原發(fā)性干燥綜合征B細(xì)胞受體庫差異表達(dá)

張昊澤，費(fèi)允云，陳華，宣磊，張文，張奉春，張卓莉

人體正常情況下可以通過中樞免疫耐受和外周免疫耐受清除自身反應(yīng)性T細(xì)胞和B細(xì)胞。遺傳、環(huán)境等多種誘發(fā)因素共同作用可使自身抗原通過分子模擬、表位擴(kuò)展機(jī)制暴露于抗原提呈細(xì)胞，使自身反應(yīng)性淋巴細(xì)胞活化，機(jī)體免疫平衡被打破，導(dǎo)致自身免疫性疾病發(fā)生[1]。

原發(fā)性干燥綜合征(primary Sj?jren’s syndrome，pSS)就是這樣一類以B細(xì)胞高度活化為特征的疾病，大量B細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤至腺體造成不可逆性損傷，5%～10% pSS患者可以進(jìn)展為淋巴瘤[2]。近些年開展的有關(guān)B細(xì)胞清除靶向藥物以及B細(xì)胞活化因子抑制劑的臨床試驗(yàn)表明，這些藥物可降低pSS患者疾病活動(dòng)度，改善口眼干等主觀癥狀，減少激素用量[3-4]。推測這些藥物可通過有效清除高度活化的自身反應(yīng)性B細(xì)胞，阻斷其惡性循環(huán)擴(kuò)增，使得正常的B細(xì)胞亞群得以重塑，免疫系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)得以重建[5-6]。因此，研究pSS患者B細(xì)胞增殖、分化、活化過程具有重要意義。

B細(xì)胞識別抗原的關(guān)鍵部位是B細(xì)胞受體(B cell receptor，BCR)，BCR在B細(xì)胞成熟發(fā)育的過程中先后經(jīng)歷Ig基因重排、輕重鏈組合、體細(xì)胞高頻突變、Ig類別轉(zhuǎn)換等過程，可以形成1013以上具有獨(dú)特抗原特異性的抗體分子，并且可以通過抗原受體編輯和受體修正清除自身反應(yīng)性B細(xì)胞克隆，最終形成龐大的B細(xì)胞受體庫[7]。BCR 是由兩條重鏈(H鏈)與兩條輕鏈組成的四聚體，其可變區(qū)和恒定區(qū)分別由不同染色體上的多個(gè)不連續(xù)基因片段重排所編碼。人的H 鏈(14q32.33)由“Vn-Dn-Jn-Cn”基因重排形成，其可變區(qū)包含三個(gè)高變區(qū)，分別為CDR1、CDR2、CDR3，決定B細(xì)胞識別抗原肽的關(guān)鍵部位是最具多樣性的重鏈 CDR3區(qū)，由IGHV(51個(gè)功能性基因片段)、IGHD(23個(gè)功能性基因片段)和IGHJ(6個(gè)功能性基因片段)通過基因重排以及基因連接過程中插入或剪接的核苷酸序列組成。每種克隆B細(xì)胞的BCR有著特定的互補(bǔ)決定區(qū)(complementary-determining region, CDR)，其中B細(xì)胞的CDR3是B細(xì)胞識別抗原的主要部位，其長度和多樣性等都會(huì)影響其對抗原的識別與親和力。檢測B細(xì)胞CDR3受體庫，能夠分析生理和病理狀態(tài)下機(jī)體免疫狀況以及B細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展特點(diǎn)[8]。

pSS患者B細(xì)胞高度活化和大量自身抗體的產(chǎn)生提示參與自身抗原識別關(guān)鍵部位的BCR CDR3區(qū)起著重要的作用。這些pSS患者機(jī)體BCR CDR3受體庫的組成、多樣性、各功能基因亞家族的偏向取用可能和健康人群存在差異。既往傳統(tǒng)的BCR檢測方法包括聚合酶鏈-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析、免疫譜型分析、核酸雜交技術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)等，但這些技術(shù)只能粗略地對BCR序列進(jìn)行分析，所獲數(shù)據(jù)信息較為局限[9]。BCR CDR3受體庫由海量數(shù)據(jù)組成，高通量測序技術(shù)可以高效、快速、自動(dòng)化地完成基因水平分析，為BCR CDR3受體庫的建立提供有力的平臺保障[10]。本研究利用高通量測序技術(shù)對患者和健康人B細(xì)胞的BCR CDR3受體庫進(jìn)行測序和比對分析，以期初步解讀pSS患者BCR CDR3序列特點(diǎn)，探索其在pSS發(fā)病過程中的意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象

