魚(yú)類(lèi)飼料中黃曲霉毒素B1檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

楊惠宇，趙 瑩，潘發(fā)林

(長(zhǎng)春市水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)中心，吉林 長(zhǎng)春 130033)

隨著中國(guó)漁業(yè)的發(fā)展，對(duì)飼料的需求量日益增大，使得魚(yú)類(lèi)飼料工業(yè)迅猛發(fā)展，飼料中大部分為花生、玉米、大豆等原料，在高溫、潮濕條件下極易受霉菌毒素的污染,其中黃曲霉毒素B1的污染造成的損失尤為嚴(yán)重，也是對(duì)動(dòng)物及人類(lèi)危害最大的霉菌毒素。為此，筆者查閱最新國(guó)內(nèi)外研究資料并進(jìn)行歸納總結(jié)，分別介紹了黃曲霉毒素B1的檢測(cè)方法，比較了各種方法在實(shí)際應(yīng)用中的優(yōu)缺點(diǎn)，并對(duì)檢測(cè)方法進(jìn)行了展望，以期為黃曲霉毒素的檢測(cè)和研究提供幫助。

1 黃曲霉毒素的基本性質(zhì)及其危害

黃曲霉素(AFT)是一類(lèi)化學(xué)結(jié)構(gòu)類(lèi)似的次級(jí)代謝產(chǎn)物，均為二呋喃香豆素的衍生物。黃曲霉毒素是一種次生代謝產(chǎn)物[1]，是由黃曲霉和寄生曲霉產(chǎn)生，由于在紫外線下熒光顏色的不同，將其分為藍(lán)紫色熒光的B族，和黃綠色熒光的G族及其衍生物，見(jiàn)圖1。目前已經(jīng)分離出20多種，包括B1、B2、G1、G2、M1、M2等，它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)類(lèi)似,但具體結(jié)構(gòu)有所不同,凡是二氫呋喃環(huán)末端有雙鍵的毒性較強(qiáng)，按毒性從大到小依次為：AFB1、AFM1、AFG1、AFB2。在食物中黃曲霉素B1最為常見(jiàn)，是目前已知的最強(qiáng)的化學(xué)致癌物之一。AFT難溶于水及甲醇、乙醇、氯仿等有機(jī)溶劑，在強(qiáng)酸性溶液中稍有分解，在pH值9～10的強(qiáng)堿溶液中可以快速分解成為無(wú)毒的鹽，在自然條件下黃曲霉毒素穩(wěn)定性很強(qiáng)，紫外線條件下對(duì)低濃度的黃曲霉毒素有一定的破壞性。

圖1 黃曲霉毒素B1、B2、M1、M2、G1、G2的化學(xué)結(jié)構(gòu)

2 黃曲霉毒素的毒理效應(yīng)及其危害

黃曲霉毒素是目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的致癌物之一，其毒性為KCN的10倍，是砒霜的68倍，能使禽類(lèi)、魚(yú)類(lèi)、靈長(zhǎng)類(lèi)等動(dòng)物誘發(fā)肝癌，主要表現(xiàn)為肝部壞死、出血以及肝硬化等[2-3]。魚(yú)類(lèi)采食黃曲霉毒素后會(huì)導(dǎo)致其采食量下降，體重下降，影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，與其他外源污染物一樣，長(zhǎng)期的黃曲霉毒素?cái)z入會(huì)影響動(dòng)物的免疫系統(tǒng)，抑制動(dòng)物的自然免疫。早在1993年黃曲霉毒素就被世衛(wèi)組織列為一級(jí)致癌物質(zhì)[4]，國(guó)內(nèi)外科研工作者也對(duì)該毒素的研究產(chǎn)生了極大的興趣[5-6]，研究表明，用含有濃度為0.015 mg/kg黃曲霉毒素B1的飼料投喂小鼠，68～82周后小鼠肝部發(fā)生病變，用含有濃度為0.1 mg/kg黃曲霉毒素B1的飼料投喂鱒魚(yú)，26周后出現(xiàn)肝癌[7]。 黃曲霉毒素對(duì)人類(lèi)和動(dòng)物健康的危害主要是由于黃曲霉毒素抑制體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成，黃曲霉毒素中產(chