能的計(jì)算設(shè)備和軟件逐漸獲得發(fā)展。

人工智能發(fā)展的第二高峰期在20世紀(jì)80年代初。從1980年開始，第一屆機(jī)器學(xué)習(xí)國際研討會在美國卡內(nèi)基梅隆大學(xué)舉行，機(jī)器學(xué)習(xí)的研究在世界范圍內(nèi)掀起一股熱潮；1986年，MachineLearning期刊創(chuàng)立，有力推動機(jī)器學(xué)習(xí)領(lǐng)域發(fā)展；同年，David Rumelhart、Geoffrey Hinton和Ronald Williams等合作提出了被學(xué)術(shù)界廣泛認(rèn)可的反向傳播算法(Back-propagation，BP)[13]；Eric Baum教授在1988年發(fā)表了多層前饋神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型 (Multilayer feed-forward neural network)[14]，這些數(shù)字模型的出現(xiàn)使人工智能達(dá)到了新的高峰，同年，Terrence Sejnowski團(tuán)隊(duì)基于蛋白質(zhì)序列信息預(yù)測二級結(jié)構(gòu)，首次將這種算法應(yīng)用于化學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域[15]；1989年，Yann LeCun教授提出了卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò) (Convolutional neural networks，CNN) 計(jì)算模型。作為首個被成功訓(xùn)練的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，它是目前最為流行的計(jì)算模型之一，為今后的深度學(xué)習(xí)奠定了基礎(chǔ)[16-17]。與此同時，各種專家系統(tǒng)也紛紛進(jìn)入市場，如卡內(nèi)基梅隆大學(xué)為數(shù)字設(shè)備公司 (Digital Equipment Corporation，DEC)創(chuàng)建了一個專家系統(tǒng)，該專家系統(tǒng)通過自動化決策每年幫助DEC節(jié)省了約4000萬美元[18]，然而該系統(tǒng)很快被歷史淘汰，人工智能進(jìn)入了第二次低谷。

20世紀(jì)90年代后，邏輯回歸、支持向量機(jī)、最大熵方法等淺層機(jī)器學(xué)習(xí)算法開始出現(xiàn)，雖然比起基于規(guī)則的傳統(tǒng)方法具有很多優(yōu)越性，但是礙于有限的樣本和計(jì)算能力，使得表示數(shù)據(jù)間復(fù)雜函數(shù)的能力有限，只能夠提取到初級特征，從而學(xué)習(xí)/訓(xùn)練能力不強(qiáng)[19]。當(dāng)前的人工智能熱潮始于20世紀(jì)末，其驅(qū)動力是存儲數(shù)據(jù) (“大數(shù)據(jù)”) 的快速增長、計(jì)算能力 (圖形處理單元GPU、谷歌的張量處理單元TPU等) 的提升，以及機(jī)器學(xué)習(xí)算法 (如深度學(xué)習(xí)) 的持續(xù)優(yōu)化[20]。這些因素的融合是革命性的，特別是在合理時間內(nèi)訓(xùn)練深層次網(wǎng)絡(luò)模型的可行性證明了這種方法在電子商務(wù)、游戲、醫(yī)學(xué)圖像分析、人臉識別和自動駕駛車輛等領(lǐng)域的應(yīng)用潛力[9]。如DeepMind公司基于深度學(xué)習(xí)開發(fā)了AlphaGo程序，2016年輕而易舉地戰(zhàn)勝了人類圍棋世界冠軍；兩年后，該公司基于深度神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)開發(fā)的AlphaFold程序，在第13屆全球蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測競賽上又擊敗了眾多競爭對手，獲得冠軍。