本研究入組2014年10月至2016年2月在北京協(xié)和醫(yī)院風(fēng)濕免疫科及中醫(yī)科門診就診初治pSS患者共20例，同時(shí)入組年齡性別匹配的健康志愿者(healthy controls, HC)19例。所有入組的pSS患者均符合2002年歐美共識小組(AECG)干燥綜合征國際分類標(biāo)準(zhǔn)[11]和2012年美國風(fēng)濕病學(xué)協(xié)會(huì)(ACR)干燥綜合征診斷標(biāo)準(zhǔn)[12]，并且排除其他自身免疫性疾病、腫瘤及病毒感染。本研究經(jīng)北京協(xié)和醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過，所有入組患者及健康志愿者均簽署知情同意書。

1.2 免疫磁珠分選B細(xì)胞及提取基因組DNA

留取外周靜脈全血10 mL，利用Ficoll-Paque密度梯度離心法分離PBMC。之后利用免疫磁珠分選B細(xì)胞(B Cell Isolation Kit Ⅱ，德國MiltenyiBiotec公司)。將獲取的CD19+B細(xì)胞加入細(xì)胞裂解液中，利用血液基因組DNA提取試劑盒(北京TIANGEN生物技術(shù)有限公司)提取基因組DNA，并利用Nanodrop紫外光光度計(jì)進(jìn)行質(zhì)控檢測。

1.3 多重PCR擴(kuò)增

取質(zhì)控合格的樣品，配制多重PCR反應(yīng)體系(QIAquick PCR Purification Kit，德國QIAGEN公司)；1.0倍XP磁珠純化：將PCR反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移至1個(gè)1.5 mL EP管中，用AMPure XP DNA Purification kit(SPRI beads)純化擴(kuò)增后的樣品，實(shí)驗(yàn)過程按照所用試劑說明書操作；PCR擴(kuò)增目的產(chǎn)物，并引入測序引物：將上一步得到的DNA在200 μL的PCR管按以下體系配制PCR反應(yīng)體系；1.0倍XP磁珠純化：將PCR反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移至1個(gè)1.5 mL EP管中，用AMPure XP DNA Purification kit(SPRI beads)純化擴(kuò)增后的樣品。

1.4 2%瓊脂糖凝膠回收

配置2%的回收膠；將多重PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，400 mA，100 V，電泳 2 h；EB染膠；片段選擇：250～350 bp；QIAGEN Gel Extraction kit回收切膠：回溶26 μL；Qiubit BR檢測。

1.5 文庫質(zhì)控及生物信息學(xué)分析

按照儀器操作說明操作上機(jī)測序，讀取數(shù)據(jù)。提取的39例樣本B細(xì)胞DNA基因組條帶基本完整，A260/280、A260/230均在正常范圍內(nèi)。過濾測序背景，將所得clean reads數(shù)據(jù)生物信息學(xué)分析采用MIXCR(http://www.nature.com/nmeth/journal/v12/n5/full/nmeth.3364.html)軟件分析識別CDR3序列，再將識別的序列進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較。與 IMGT 免疫細(xì)胞受體庫的V/D/J 基因比對，搜索相應(yīng)的基因片段，統(tǒng)計(jì)分析VDJ基因頻率，克隆頻率分布，多肽序列數(shù)目等信息。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSSl9.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示。計(jì)量資料首先用Kolmogorov-Smimov法檢驗(yàn)正態(tài)性，正態(tài)分布資料兩組間均數(shù)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，非正態(tài)分布資料兩組間比較采用兩Manne WhitneyU檢驗(yàn)，P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 pSS患者一般資料

入組20例pSS患者均為女性，年齡23～59歲，平均病程24(6±60)月。15例(75%)有眼干癥狀，18例(90%)有口干癥狀；17例(89.5%)出現(xiàn)血IgG升高，平均為(21.9±6.2)g/L；14例(80%)出現(xiàn)ESR增快，為(29.9±15.5)mm/h；12例進(jìn)行ANA譜檢測的患者中，ANA及抗SSA抗體均為陽性，抗SSB抗體陽性7例(58.3%)。

