馬鈴薯組培苗內(nèi)生菌治理方法研究

張秋萍 黃醒師 貢 劍 鄒玉興 居玉玲

（1江陰市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，江蘇省無(wú)錫市 214405；2江陰沃土農(nóng)業(yè)生物科技開(kāi)發(fā)有限公司，江蘇省無(wú)錫市 214415；3江陰市種子管理站，江蘇省無(wú)錫市 214400）

目前，我國(guó)馬鈴薯種植面積達(dá)5×106hm2以上，對(duì)脫毒種薯的需求非常大，脫毒微型種薯（即原原種）也因此成為保證馬鈴薯高產(chǎn)的基礎(chǔ)。雖然國(guó)內(nèi)規(guī)?；a(chǎn)馬鈴薯組培苗繼而生產(chǎn)馬鈴薯原原種的企業(yè)相當(dāng)普遍，但在馬鈴薯組培苗規(guī)?；a(chǎn)中，組培苗易受內(nèi)生菌感染的問(wèn)題一直困擾著眾多的生產(chǎn)者和研究者，若對(duì)內(nèi)生菌處置不當(dāng)，不僅會(huì)影響馬鈴薯組培苗的質(zhì)量和數(shù)量，還會(huì)直接影響馬鈴薯組培苗的生產(chǎn)計(jì)劃安排，進(jìn)而造成生產(chǎn)單位人、財(cái)、物的極大浪費(fèi)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，馬鈴薯組培苗內(nèi)生菌的殺菌方法基本上是在培養(yǎng)基中添加殺菌劑，但絕大部分殺菌劑處理的時(shí)效有限，且對(duì)后續(xù)組培苗的繼代繁殖也有一定影響。鑒于此，筆者擬進(jìn)行馬鈴薯組培苗內(nèi)生菌治理方法試驗(yàn)研究，以期找到有效根除馬鈴薯組培苗內(nèi)生菌的方法。

1 材料與方法

1.1 菌源判斷

馬鈴薯組培苗內(nèi)生菌分離培養(yǎng)后，經(jīng)南京理工大學(xué)環(huán)境與生物工程學(xué)院進(jìn)行鑒別，其分類地位可能為革蘭氏陰性菌寡養(yǎng)單胞菌屬Stenotro phomonassp.（包括有8個(gè)種，侵染馬鈴薯組培苗的內(nèi)生菌是其中的一種）。其廣泛存在于土壤、塵土、淡水、湖泥、植物根系、農(nóng)副產(chǎn)品、人和動(dòng)物的體表及消化道中，最適生長(zhǎng)溫度為35 ℃，在4 ℃條件下不生長(zhǎng)，近半數(shù)菌株在42 ℃時(shí)生長(zhǎng)，為專性需氧菌，對(duì)營(yíng)養(yǎng)的要求不高，在普通瓊脂平板上即可生長(zhǎng)良好。

1.2 品種、試劑與器具

供試馬鈴薯品種為“費(fèi)烏瑞它”（Favorita）。試驗(yàn)試劑為0.1%升汞（HgCl2）和10%次氯酸鈉（NaClO）。培養(yǎng)器皿為瓶底直徑6 cm、瓶高9 cm、沒(méi)有瓶肩的直口瓶，容積為250 mL，每個(gè)培養(yǎng)瓶接種16株苗，瓶蓋采用封口膜和硫酸紙棉繩綁扎封口；其他器具包括若干個(gè)小燒杯（每個(gè)處理配備1個(gè)燒杯，用于升汞處理）、存放廢棄水的大燒杯、剪子、鑷子、剝離專用針、手術(shù)刀、無(wú)菌水（用三角瓶裝純凈水，不能太滿，占容器的1/3，滅菌后備用，pH不超過(guò)7，EC值在20以下）、濾紙（裝入培養(yǎng)皿內(nèi)）、培養(yǎng)皿、器械手術(shù)刀和專用工具。燒杯均用牛皮紙或報(bào)紙包好，放入高壓滅菌鍋內(nèi)滅菌，所有器具均提前滅菌，在操作前送往超凈工作臺(tái)。

1.3 供試材料選擇試驗(yàn)

將感染內(nèi)生菌的馬鈴薯組培苗植株，分上、中、下部三段莖段剪下，其中，最上面的部位是2葉1心帶生長(zhǎng)點(diǎn)的莖段；中間部位是剪去生長(zhǎng)點(diǎn)后，下面帶1片葉的中間莖段；下面部位是靠近根部上方帶1片葉的莖段。上述莖段分別扦插在MS培養(yǎng)基上（培養(yǎng)基在高壓121 ℃條件下滅菌18～19 min，緩沖間冷卻后，送至無(wú)菌室），每個(gè)部位轉(zhuǎn)接30瓶，生長(zhǎng)8 d后，觀察內(nèi)生菌的分布情況。

1.4 內(nèi)生菌處理試驗(yàn)

在1.3觀察的基礎(chǔ)上，選取感染內(nèi)生菌最輕的莖段（2葉1心帶生長(zhǎng)點(diǎn)）作供試材料，分別用0.1%升汞和10%次氯酸鈉浸泡處理，共設(shè)4個(gè)不同時(shí)間段：（1）100 s、（2）110 s、（3）120 s、（4）140 s，另設(shè)一個(gè)不做任何處理的對(duì)照（CK）。每處理均接種30瓶。

試劑處理時(shí)，將剪下的莖段浸泡在試劑內(nèi)，并不斷晃動(dòng)，使試劑作用到莖段的每個(gè)部位，再用無(wú)菌水清洗4～5次，將莖段放在經(jīng)高壓滅菌過(guò)的濾紙上吸干水（濾紙?jiān)谑褂们埃描囎訆A住，在酒精燈上轉(zhuǎn)圈烤一下，以充分吸走外植體上的水分，降低污染率），然后插在滅菌過(guò)的培養(yǎng)基上，送至培養(yǎng)室培養(yǎng)，8 d后觀察殺菌效果及各處理對(duì)組培苗生長(zhǎng)的影響（鑒于殺滅內(nèi)生菌的化學(xué)試劑對(duì)組培苗正常細(xì)胞也有損傷，故需觀察統(tǒng)計(jì)組培苗葉片上的枯斑點(diǎn)）。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試材料選擇

由表1可知，馬鈴薯組培苗植株三個(gè)部位均感染內(nèi)生菌，故內(nèi)生菌隨著植物細(xì)胞共同生長(zhǎng)。組培苗不同部位的莖段均會(huì)感染內(nèi)生菌，僅是菌落大小有所差異，其中以含2葉1心生長(zhǎng)點(diǎn)的莖段感染內(nèi)生菌的程度最輕。

表1 組培苗不同部位的莖段上內(nèi)生菌分布情況

2.2 內(nèi)生菌處理

由表2可知，對(duì)照無(wú)干凈瓶苗，處理（1）的干凈瓶苗率為87%，其余3個(gè)處理的干凈瓶菌率均為100%，但處理（3）、（4）的組培苗葉片有損傷，故以處理（2）為最佳處理時(shí)間。由表3可知，4個(gè)處理和對(duì)照均無(wú)干凈瓶苗，且4個(gè)處理的組培苗葉片均有不同程度的損傷，表明10%次氯酸鈉的殺菌效果遠(yuǎn)遜于0.1%升汞。在實(shí)際的馬鈴薯規(guī)模化生產(chǎn)中，為殺滅內(nèi)生菌，宜采用0.1%升汞處理馬鈴薯組培苗110 s。

