膜修飾傳感器檢測(cè)扒雞煮制老湯中鮮味氨基酸的樣品處理

薄存美，劉登勇,2*，王笑丹，張慶永

1(渤海大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心,遼寧 錦州， 121013)2(江蘇省肉類生產(chǎn)與加工質(zhì)量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京， 210095)3(吉林大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春， 130062) 4(山東德州扒雞股份有限公司，山東 德州， 253003)

醬鹵肉制品是指將鮮(凍)畜禽肉放入含有食鹽、醬油以及香辛料的水中，經(jīng)調(diào)味、煮制等工藝加工而成的一類熟肉類制品[1]，代表性產(chǎn)品主要有燒雞[2]、醬牛肉[3-4]、鹽水鴨[5]、醬豬蹄、醬豬肘[6]以及紅燒肉[7]等，因其鮮香馥郁、鮮美可口的特點(diǎn)而深受消費(fèi)者喜歡。醬鹵肉制品老湯對(duì)產(chǎn)品滋味影響重大，是決定醬鹵肉制品品質(zhì)的重要因素[8]。

老湯在連續(xù)煮制過(guò)程中會(huì)不斷累積可溶性滋味物質(zhì)，其中咸味和鮮味是老湯對(duì)產(chǎn)品最主要的滋味貢獻(xiàn)，因此實(shí)現(xiàn)咸味和鮮味物質(zhì)含量的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)對(duì)產(chǎn)品的標(biāo)準(zhǔn)化與穩(wěn)定性至關(guān)重要。咸味大多使用硝酸鹽滴定法進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)[9]；鮮味主要來(lái)源于老湯煮制過(guò)程的肉類降解產(chǎn)物，包括多肽類、核苷酸類、氨基酸類、有機(jī)酸等[10]，其中鮮味氨基酸和鮮味核苷酸是老湯中最具代表性的兩類鮮味成分，包括谷氨酸、天冬氨酸、5′-肌苷酸和5′-鳥苷酸[11-13]等，鮮味氨基酸大多通過(guò)氨基酸分析儀[14]、液相色譜法[15]、毛細(xì)管電泳法[16]和氣相色譜法[17]等常規(guī)方法檢測(cè)，存在設(shè)備成本高、樣品前處理復(fù)雜、定性能力差等問(wèn)題。目前電化學(xué)傳感器檢測(cè)逐漸成為新的研究趨勢(shì)，利用物質(zhì)在溶液中的反應(yīng)引起一系列電化學(xué)反應(yīng)的性質(zhì)，通過(guò)反應(yīng)所產(chǎn)生的電勢(shì)差實(shí)現(xiàn)物質(zhì)的檢測(cè)，具有安全、靈敏度高、穩(wěn)定性和可選擇性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[18-19]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，N，N′-二苯基硫脲(N,N′-diphenyl thiourea,DPTU)可作為鮮味敏感物質(zhì)應(yīng)用于電化學(xué)傳感器特異性檢測(cè)鮮味氨基酸[20]，但尚未就其在實(shí)際樣品的標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)應(yīng)用方面開(kāi)展系統(tǒng)研究。實(shí)現(xiàn)老湯鮮味氨基酸電化學(xué)快速、準(zhǔn)確檢測(cè)，必須滿足樣品檢測(cè)參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化的要求，一套合適且固定的樣品檢測(cè)參數(shù)不僅有利于提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，而且可以提高其檢測(cè)效率。老湯成分復(fù)雜，過(guò)多的干擾物質(zhì)會(huì)影響結(jié)果的準(zhǔn)確性，離心是去除測(cè)定干擾的有效方法，且老湯中鮮味氨基酸含量較高，實(shí)際檢測(cè)樣品中鮮味氨基酸含量超過(guò)傳感器的檢測(cè)最高限，因此需要通過(guò)稀釋以達(dá)到DPTU膜修飾傳感器的檢測(cè)限度?；诖?，本文以扒雞煮制老湯為研究對(duì)象，并以液相色譜檢測(cè)結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，研究適于N，N′-二苯基硫脲膜修飾傳感器快速、準(zhǔn)確檢測(cè)鮮味氨基酸含量的樣品前處理方式。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

材料：扒雞老湯，由山東德州扒雞股份有限公司提供。

試劑：異硫氰酸苯酯(phenyl isothiocyanate,PITC)、三乙胺、無(wú)水乙酸鈉、正己烷、冰乙酸、濃H2SO4、H2O2、正己烷、四氫呋喃、鄰苯二甲酸二辛酯、聚氯乙烯、DPTU為國(guó)產(chǎn)分析純，阿拉丁試劑(上海)有限公司；谷氨酸、天冬氨酸為標(biāo)準(zhǔn)品(純度>99%)，北京索萊寶科技有限公司；乙腈、甲醇為色譜純，美國(guó)Sigma公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

CHI660E電化學(xué)工作站，北京壯仕科技有限公司；LC-20AT高效液相色譜儀，日本島津儀器公司；Allegra 64R冷凍離心機(jī)，美國(guó)Beckman公司；AL104電子天平，瑞士Mettler Toledo公司；鉑盤電極、鉑絲電極、232型飽和甘汞電極，上海楚兮實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 液相色譜檢測(cè)

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配置：準(zhǔn)確稱取谷氨酸、天冬氨酸各10.00 mg，用去離子水定容至10 mL的容量瓶中，超聲至完全溶解，得(1+1)mg/mL的谷氨酸-天冬氨酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，4 ℃保存。用去離子水稀釋成質(zhì)量濃度為12.5、25、50、100、150、200、250 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)系列梯度溶液。

老湯樣品前處理方法：扒雞老湯(除去浮于表層的油脂)→過(guò)濾(除去香辛料碎渣、肉末等大塊固形物)→離心→取2 mL上清液→定容至10 mL。

衍生：參照芮鴻飛等[21]的方法并稍作修改。取500 μL上述稀釋后的老湯樣品，置于4 mL的塑料試管中，再分別加入異硫氰酸苯酯-乙腈溶液、三乙胺-乙腈溶液各250 μL，將其充分混勻后在室溫下放置30 min，加入50 μL的乙酸溶液充分混勻，隨后向衍生完畢的溶液中加入1 mL的正己烷溶液，用漩渦振蕩儀振蕩60 s，萃取掉剩余的衍生試劑后，靜置10 min分層，棄去上層正己烷溶液，用5 mL的注射器吸取出下層清液，經(jīng)0.45 μm的有機(jī)濾膜過(guò)濾打入2 mL的液相色譜頂空瓶?jī)?nèi)，用于液相色譜儀的檢測(cè)。

色譜條件：色譜柱Agilent ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)； 柱溫40 ℃； 檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；流速1 mL/min； 流動(dòng)相A為乙酸鈉溶液，流動(dòng)相B為80%乙腈溶液；流動(dòng)相洗脫程序：0 min，A 92%；B 8%；2 min，A 92%；B 8%；10 min，A 90%；B 10%。

1.2.2 電極預(yù)處理

電極預(yù)處理參考朱靈濤[20]的方法。鉑盤電極預(yù)處理時(shí)，首先用5 000目砂紙打磨電極，直至表面光滑，用去離子水清洗干凈表面，自然晾干，隨后在拋光絨布上依次用300、50和10 nm的Al2O3拋光粉對(duì)鉑盤表面進(jìn)行拋光，拋光結(jié)束后，將鉑盤電極浸泡于Piranha溶液中[V(濃H2SO4)∶V(30% H2O2)=3∶1]，超聲清洗5 min，隨后放入去離子水中再超聲清洗5 min，電極清洗完畢后，自然晾干，避光無(wú)塵保存?zhèn)溆谩ｏ柡透使姌O無(wú)需過(guò)多的預(yù)處理，但新購(gòu)買的飽和甘汞電極在試驗(yàn)前需要先確定電極內(nèi)是否充滿飽和KCl溶液，并有少許飽和KCl晶體存在，否則需要重新選擇飽和甘汞電極。鉑絲電極在試驗(yàn)前的預(yù)處理流程與鉑盤電極類似，需要事先將鉑絲電極分別浸泡于Piranha溶液及去離子水中超聲清洗5 min后備用，目的是除去鉑絲表面的雜質(zhì)。由鉑盤電極、鉑絲電極和飽和甘汞電極構(gòu)建三電極體系，并進(jìn)行后續(xù)的電化學(xué)試驗(yàn)。

1.2.3 膜修飾傳感器的制備

參照朱靈濤[20]的方法并稍作修改，含有鮮味氨基酸敏感物質(zhì)的膜溶液組成為：四氫呋喃5 mL，鄰苯二甲酸二辛酯0.50 mL，聚氯乙烯0.08 g，DPTU 0.095 g。采用直接滴涂法，用移液槍準(zhǔn)確吸取10 μL膜溶液滴涂于鉑盤電極表面，自然晾干后備用。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取谷氨酸、天冬氨酸各14.70、13.30 mg，用去離子水分別定容至100 mL，超聲至完全溶解，得到1 mmol/L的谷氨酸和天冬氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，4 ℃保存。

