超聲輔助纖維素酶提取青龍衣多糖工藝條件優(yōu)化

李 娜，趙文婧，燕平梅，武曉英，李會珍，李曉君

（1.太原師范學院生物系，山西晉中 030619；2.中北大學化學工程與技術學院，山西太原 030051）

青龍衣是胡桃科（Juglandaceae） 胡桃屬（Juglands）植物核桃（Juglans regiaL.）和胡桃楸（Juglands mandshuricaMaxim.）未成熟的外果皮[1]，主產于東北、河北、山東、山西、陜西等地，以長白山野生青核桃皮最具藥用價值[2]。青龍衣作為我國重要的藥源植物[3]，含有多種活性成分，包括多糖類、萘醌類、多酚類、黃酮類、萜類、二芳基庚院類、揮發(fā)性成分等[4-5]，具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌及解毒消熱消腫等生物學功效[6-8]。

植物多糖是一類含有多羥基的極性大分子化合物，具有無毒、生物活性好、與細胞相容性好等優(yōu)點[9]。研究表明，青龍衣中含有豐富的多糖類化合物，且其生物功效顯著。Wang R等人[10]通過研究青龍衣水溶性多糖對S180荷瘤小鼠的抗腫瘤作用，結果表明，青龍衣多糖對S180細胞增殖具有顯著的抑制作用，可以對S180荷瘤小鼠免疫功能起到保護作用。胡澤成[11]以不同濃度青龍衣多糖處理結腸癌HCT-116細胞，發(fā)現(xiàn)青龍衣多糖可以抑制PI3K/Akt信號通路的激活，并對HCT-116細胞的增殖具有顯著抑制作用。近年來，由于青龍衣多糖具有顯著的腫瘤活性，對青龍衣多糖的研究已經(jīng)成為國內外學者的研究熱點，國內外學者對青龍衣多糖化學成分及其生物活性的研究報道越來越多。

目前，國內外多糖的提取方法主要有傳統(tǒng)水提-醇沉法、溶劑浸提法、熱回流提取法、生物酶法、超臨界流體法等[12-13]。王紅霞等人[14]采用水提-醇沉法比較了不同品種、不同時期核桃青皮多糖的含量，結果表明，所有核桃品種外皮多糖含量均在硬化期達到最高。任曉蕾等人[15]采用響應面法對核桃青皮多糖提取工藝進行優(yōu)化，結果表明當提取溫度88℃，料液比1∶22，提取時間72 min時，多糖提取量可達7.83 mg/g。生物酶法成為近期天然產物提取的研究熱點。通過酶解法將青龍衣組織結構和大分子物質破壞，再利用超聲波強烈振動、空化效應、熱效應和攪拌作用等[16]進一步破壞細胞組織，使植物組織細胞中的多糖充分溶出[17]，同時采用響應面法對提取工藝進行優(yōu)化，從而提高提取效率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青龍衣，于2019年7-8月購自山西省沁縣。

葡萄糖（色譜純）、DPPH（分析純）、ABTS（分析純）、纖維素酶（酶活力50 U/mg），國藥集團化學試劑有限公司提供；其他有機溶劑均為國產分析純。

1.2 試驗設計

單因素試驗分別考查粉粹粒度（60，80，100，120，140目）、料液比 （1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50）、纖維素酶添加量（0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%）、超聲時間 （20，40，60，80，100 min）、酶解溫度 （25，35，45，55，65℃）、超聲功率（200，400，600，800，1 000 W） 對青龍衣多糖提取量的影響。在單因素試驗基礎上，采用Design Expert 10.0.3.1、Box-behnken試驗設計方案，選擇料液比（X1）、超聲時間（X2）、酶解溫度（X3）、纖維素酶添加量（X4）為考查變量，以多糖提取量（Y）為響應值。

超聲波提取青龍衣多糖響應曲面設計因素與水平設計見表1。

表1 超聲波提取青龍衣多糖響應曲面設計因素與水平設計

1.3 青龍衣多糖提取量測定

將青龍衣洗凈，置于50℃恒溫干燥箱中烘干，粉碎、過篩，干燥備用。精密稱取青龍衣粉末1.0 g，加入一定的纖維素酶量，依料液比加入蒸餾水，放入特定溫度和超聲功率的超聲波清洗機中，酶解一定的時間；過濾提取液、沉淀、離心，取上清液備用；采用苯酚-硫酸法[15]測定多糖含量。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