圖2 機(jī)器學(xué)習(xí)發(fā)展歷程

1.2 機(jī)器學(xué)習(xí)操作流程

定向進(jìn)化的策略是從親本序列構(gòu)建一個突變體文庫，并篩選出所需要的提高蛋白質(zhì)特性的突變體，并使用最佳突變體作為下一輪進(jìn)化的親本，丟棄其他突變體。機(jī)器學(xué)習(xí)助力定向進(jìn)化的策略是將所有突變體的序列和篩選數(shù)據(jù)用于訓(xùn)練一組模型 (涵蓋線性、核、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和集成方法等算法)，使用精準(zhǔn)性最高的模型用于計(jì)算機(jī)模擬篩選進(jìn)化過程中的突變體，該模型可以模擬所有可能序列的適應(yīng)度，并根據(jù)適應(yīng)度對序列進(jìn)行排序，之后構(gòu)建一個限制性文庫，其中包含具有最高預(yù)測適應(yīng)度的突變體，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)篩選驗(yàn)證[21]。機(jī)器學(xué)習(xí)常用策略主要包括3種：有監(jiān)督學(xué)習(xí) (Supervised learning)、無監(jiān)督學(xué)習(xí) (Unsupervised learning) 和半監(jiān)督學(xué)習(xí) (Semi-supervised learning)。酶分子改造研究致力于得到性能改善的突變體酶，所以有監(jiān)督學(xué)習(xí)受到更多的關(guān)注。圖3是有監(jiān)督機(jī)器學(xué)習(xí)算法的工作流程示意圖，主要分為以下3個步驟[22]。步驟1：將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成編程語言識別的表格形式 (如.csv)，并拆分為訓(xùn)練集和測試集兩部分，前者用于微調(diào)基于機(jī)器學(xué)習(xí)的預(yù)測模型的參數(shù)，而后者用于最終評估。數(shù)據(jù)集中任何錯誤、偏差或不平衡都將影響預(yù)測變量的性能，因此必須給予矯正。這一步驟通常是最耗時的階段。步驟2：根據(jù)訓(xùn)練集進(jìn)行預(yù)測模型訓(xùn)練，如通過導(dǎo)出決策邊界并判斷數(shù)據(jù)點(diǎn)是在邊界內(nèi)還是在邊界外對輸入數(shù)據(jù)進(jìn)行分類，盡可能解決過度擬合或欠擬合問題。所以步驟2的主要挑戰(zhàn)是避免數(shù)據(jù)欠擬合 (高偏差) 和過擬合 (高方差)。步驟3：根據(jù)測試集評估預(yù)測模型的性能，如對連續(xù)標(biāo)簽 (label) 計(jì)算真/假陽性和陰性、相關(guān)度量或計(jì)算均方根誤差 (RMSE)。初始數(shù)據(jù)拆分的隨機(jī)性以及數(shù)據(jù)不平衡可能會使評估模型產(chǎn)生偏差，用于評估的各項(xiàng)指標(biāo)對不同數(shù)據(jù)偏差的魯棒性也有所不同，通常會使最終評估失效。

圖3 機(jī)器學(xué)習(xí)預(yù)測流程示意圖

在酶設(shè)計(jì)改造領(lǐng)域，機(jī)器學(xué)習(xí)通常使用insilico的方法對組合文庫進(jìn)行采樣，從而在每一輪中通過序列空間搜索實(shí)現(xiàn)更大的篩選。在這種方法中，來自組合文庫 (也稱輸入文庫) 中隨機(jī)樣本的真實(shí)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用于訓(xùn)練機(jī)器學(xué)習(xí)模型，這些模型可預(yù)測較小的突變體數(shù)據(jù)集 (即預(yù)測文庫)。然后將表現(xiàn)最佳的突變體用作下一輪進(jìn)化的親本序列，并在新位置進(jìn)行突變。通過使用這種方法，大幅度提高了通量篩選，可以在一輪中同時探索多個位置，更廣泛地搜索序列-功能關(guān)系，并且可以更深入地探索蛋白質(zhì)編碼基因上位性 (epistasis) 相互作用[21]。

2 機(jī)器學(xué)習(xí)常用算法和分子描述符

機(jī)器學(xué)習(xí)之所以能夠指導(dǎo)蛋白質(zhì)分子的設(shè)計(jì)改造，離不開其強(qiáng)大的算法與多樣的描述符。蛋白質(zhì)突變體實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，如催化活力、選擇性、穩(wěn)定性等檢測數(shù)據(jù)本質(zhì)也是標(biāo)記數(shù)據(jù)，因此非常契合機(jī)器學(xué)習(xí)中的有監(jiān)督學(xué)習(xí)范疇；另一方面，機(jī)器學(xué)習(xí)算法往往比人工創(chuàng)建的規(guī)則更精確，因?yàn)闄C(jī)器學(xué)習(xí)算法會考慮數(shù)據(jù)集中的所有數(shù)據(jù)點(diǎn)，而不會由于先驗(yàn)知識而造成任何人為偏差[23]。近年來，適用于蛋白質(zhì)序列/結(jié)構(gòu)的描述符不斷被研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)構(gòu)建，已為機(jī)器學(xué)習(xí)推動酶設(shè)計(jì)改造起到至關(guān)重要的作用。

2.1 機(jī)器學(xué)習(xí)常用算法

機(jī)器學(xué)習(xí)算法在解決蛋白質(zhì)預(yù)測等復(fù)雜問題方面顯示出巨大的潛力，雖然機(jī)器學(xué)習(xí)算法有很多種，但沒有一種算法在所有的學(xué)習(xí)任務(wù)中都是最優(yōu)的[24]。對于給定的機(jī)器學(xué)習(xí)問題，通?？梢杂?xùn)練多個計(jì)算模型。特定模型的性能取決于許多因素，如訓(xùn)練集的數(shù)量和質(zhì)量、輸入和輸出變量之間關(guān)系的復(fù)雜性，以及可用訓(xùn)練時間和內(nèi)存之類的計(jì)算約束。根據(jù)問題的不同，常常需要嘗試不同的模型和算法來找到最合適的模型和算法[7, 25]。本綜述基于功能相似性對機(jī)器學(xué)習(xí)算法進(jìn)行廣義的分類，表1列舉了機(jī)器學(xué)習(xí)常用的算法。

表1 機(jī)器學(xué)習(xí)常用算法列表

2.2 蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)中常用的分子描述符

在機(jī)器學(xué)習(xí)指導(dǎo)酶設(shè)計(jì)中，分子描述符是構(gòu)建模型的關(guān)鍵，所以構(gòu)建適用于信息豐富的蛋白質(zhì)序列的描述符至關(guān)重要。目前為止，一些基于蛋白質(zhì)序列的描述符已經(jīng)成功地應(yīng)用于蛋白質(zhì)分類和配體對接問題。除了要選擇的各種描述符外，由于實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的信噪比較低，因此從蛋白質(zhì)序列預(yù)測生物學(xué)特性也是具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)。因?yàn)閷?shí)驗(yàn)測量會涉及體外蛋白質(zhì)樣品選擇或擴(kuò)增的多個步驟，這些小批量、高通量實(shí)驗(yàn)的結(jié)果值可能顯示出較高的可變性，所以有潛力的突變體通常會得到再次確認(rèn)或大規(guī)模地跟進(jìn)。另一項(xiàng)挑戰(zhàn)是對預(yù)測結(jié)果進(jìn)行推斷，包括在現(xiàn)有數(shù)據(jù)中尚未發(fā)現(xiàn)的突變體。因此，開發(fā)出精確的預(yù)測模型至關(guān)重要，使其在給定實(shí)際數(shù)據(jù)狀態(tài)的情況下也可以表現(xiàn)良好[46]。

常用到的描述符有4種類型，包括基于氨基酸序列的描述符、基于結(jié)構(gòu)的描述符、使用嵌入式的序列描述符以及突變指示描述符，表2列舉了常用的描述符及其應(yīng)用。Frances Arnold團(tuán)隊(duì)使用高斯回歸，比較了嵌入式表示 (Embedded representations)、蛋白質(zhì)特征工程工具包 (Protein feature engineering toolkit, ProFET)、氨基酸指數(shù) (Amino acid index, AAIndex properties)、字符串核錯配 (Mismatch string kernels) 以及獨(dú)熱表示 (One-hot representation) 描述符預(yù)測了蛋白質(zhì)屬性。結(jié)果表明，使用嵌入式描述符訓(xùn)練的模型預(yù)測能力與獨(dú)熱編碼、氨基酸性質(zhì)或字符串核錯配描述符的預(yù)測能力相當(dāng)，甚至超過這些模型；蛋白質(zhì)特征工程工具包和氨基酸指數(shù)描述符的預(yù)測能力表現(xiàn)更差。所以盡管嵌入的維度數(shù)量級較低，不需要對齊、結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)或相關(guān)氨基酸性質(zhì)的選擇，因此更容易獲得，但它們?nèi)阅軌驅(qū)崿F(xiàn)準(zhǔn)確的預(yù)測[47]。

表2 機(jī)器學(xué)習(xí)指導(dǎo)酶設(shè)計(jì)中常用的分子描述符

3 機(jī)器學(xué)習(xí)指導(dǎo)酶定向進(jìn)化

機(jī)器學(xué)習(xí)通過虛擬設(shè)計(jì)和篩選來指導(dǎo)“小而精”突變體文庫或突變體的構(gòu)建，需要在各種不同定義的任務(wù)中提高計(jì)算機(jī)性能所需的算法和統(tǒng)計(jì)模型。因此，無論應(yīng)用機(jī)器學(xué)習(xí)的目標(biāo)是什么，成功與否都取決于輸入到系統(tǒng)中的數(shù)據(jù)質(zhì)量。酶定向進(jìn)化過程中產(chǎn)生了大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，是開展機(jī)器學(xué)習(xí)的理想選擇。但是，它同樣需要高質(zhì)量的數(shù)據(jù)，這也適用于理性設(shè)計(jì)[6]?？偠灾?，機(jī)器學(xué)習(xí)在加速蛋白質(zhì)定向進(jìn)化的進(jìn)程中扮演著重要的角色，可通過對擬改造關(guān)鍵位點(diǎn)的準(zhǔn)確預(yù)測減少實(shí)驗(yàn)工作量。

3.1 關(guān)鍵氨基酸殘基定位與精簡密碼子設(shè)計(jì)

關(guān)鍵氨基酸殘基定位技術(shù)是指基于蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，通過分子對接、分子動力學(xué)模擬，量子力學(xué)或機(jī)器學(xué)習(xí)等計(jì)算方法，定位與底物特異性及催化活性相關(guān)的關(guān)鍵氨基酸殘基位點(diǎn)。然后通過引入合適突變，篩選獲得高性能突變體。如Sun等[66]使用指紋圖譜分析技術(shù)PLIP (Protein-ligand interaction profiler) 分析了與底物有相互作用的氨基酸殘基位點(diǎn)，闡明了檸檬烯環(huán)氧化物水解酶LEH各個突變體與底物之間在動力學(xué)模擬過程中的原子細(xì)節(jié)問題；該團(tuán)隊(duì)使用該技術(shù)定位了塞格尼式桿菌Segniliparusrugosus來源的多結(jié)構(gòu)域羧酸還原酶SrCAR中起催化作用的兩個關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)K629及K528，揭示了其在腺苷化和硫酯化階段通過鹽橋作用穩(wěn)定過渡態(tài)中間體的作用，對該酶的催化機(jī)制有了更深入的認(rèn)識[67]；該團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步使用PLIP方法對A-domain和R-domain催化口袋氨基酸殘基進(jìn)行了相互作用圖譜分析，共定位了底物周圍17個關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)，通過突變體文庫構(gòu)建篩選獲得了催化活力提升的突變體[68]。此外，該團(tuán)隊(duì)使用分子動力學(xué)模擬技術(shù)計(jì)算了嗜熱厭氧菌Thermoanaerobacterbrockii來源的醇脫氫酶TbSADH中原子的運(yùn)動軌跡，使用各個原子運(yùn)動的自由程度RMSF (Root mean square fluctuation) 表征了蛋白質(zhì)關(guān)鍵部位的構(gòu)象變化，定位了兩個氨基酸殘基A85和I86，之后對這兩個位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)飽和突變，獲得了最優(yōu)突變體A85G/I86L，重塑了該酶的催化口袋，有效地將大體積的酮還原為具有高對映選擇性 (～ 99% ee) 的手性醇產(chǎn)物[69]。

在蛋白質(zhì)的定向進(jìn)化過程中，最基本的挑戰(zhàn)是篩選數(shù)量問題，通過精簡密碼子設(shè)計(jì)，構(gòu)建“小而精”的突變體文庫是克服這一挑戰(zhàn)的有效方法，為此，Manfred Reetz團(tuán)隊(duì)開發(fā)了CAST/ISM技術(shù)體系[70-71]。在此基礎(chǔ)上，Sun等又發(fā)展了單密碼子飽和突變SCSM[72-73]、雙密碼子飽和突變DCSM[74]、三密碼子飽和突變TCSM[75-77]，以及最近開發(fā)的理性聚焦迭代點(diǎn)突變 (Focused rational iterative site-specific mutagenesis, FRISM) 策略等[4]，可大大降低篩選工作量，快速獲得有益突變體[78]。

通過簡并密碼子設(shè)計(jì)策略來構(gòu)建“小而精”的高質(zhì)量突變體文庫，解決了定向進(jìn)化中的篩選問題，這種半理性設(shè)計(jì)的方法為加速定向進(jìn)化的進(jìn)程打下基礎(chǔ)。隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)的不斷發(fā)展，機(jī)器學(xué)習(xí)算法用于關(guān)鍵氨基酸定位和精簡密碼子設(shè)計(jì)也得到了廣泛關(guān)注，如Andreas Bommarius團(tuán)隊(duì)使用支持向量機(jī)算法成功識別定位了β-內(nèi)酰胺酶 (β-lactamase) 中與催化活性有關(guān)的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)[79]；Bruce Tidor團(tuán)隊(duì)使用LASSO算法通過預(yù)測化學(xué)特征間接識別定位了與酮酸還原異構(gòu)酶 (Ketol-acid reductoisomerase, KARI) 活性相關(guān)的氨基酸位點(diǎn)[80]；Yun Tang 團(tuán)隊(duì)使用決策樹、隨機(jī)森林、提升法 (AdaBoost, AB) 訓(xùn)練模型，定位了葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶 (UDP-glucuronosyltransferases, UGT) 催化底物代謝位點(diǎn)[81]。Mitsuo Umetsu團(tuán)隊(duì)使用高斯過程 (Gaussian processes, GP) 算法對熒光蛋白(fluorescent protein, GFP) 經(jīng)過兩輪篩選，最終得到優(yōu)異突變體[82]。Frances Arnold團(tuán)隊(duì)使用K近鄰、線性、決策樹、隨機(jī)森林 (Random forest) 等算法訓(xùn)練雙加氧酶RmaNOD (Rhodothermusmarinunitric oxide dioxygenase) 模型，使用最優(yōu)模型根據(jù)預(yù)測的適應(yīng)度對理論庫中每條序列進(jìn)行排序，僅通過兩輪共篩選805個突變體，成功獲得兩種對映體產(chǎn)物的優(yōu)勢突變體[21]。

3.2 機(jī)器學(xué)習(xí)在酶定向進(jìn)化中的應(yīng)用

通過直接從數(shù)據(jù)中建立模型，機(jī)器學(xué)習(xí)已經(jīng)被證明是一種功能強(qiáng)大、高效和多用途的工具，可應(yīng)用于各種領(lǐng)域，例如從文本和圖像中提取抽象概念，或者在最復(fù)雜的游戲中擊敗人類等[83-84]。早在1992年，機(jī)器學(xué)習(xí)算法就被用于預(yù)測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)[85]。此后，出現(xiàn)了新的機(jī)器學(xué)習(xí)版本，用于預(yù)測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、折疊、結(jié)合甚至催化活性，目的是處理有關(guān)突變體及其特性的累積信息[86]?！按髷?shù)據(jù)”作為這些算法的訓(xùn)練集，以便用于預(yù)測新的和改進(jìn)的突變體，從而有助于在特定位點(diǎn)上發(fā)生誘變，從而加速蛋白質(zhì)的定向進(jìn)化[87]。機(jī)器學(xué)習(xí)已然成為從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中學(xué)習(xí)并指導(dǎo)蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)的有利工具[88]。表3列舉了近5年來機(jī)器學(xué)習(xí)指導(dǎo)蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)的應(yīng)用實(shí)例，涉及蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性、催化活性、對映體選擇性、光敏性及可溶性等多個方面。其中針對常用的3種應(yīng)用方法，如ASRA[89]、Innov′SAR[90]算法和ProSAR策略[91-92]展開深入闡述。

圖4 ASRA應(yīng)用于CAST/ISM酶立體選擇性定向進(jìn)化的流程圖[89]

ASRA (Adaptive substituent reordering algorithm) 算法與傳統(tǒng)的定量結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系 (Quantitative structure-activity relationships，QSAR) 方法不同，它不需要任何蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息，其運(yùn)算取決于識別蛋白質(zhì)性質(zhì)信息的基本呈現(xiàn)規(guī)律，從而使其能夠在結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系不清楚的情況下進(jìn)行預(yù)測。ASRA可替代傳統(tǒng)的QSAR方法從目標(biāo)突變體文庫中經(jīng)過最小樣本量的篩選，識別出具有所需特性的潛在蛋白質(zhì)突變體。Herschel Rabitz教授與Manfred Reetz教授合作，將ASRA與CAST/ISM方法結(jié)合起來使用，加速了黑曲霉Aspergillusniger來源的環(huán)氧化物水解酶ANEH的對映選擇性進(jìn)化[89]，其策略流程如圖4所示。

表3 近5年機(jī)器學(xué)習(xí)指導(dǎo)蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)的部分應(yīng)用實(shí)例

圖5 Innov′SAR算法技術(shù)流程圖[90]

Innov′SAR (Innovative sequence-activity relationship) 算法是一種創(chuàng)新的序列-活性關(guān)系方法，基于快速傅里葉變換 (Fast fourier transform, FFT) 等數(shù)字信號處理方法，將濕實(shí)驗(yàn)和蛋白質(zhì)計(jì)算設(shè)計(jì)相結(jié)合。為了尋找所需的酶特性，建立了一個預(yù)測模型，在這種情況下，對映選擇性是通過選擇性因子E測得的，Innov′SAR算法的流程如圖5所示。Bernard Offmann教授和Manfred Reetz教授合作，應(yīng)用Innov′SAR算法尋找黑曲霉Aspergillusniger來源的環(huán)氧化物水解酶ANEH高度對映選擇性突變體時，只需要序列信息和少量突變體實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，經(jīng)過 (i) 編碼階段， (ii) 建模階段和 (iii) 預(yù)測階段，最后基于9個單點(diǎn)突變的組合 (29)，預(yù)測了512個突變體的對映選擇性，并對候選基因進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，獲得了對映選擇性較高的突變體。這種機(jī)器學(xué)習(xí)方法考慮了蛋白質(zhì)序列中氨基酸之間的相互作用，而且速度非常快，為蛋白質(zhì)進(jìn)化和篩選提供了新的技術(shù)手段[6, 90]。

除了ASRA和Innov′SAR，蛋白質(zhì)序列-活性相關(guān)性進(jìn)化策略ProSAR (Protein sequence activity relationship)，是一種將統(tǒng)計(jì)學(xué)方法與定向進(jìn)化相結(jié)合的技術(shù)，這項(xiàng)技術(shù)受到小分子藥物設(shè)計(jì)方法定量構(gòu)效關(guān)系QSAR和其他機(jī)器學(xué)習(xí)應(yīng)用方法的啟發(fā)，用于預(yù)測蛋白質(zhì)組合文庫中的突變對目標(biāo)功能或特性的影響[92]。ProSAR驅(qū)動的酶進(jìn)化可以分為以下幾步：a) 通過在DNA親本模板上引入隨機(jī)突變構(gòu)建酶的組合文庫；b) 對功能多樣性突變體的子集進(jìn)行排序，并對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和虛擬篩選；c) 分析各種突變體的影響，并將它們分為有益 (綠色)、有害 (紅色) 或中性 (白色)；d) 從上一輪中選擇活性高的突變體作為下一輪文庫設(shè)計(jì)的親本模板；e) 有益的突變通過半合成DNA混組帶到下一輪，并摒棄有害突變體；f) 隨著對突變?nèi)后w的篩選，獲得新的多樣性突變體。循環(huán)往復(fù)多輪，直至篩選到符合需求的突變體為止，具體流程如圖6所示[92]。

圖6 ProSAR驅(qū)動的酶進(jìn)化流程圖[92]

4 結(jié)語及展望

酶設(shè)計(jì)改造從酶定向進(jìn)化、半理性設(shè)計(jì)、理性設(shè)計(jì)再到如今的機(jī)器學(xué)習(xí)，經(jīng)歷了輝煌發(fā)展的30年。期間從Frances Arnold提出的酶定向進(jìn)化第一定律“You get what you screened” (所篩即所得)，到Manfred Reetz提出的第二定律“You get what you designed” (設(shè)計(jì)即所得)[4]，但兩者皆是基于突變體文庫構(gòu)建、設(shè)計(jì)和篩選而展開。如今，隨著計(jì)算技術(shù)的不斷進(jìn)步，本文筆者提出第三定律“Design the right amino acids at the right positions” (正確位點(diǎn)引入正確突變，即精準(zhǔn)設(shè)計(jì))，旨在摒棄文庫設(shè)計(jì)和篩選過程，而實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)設(shè)計(jì)，直接輸出單個或少數(shù)幾個最優(yōu)突變體正逐漸成為可能。

迄今為止，數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)有數(shù)百萬個蛋白質(zhì)序列，數(shù)十萬個蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，數(shù)千個生物物理值以及數(shù)百個帶注釋的催化機(jī)制，為訓(xùn)練基于機(jī)器學(xué)習(xí)的預(yù)測因子提供了切實(shí)可行的方法。但是，機(jī)器學(xué)習(xí)在生物催化劑設(shè)計(jì)中的潛力尚未被充分發(fā)掘，仍然面臨諸多挑戰(zhàn)。如缺乏用于訓(xùn)練模型和測試模型的高質(zhì)量統(tǒng)一的訓(xùn)練集和測試集、經(jīng)典數(shù)據(jù)的不平衡和偏差、現(xiàn)有方法針對性較差等問題。然而，隨著需求的增長和越來越多的科學(xué)團(tuán)隊(duì)在酶定向進(jìn)化這個令人興奮的領(lǐng)域開展深入研究，這些問題將會逐一得到解決?？煽康臋C(jī)器學(xué)習(xí)工具將為酶定向進(jìn)化提供最佳的起點(diǎn)，還將為衍生模型、參數(shù)及其潛在的分子機(jī)理解析創(chuàng)造更多的研究手段，加速對酶的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系的深入認(rèn)識[22]。機(jī)器學(xué)習(xí)將為蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)改造提供強(qiáng)有力的工具，并助力酶定向進(jìn)化在高性能催化劑設(shè)計(jì)上走向新的高度。