1.2.5 電化學(xué)傳感器檢測(cè)流程

扒雞老湯(除去浮于表層的油脂)→過(guò)濾(除去香辛料碎渣、肉末等大塊固形物)→取20 mL，離心→取5 mL上清液→定容至100 mL→攪拌(磁力攪拌，1 h)→電化學(xué)檢測(cè)

本試驗(yàn)采用開(kāi)路電位法進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)，參數(shù)設(shè)置為穩(wěn)定時(shí)間：60 s；檢測(cè)時(shí)間：60 s；檢測(cè)間隔：0.1 s；高電位：+1.0 V，低電位：-1.0 V。

1.2.6 離心力對(duì)傳感器檢測(cè)結(jié)果的影響

離心力分別定為8 000、10 000、11 000、12 000、13 000、14 000、16 000×g，每組老湯樣品設(shè)置3個(gè)平行。其他試驗(yàn)參數(shù)分別為離心時(shí)間20 min；稀釋倍數(shù)為20；攪拌時(shí)間1 h；分析樣本20 mL。

1.2.7 離心時(shí)間對(duì)傳感器檢測(cè)結(jié)果的影響

本試驗(yàn)中離心時(shí)間分別為10、15、20、25、30 min，每組老湯樣品設(shè)置3個(gè)平行試驗(yàn)。其他試驗(yàn)參數(shù)分別為離心力13 000×g；稀釋倍數(shù)為20；攪拌時(shí)間1 h；分析樣本20 mL。

1.2.8 樣品稀釋倍數(shù)對(duì)傳感器檢測(cè)結(jié)果的影響

用去離子水對(duì)老湯分別進(jìn)行10、15、20、25、30倍稀釋后檢測(cè)，其他試驗(yàn)參數(shù)分別為離心時(shí)間20 min；離心力13 000×g；攪拌時(shí)間1 h；分析樣本20 mL，試驗(yàn)中結(jié)果的對(duì)比數(shù)據(jù)為檢測(cè)相對(duì)應(yīng)的同一條件下處理的樣品。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本試驗(yàn)采用SPSS 19.0 軟件中的單因素方差分析(One-Way ANOVA)法對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行處理，顯著性水平為 0.05，每個(gè)試驗(yàn)指標(biāo)至少重復(fù)測(cè)定3次，傳感器檢測(cè)試驗(yàn)結(jié)果采用測(cè)定數(shù)據(jù)與液相色譜檢測(cè)結(jié)果之間比較其偏差程度(%)。作圖采用Origin 2017軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 采用液相色譜儀檢測(cè)鮮味氨基酸時(shí)標(biāo)準(zhǔn)溶液的線性關(guān)系

將7個(gè)不同質(zhì)量濃度梯度 (12.5、25、50、100、150、200、250 μg/mL) 的混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)行檢測(cè),用各個(gè)氨基酸液相分析對(duì)應(yīng)的峰面積對(duì)其相應(yīng)的質(zhì)量濃度 (單位μg/L) 進(jìn)行回歸分析(圖1)。

a-谷氨酸;b-天冬氨酸圖1 液相色譜檢測(cè)谷氨酸、天冬氨酸的濃度-峰面積線性回歸圖Fig.1 Linear regression plot of concentration-peak area forglutamic acid and aspartic acid detected by liquidchromatography

結(jié)果表明，天冬氨酸和谷氨酸均在12.5～250 μg/mL的濃度范圍內(nèi)具有較好的線性關(guān)系，其濃度與峰面積的線性關(guān)系分別為Y1=37 914X1-371 973、Y2=11 126X2-138 346，相關(guān)系數(shù)R2分別為0.994 0、0.993 7。

2.2 液相色譜儀對(duì)扒雞老湯鮮味氨基酸的檢測(cè)結(jié)果

2種鮮味氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)的高效液相色譜檢測(cè)結(jié)果顯示：老湯中鮮味氨基酸總含量為699.48 μg/mL(5.12 mmol/L)，含量的RSD在5.0%以內(nèi)，表明該方法重復(fù)性良好，所建立的分析方法穩(wěn)定，可用于后續(xù)的試驗(yàn)。王南[22]采用氨基酸分析儀對(duì)老湯中的鮮味氨基酸進(jìn)行檢測(cè)，含量為70.30 mg/100 g(約為4.72 mmol/L)，檢測(cè)結(jié)果波動(dòng)變化，但差異較小，差異的原因一方面取決于其原料肉中氨基酸形成和降解的比率，另一方面也取決于濃度差的作用，導(dǎo)致肉湯間的相互滲透存在差異[23]。