粉碎粒度、料液比、纖維素酶添加量對青龍衣多糖提取量的影響見圖1。

圖1 粉碎粒度、料液比、纖維素酶添加量對青龍衣多糖提取量的影響

由圖1可知，青龍衣多糖提取量隨青龍衣粉碎粒度的增加而增加，當粉碎粒度超過100目后，多糖提取量逐漸降低，可能原因是隨著粉碎粒度的增大，青龍衣粉末與提取溶劑充分接觸，使多糖容易溶出，但隨著粉碎粒度繼續(xù)增大時，導致青龍衣物料過細，使青龍衣粉碎物極易吸附結塊，從而增加了傳質阻力，降低傳質速率，不利于多糖的溶出[18]。因此，選擇合適的粉碎粒度為100目。

由圖1可知，青龍衣多糖提取量隨料液比的增加而增加，當料液比超過1∶20后，多糖提取量趨于穩(wěn)定，可能原因是隨著液料比的增大，青龍衣多糖與提取溶劑的濃度差增大，提高了傳質速率[19]，多糖更易溶出，隨著料液比繼續(xù)增大時，極大的濃度差導致青龍衣其他組分的溶出，使得多糖提取量的增加不明顯。因此，選擇合適的料液比為1∶20。

由圖1可知，隨著酶添加量的增加，青龍衣多糖提取量增加，當酶添加量超過1.5%時，多糖提取量增加緩慢?？赡茉蚴?，隨著酶添加量的增加，植物組織在纖維素酶的作用下逐漸水解完全，有利于多糖的釋放，從而提高多糖提取量；但隨著酶添加量的繼續(xù)增加，有限的底物濃度限制了多糖的溶出，或者多糖被包裹在纖維素酶中[20]，從而使得多糖提取量趨于不變。因此，選擇合適的酶添加量為1.5%。

超聲時間、酶解溫度、超聲功率對青龍衣多糖提取量的影響見圖2。

由圖2可知，隨著超聲時間的延長，青龍衣多糖提取量增加，但在超過50 min時，多糖提取量緩慢下降，可能原因是，隨著超聲時間的延長，青龍衣組織細胞被破壞得更加充分，有利于酶解的進一步作用，使多糖更易溶出，但隨著時間的延長，持續(xù)高溫可能在一定程度上對多糖分子的結構具有破壞作用，或者使多糖分解為單糖[21]，從而使得多糖提取量降低。因此，選擇合適的超聲時間為50 min。

圖2 超聲時間、酶解溫度、超聲功率對青龍衣多糖提取量的影響

由圖2可知，隨著酶解溫度的升高，青龍衣多糖提取量逐漸增加，但當溫度高于45℃以后，多糖提取量逐漸下降，可能原因是，試驗所用纖維素酶的最適溫度為45～55℃，隨著酶解溫度的升高，纖維素酶活性增大，酶解作用也相應增強，多糖提取量隨之增加，但當試驗溫度超過酶的最適溫度后，高溫使得纖維素酶的活性逐漸降低，或者持續(xù)的高溫使部分多糖降解[22]，從而導致青龍衣多糖的提取量下降。因此，選擇合適的酶解溫度為45℃。

由圖2可知，隨著超聲功率的升高，青龍衣多糖提取量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，當超聲功率為600 W時，多糖提取量最大為7.92 mg/g。原因可能是，適當功率的超聲波對植物組織細胞具有破壞作用，有利于組織細胞間或細胞內有效成分的釋放。但是，較大的超聲功率極易造成多糖分子鏈的斷裂，或者對組織細胞的破壞作用更徹底，從而使與目標成分存在萃取競爭關系的非目標物質溶出[13]，從而使得多糖提取量降低。因此，選擇合適的超聲功率為600 W。