2.2 樣本DNA質(zhì)量檢測及測序分析

通過對每一例樣本B細(xì)胞進(jìn)行CDR3測序建庫，并進(jìn)行基因重排分析(V/J分型)，通過3D展示圖，可以初步看到該例pSS患者的免疫組庫多樣性低于HC，但在某些CDR3序列出現(xiàn)的頻次高于HC(圖1)。

圖1 CDR3序列基因重排組合(V/J分型)-3D展示圖(為測序樣本代表圖)

2.3 pSS患者和健康對照者CDR3序列長度比較

既往研究認(rèn)為，CDR3序列長度可以影響CDR3的三維構(gòu)象，進(jìn)而影響其抗原結(jié)合的特異性。本研究測序發(fā)現(xiàn)pSS患者CDR3序列平均長度為(53.03±1.68)bp，顯著低于HC組(55.47±1.52)bp(P<0.001)(圖2)。

圖2 pSS患者和健康對照者CDR3序列長度

2.4 pSS患者和健康對照者CDR3多樣性比較

pSS患者D50指數(shù)顯著低于健康對照者[(0.217±0.014)vs.(0.229±0.020)，P=0.04]，表明pSS患者組CDR3克隆多樣性較健康對照組明顯下降，某些B細(xì)胞存在特異性克隆擴(kuò)增可能(圖3)。

圖3 pSS患者和健康對照者的D50指數(shù)

2.5 pSS患者和健康對照者V/J基因優(yōu)勢取用

對測序結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示pSS患者在V功能性家族性基因中，對IGHV1、IGHV4、IGHV5、IGHV6的取用率顯著高于健康對照者(P均<0.05)，對IGHV3的取用率顯著低于健康對照者(P<0.001)(表1)。

表1 pSS患者和健康對照者V區(qū)基因優(yōu)勢取用情況分析

pSS患者在J功能性家族性基因中，對IGHJ1、IGHJ2、IGHJ3的取用率顯著高于健康對照者(P均<0.05)(表2)。

表2 pSS患者和健康對照者J區(qū)基因優(yōu)勢取用情況分析

2.6 共享克隆分析

在BCR CDR3受體庫基礎(chǔ)上篩選出普遍存在于抗SSB抗體陽性pSS患者外周血B細(xì)胞BCR H鏈的優(yōu)勢取用CDR3序列，進(jìn)一步與健康對照組比較，發(fā)現(xiàn)3種與疾病特征性相關(guān)的共享克隆型，在pSS患者中存在顯著富集現(xiàn)象：包括CARAGMDVW、CARGRYYYYGMDVW、CAKDNKPLNYDILTGQMN-YGMDVW。

3 討論

pSS患者B細(xì)胞高度活化，自身反應(yīng)性B細(xì)胞增加，產(chǎn)生多種自身抗體。自身抗原被B細(xì)胞的BCR識別，在共刺激分子及細(xì)胞因子的協(xié)同作用下發(fā)生活化，引發(fā)自身免疫反應(yīng)[13]。BCR經(jīng)歷基因重排、Ig類別轉(zhuǎn)換、體細(xì)胞高頻突變等過程形成巨大的受體庫。高通量測序具有高效、準(zhǔn)確、靈敏度高等特點(diǎn)，使建立龐大的BCR庫成為可能[14]。BCR免疫組庫測序技術(shù)已經(jīng)逐步應(yīng)用于疫苗研發(fā)、腫瘤細(xì)胞微小殘留病檢測、移植后檢測以及自身免疫性疾病、移植后療效監(jiān)測等[15-16]。

本研究對pSS患者BCR的H鏈CDR3區(qū)進(jìn)行測序評估，并與健康對照者進(jìn)行對比分析，評估其多樣性特點(diǎn)、CDR3區(qū)基因/氨基酸組成特征、各功能基因亞家族偏向取用，以了解其BCR擴(kuò)增程度和功能狀態(tài)。通過分析發(fā)現(xiàn)CDR3長度及反映BCR多樣性的D50指數(shù)在pSS患者中顯著降低。本研究采用D50指數(shù)作為多樣性的評價(jià)指標(biāo)。D50是一個(gè)描述淋巴細(xì)胞抗原受體多樣性的概念，其將免疫組庫測序結(jié)果進(jìn)行分類整理，按表達(dá)量最高到表達(dá)量最低排列，然后從高到低地相加，加到50%讀段(reads)的時(shí)候觀察一共包括多少個(gè)不同的CDR3序列，即細(xì)胞克隆數(shù)，克隆數(shù)占總數(shù)的百分比就是D50指數(shù)。健康人因?yàn)槊庖呓M庫多樣性好，免疫細(xì)胞總數(shù)的50%由許多不同的細(xì)胞組成，D50相對較高；免疫細(xì)胞存在大量克隆擴(kuò)增的患者，少數(shù)幾種大量克隆擴(kuò)增的細(xì)胞可能就占據(jù)了免疫細(xì)胞的50%，D50值相對較低。提示pSS患者的B細(xì)胞存在某些特異性克隆擴(kuò)增，這與其他自身免疫性疾病免疫組庫多樣性減低的特點(diǎn)相一致[17]。盡管高通量測序發(fā)現(xiàn)的克隆性增生的B細(xì)胞未必一定是pSS發(fā)生過程中的自身反應(yīng)性B細(xì)胞，但pSS患者整個(gè)BCR-CDR3庫多樣性顯著減少，可以初步反映疾病狀態(tài)下B細(xì)胞狀態(tài)。此外，編碼BCR序列的某些特征可能反映克隆具有自身反應(yīng)性。編碼Ig H鏈V4-34基因(IGHV4-34)主要針對自身抗原表位的反應(yīng)，并接受嚴(yán)格調(diào)控，以防自身免疫反應(yīng)的發(fā)生[18]。Pugh-Bernard等[19]發(fā)現(xiàn)初始IGHV4-34陽性細(xì)胞在健康人群隨著B細(xì)胞的發(fā)育在生發(fā)中心即被清除，避免發(fā)育為分泌自身抗體的漿細(xì)胞，而在SLE患者中這一免疫耐受過程被打破。Doorenspleet等[18]研究發(fā)現(xiàn)在早期RA患者滑液中B細(xì)胞IGHV4-34取用率顯著增加。本研究通過比較也發(fā)現(xiàn)pSS患者IGHV4的取用率顯著高于健康人群，IGHV4-34的取用情況值得進(jìn)一步分析。本研究還發(fā)現(xiàn)pSS患者在IGHV區(qū)和IGHJ區(qū)均存在明顯的取用偏向性，這種非隨機(jī)取用可能參與了自身抗原的識別[20]。CDR3序列長度(氨基酸數(shù)目增加)，提示主要與核抗原反應(yīng)有關(guān)，也許可能與自身反應(yīng)性有關(guān)[21]。本研究分析發(fā)現(xiàn)抗SSB抗體陽性的患者有3種共享克隆型存在顯著富集現(xiàn)象，CDR3序列的高頻廣泛共用，提示pSS特異性抗原的存在。既往研究表明SSA和SSB抗原均存在不同的優(yōu)勢表位抗原[22-23]。除pSS外，一些結(jié)締組織病(如系統(tǒng)性紅斑狼瘡)也可以出現(xiàn)抗SSA抗體和抗SSB抗體，后續(xù)如果繼續(xù)擴(kuò)大樣本量對BCR測序結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，也許可以找到針對pSS患者更具特異性的自身抗原及特異性封閉位點(diǎn)。

與T細(xì)胞受體庫相比，BCR受體庫數(shù)據(jù)量更大，分析更具復(fù)雜性，許多分析方法在不斷定義和完善之中[24-25]。本研究利用BCR CDR3受體庫較好地展示了pSS患者外周血B細(xì)胞在特定的時(shí)間空間中BCR CDR3特點(diǎn)，雖然pSS患者臨床表現(xiàn)異質(zhì)性較強(qiáng)，但這些患者B細(xì)胞特點(diǎn)較為一致，因此關(guān)于其BCR CDR3的分析呈現(xiàn)出許多共性的特征，值得進(jìn)一步研究，以期能夠找到潛在的自身抗原及潛在的治療靶點(diǎn)，亦或可以通過監(jiān)測發(fā)現(xiàn)特異性突變位點(diǎn)阻止pSS向淋巴瘤進(jìn)展。