表2 0.1%升汞的殺菌效果和對(duì)組培苗生長(zhǎng)的影響

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié) 論

試驗(yàn)結(jié)果表明，含2葉1心生長(zhǎng)點(diǎn)的莖段，是整個(gè)馬鈴薯植株感染內(nèi)生菌程度最輕的部位，也是治理馬鈴薯組培苗內(nèi)生菌最合適的切入點(diǎn)；同時(shí)，既能殺死內(nèi)生菌、又對(duì)馬鈴薯組培苗沒(méi)有損害的最佳藥劑為0.1%升汞，最佳處理時(shí)間為110 s；10%次氯酸鈉的殺菌效果不夠理想，且對(duì)植株有傷害。

表3 10%次氯酸鈉的殺菌效果和對(duì)組培苗生長(zhǎng)的影響

3.2 討 論

通過(guò)對(duì)2004年以來(lái)有關(guān)文獻(xiàn)的搜索，以及筆者自身多年的試驗(yàn)摸索，一直沒(méi)有發(fā)現(xiàn)徹底根除馬鈴薯組培苗內(nèi)生菌的有效方法，且一般在莖尖剝離中，通常用0.1%升汞對(duì)外植體進(jìn)行滅菌，而直接用于組培苗莖段滅菌的尚未見(jiàn)有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)。本試驗(yàn)用0.1%升汞處理組培苗上部莖段110 s，能起到根除馬鈴薯組培苗內(nèi)生菌的效果，同時(shí)，根據(jù)筆者的實(shí)踐，即使經(jīng)過(guò)多代的繼代繁殖，只要沒(méi)有環(huán)境因素和操作因素的影響，就不會(huì)有內(nèi)生菌再感染。因此，用0.1%升汞（HgCl2）浸泡馬鈴薯組培苗110 s，是目前根除馬鈴薯組培苗內(nèi)生菌的有效方法，本方法可應(yīng)用于馬鈴薯組培苗的規(guī)?；a(chǎn)。

通常內(nèi)生菌的早期感染是從根部開(kāi)始發(fā)現(xiàn)，不仔細(xì)觀察不易發(fā)現(xiàn)，且植株莖葉生長(zhǎng)很正常，但若繼續(xù)進(jìn)行組培苗擴(kuò)繁，內(nèi)生菌的感染會(huì)越來(lái)越明顯，造成整個(gè)根部出現(xiàn)黃色菌膿，繼續(xù)擴(kuò)繁最終會(huì)發(fā)生不長(zhǎng)根爛苗，造成毀滅性損失。因此，需在感染早期加以識(shí)別和剔除?？赏ㄟ^(guò)一看二聞三觀察識(shí)別是否感染內(nèi)生菌，即：一看是看瓶底組培苗根部是否有內(nèi)生細(xì)菌污染；二聞是打開(kāi)瓶蓋聞，有內(nèi)生菌感染的瓶苗會(huì)聞到細(xì)菌侵染的酸味；三觀察是仔細(xì)觀察植株根部是否有牛奶狀的乳白色液體小點(diǎn)，若發(fā)現(xiàn)需及時(shí)挑出。

此外，防治馬鈴薯組培苗感染內(nèi)生菌，還需切實(shí)采取以下綜合措施：（1）在留基礎(chǔ)苗時(shí)，選擇根系干凈的健康苗；（2）在培養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)，注意光照強(qiáng)度和長(zhǎng)度，晝夜要有溫差，光照需充足，強(qiáng)光照可有效抑制內(nèi)生菌的發(fā)生；（3）無(wú)菌室和超凈工作臺(tái)需保持潔凈，接種器械包括電子滅菌器內(nèi)的石英珠，每天要洗干凈并進(jìn)行高壓滅菌；（4）操作人員衣帽干凈，戴上口罩，在無(wú)菌室不能大聲喧嘩（以防口腔菌感染培養(yǎng)基），嚴(yán)格按照分苗操作規(guī)程進(jìn)行滅菌、操作；（5）采用反復(fù)莖尖培養(yǎng)或分生組織培養(yǎng)的方法來(lái)脫除內(nèi)生菌。