2.3 傳感器響應(yīng)信號(hào)分析

采用開(kāi)路電位法對(duì)傳感器的響應(yīng)信號(hào)進(jìn)行分析，傳感器在氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液(以10-3mol/L的谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)品為例)和老湯稀釋液(以老湯稀釋1∶10倍為例)中的響應(yīng)信號(hào)圖如圖2所示。

a-氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液;b-老湯稀釋液圖2 DPTU膜修飾傳感器的響應(yīng)信號(hào)圖Fig.2 Response signal of DPTU film modified sensors

0～10 s內(nèi)DPTU膜修飾傳感器的響應(yīng)信號(hào)急劇變化，電化學(xué)信號(hào)不穩(wěn)定，易受外界條件影響而產(chǎn)生波動(dòng)；10.1～60 s內(nèi)電化學(xué)信號(hào)強(qiáng)度已趨于穩(wěn)定，60.1～120 s電化學(xué)信號(hào)基本無(wú)變化。因此，為了避免儀器、環(huán)境以及人為操作等的干擾,以及提高試驗(yàn)效率，本試驗(yàn)縮短檢測(cè)時(shí)間為60 s，并提取10.1～60 s的平均值作為一次電化學(xué)傳感器檢測(cè)信號(hào)值，單位為V進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2.4 傳感器檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍的確定及線性擬合

如圖3所示，谷氨酸和天冬氨酸均可配置成濃度較低的溶液，通過(guò)對(duì)-7.5～-3 lg(mol/L)的10個(gè)濃度梯度的鮮味氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行傳感器檢測(cè)，確定鮮味氨基酸在-6～-3 lg(mol/L)的范圍內(nèi)線性良好。在10-6～10-3mol/L濃度范圍內(nèi)對(duì)鮮味氨基酸的濃度梯度與電化學(xué)檢測(cè)電信號(hào)的關(guān)系進(jìn)行曲線擬合，擬合后的函數(shù)關(guān)系如公式(1)所示：

Ocp混合=0.049 81 lgc+0.271 6

(1)

式中:Ocp,開(kāi)路電位法電位值,V;lgc,鮮味氨基酸濃度對(duì)數(shù),mol/L。

圖3 膜修飾傳感器在不同濃度鮮味氨基酸溶液的電位值變化關(guān)系圖Fig.3 Variation of potential value of film modified sensors atdifferent concentrations of umami amino acid solution

2.5 離心力對(duì)傳感器檢測(cè)扒雞老湯中鮮味氨基酸濃度的影響

圖4顯示，離心力在8 000～12 000×g，鮮味氨基酸的傳感器檢測(cè)值呈緩慢增加的趨勢(shì)，繼續(xù)增加離心力，傳感器檢測(cè)結(jié)果基本保持不變，原因可能是膜修飾鉑盤電極的電催化氧化過(guò)程存在干擾物的毒化特性[24-25]。當(dāng)離心力過(guò)小時(shí)，老湯樣品中殘留的干擾物質(zhì)無(wú)法去除，造成電極的毒化，從而對(duì)試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生干擾；隨著離心力的增加，脂肪以及小分子蛋白質(zhì)等干擾物質(zhì)逐漸被離心沉淀，毒化作用減弱，從而使鮮味氨基酸的檢測(cè)值與實(shí)際值接近。與液相色譜儀檢測(cè)結(jié)果相比，當(dāng)離心力為8 000、10 000、11 000、12 000、13 000、14 000、16 000×g時(shí)，傳感器檢測(cè)結(jié)果的偏離程度分別為11.79%、8.01%、7.42%、5.27%、3.13%、7.2%和6.25%。當(dāng)離心力為13 000×g時(shí)，傳感器檢測(cè)結(jié)果的偏離程度最低，與液相色譜儀檢測(cè)結(jié)果最接近，因此選擇13 000×g為最佳離心力條件。

圖4 不同離心力條件下DPTU膜修飾傳感器檢測(cè)鮮味氨基酸濃度Fig.4 DPTU film modified sensors for detecting umami aminoacid content under different centrifugation force注：不同小寫字母表示差異顯著(下同)

2.6 離心時(shí)間對(duì)傳感器檢測(cè)扒雞老湯中鮮味氨基酸濃度的影響

從圖5可知，離心時(shí)間在10～15 min，鮮味氨基酸的傳感器檢測(cè)值呈緩慢增加的趨勢(shì)，繼續(xù)增加離心時(shí)間，傳感器檢測(cè)結(jié)果基本保持不變。原因可能是當(dāng)離心時(shí)間過(guò)短時(shí)，老湯樣品中的小分子蛋白質(zhì)等可能與鮮味氨基酸緊密結(jié)合，從而對(duì)DPTU吸附鮮味氨基酸的反應(yīng)形成競(jìng)爭(zhēng)，導(dǎo)致鮮味氨基酸無(wú)法完全與DPTU結(jié)合，隨著離心時(shí)間的增加，干擾成分已基本去除，從而使鮮味氨基酸的檢測(cè)值與實(shí)際值相近；另一個(gè)原因可能是溶液中的鮮味氨基酸未完全解離，未解離形式的氨基酸由于不能將與DPTU結(jié)合的作用位點(diǎn)暴露[26]，從而導(dǎo)致傳感器信號(hào)的偏移。離心時(shí)間在10～30 min時(shí)，傳感器測(cè)定數(shù)據(jù)與液相色譜檢測(cè)結(jié)果之間的偏差程度分別為14.65%、6.64%、2.75%、5.86%和8.98%，在20 min時(shí)，傳感器檢測(cè)結(jié)果的偏離程度最低，與液相色譜儀檢測(cè)結(jié)果最接近，因此選擇20 min為離心時(shí)間。

圖5 不同離心時(shí)間條件下DPTU膜修飾傳感器檢測(cè)鮮味氨基酸濃度Fig.5 DPTU film modified sensors for detecting umami aminoacid content under different centrifugation time

2.7 老湯稀釋倍數(shù)對(duì)傳感器檢測(cè)扒雞老湯中鮮味氨基酸濃度的影響

溶于老湯體系中的鮮味氨基酸在溶液中發(fā)生解離，暴露出與鮮味敏感物質(zhì)DPTU結(jié)合的作用位點(diǎn)[20]。在一定的檢測(cè)范圍內(nèi)，浸出液中呈味物質(zhì)濃度[27]和離子活度的差異[28-29]會(huì)直接影響傳感器的響應(yīng)信號(hào)。由圖6可知，稀釋倍數(shù)為10～20倍時(shí)，檢測(cè)結(jié)果的差異不顯著(P>0.05)，隨著稀釋倍數(shù)的增加差異顯著增加(P<0.05)，不同稀釋倍數(shù)條件下檢測(cè)結(jié)果的偏離程度分別為7.29%、3.78%、3.03%、12.19%和19.96%。原因可能是不同稀釋倍數(shù)條件下鮮味氨基酸的離子活度存在差異，稀釋倍數(shù)越高，檢測(cè)結(jié)果的偏離程度越高，稀釋倍數(shù)越低，檢測(cè)結(jié)果越接近液相色譜檢測(cè)結(jié)果。隨著老湯逐漸稀釋，老湯中濃度較高的更多的干擾物質(zhì)逐漸被稀釋，達(dá)到傳感器檢測(cè)的濃度范圍，引起電化學(xué)信號(hào)的偏移，從而使鮮味氨基酸含量的檢測(cè)結(jié)果發(fā)生偏移。楊昌偉等[30]選用Roche E601電化學(xué)發(fā)光法研究了2、4、8、16、32不同稀釋倍數(shù)對(duì)β-HCG檢測(cè)結(jié)果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，稀釋倍數(shù)越高，檢測(cè)的準(zhǔn)確率越低，而一次性檢出率越高，說(shuō)明隨著稀釋倍數(shù)的增加，產(chǎn)生的誤差增大，準(zhǔn)確率越低。當(dāng)稀釋倍數(shù)為20倍時(shí)，傳感器檢測(cè)結(jié)果的偏離程度最低，結(jié)果最準(zhǔn)確，因此試驗(yàn)確定最佳稀釋倍數(shù)為20倍。

圖6 不同老湯稀釋倍數(shù)條件下DPTU膜修飾傳感器檢測(cè)鮮味氨基酸濃度Fig.6 DPTU film modified sensors for detecting umami aminoacid content under different dilution ratio of brine

3 結(jié)論

本研究探討了N，N′-二苯基硫脲膜修飾傳感器檢測(cè)扒雞煮制老湯的最佳樣品前處理方式，當(dāng)離心力為13 000×g、離心時(shí)間為20 min及老湯稀釋倍數(shù)為20倍時(shí)，N，N′-二苯基硫脲膜修飾的傳感器檢測(cè)鮮味氨基酸含量的結(jié)果最為準(zhǔn)確。利用N，N′-二苯基硫脲膜修飾的傳感器檢測(cè)醬鹵老湯中鮮味氨基酸含量的方法是可行的，且比常規(guī)檢測(cè)方法更為簡(jiǎn)便易行、快速、節(jié)約成本，可以用于生產(chǎn)實(shí)際。