各單因素試驗中，綜合考慮多糖提取量及試驗成本等因素，確定粉碎粒度100目，料液比1∶20，纖維素酶添加量1.5%，超聲時間50 min，酶解溫度45℃和超聲功率600W為青龍衣多糖的最佳基本提取條件。各單因素試驗除粉碎粒度和超聲功率外，不同條件對青龍衣多糖提取量的影響范圍為2.02～3.70 mg/g，不同粉碎粒度和超聲功率對多糖的影響范圍分別為0.81，0.91 mg/g。因此，試驗僅將料液比、超聲時間、酶解溫度、纖維素酶添加量列入響應面試驗的優(yōu)化因素中，而粉碎粒度和超聲功率并未列入響應面優(yōu)化因素中。

2.2 響應面優(yōu)化試驗結果

2.2.1 響應面模型及顯著性檢驗

將料液比、超聲時間、酶解溫度、纖維素酶添加量作為曲面響應法考查的4個單因子，以多糖提取量（mg/g）為響應值，四因子三水平29個組合的曲面響應法分析試驗結果。多糖提取量的變幅為5.04 mg/g（8號試驗） 到8.81%（1號試驗）。

試驗設計及響應值結果見表2。

2.2.2 多糖提取量的響應面分析

表2 試驗設計及響應值結果

運用Design Expert 10.0.3.1軟件對表2所示多糖提取量進行的試驗數(shù)據(jù)的響應面回歸擬合，得出多糖提取量響應值（Y）和各因素（X1，X2，X3，X4）間二次回歸模型：

二次多項式模型的方差分析見表3。

由表3可知，試驗各因素對多糖提取量的影響順序依次為纖維素酶添加量>料液比>酶解溫度>超聲時間。

由表3可知，多糖提取量的二次多項式擬合模型極顯著（p<0.000 1)，F(xiàn)值為21.28，其失擬項p=0.335 7>0.05不顯著。因此，在試驗范圍內，此模型與試驗數(shù)據(jù)的擬合性較好；擬合系數(shù)R2值是0.955 1，說明該模型能夠闡明95.51%的響應值的變化。信噪比Adep Precision（14.406） 大于4，說明該模型的回歸方程的可信度較高。變異系數(shù)為4.5，說明模型穩(wěn)定性較好。由此可以看出，響應面法優(yōu)化超聲輔助酶解法提取青龍衣多糖的工藝可靠并且穩(wěn)定性好，可以用該模型對料液比、超聲時間、酶解溫度、酶添加量對多糖提取量進行優(yōu)化和分析。

表3 二次多項式模型的方差分析

由表3可知，料液比-酶添加量二次項、超聲時間-酶添加量二次項對多糖提取量呈現(xiàn)顯著水平；料液比一次項、超聲時間一次項、酶解溫度一次項、酶添加量一次項、超聲時間-酶解溫度二次項、酶解溫度-酶添加量二次項呈現(xiàn)極顯著水平；料液比-超聲時間二次項、料液比-酶解溫度二次項不顯著。

2.2.3 青龍衣多糖提取最優(yōu)條件的確定及驗證

使用Design Expert 10.0軟件對多元二次回歸方程求一階偏導，得到在料液比1∶23.28，超聲時間44.04 min，酶解溫度47.54℃，纖維素酶添加量1.55%的條件下多糖提取量達到8.70%。結合實際試驗操作的可行性，將上述途徑修正為料液比1∶23，超聲時間44 min，酶解溫度48℃，酶添加量1.55%，在修正后的試驗條件下進行驗證試驗，青龍衣多糖的平均提取量為9.43 mg/g，其誤差為0.73%，試驗值與理論值基本吻合，說明回歸方程能較真實地反映各因素對青龍衣多糖提取量的影響。

3 結論

在單因素試驗基礎上，通過響應面法設計試驗，確定最佳提取條件為料液比1∶23，超聲時間44 min，酶解溫度48℃，酶添加量1.55%。在此條件下青龍衣多糖提取量達到9.94 mg/g。采用超聲輔助纖維素酶提取青龍衣多糖的方法具有成本低廉、方法簡便易行的優(yōu)點，為青龍衣多糖大規(guī)模產業(yè)化提取加工提供一定理論依據(jù)和技術參照。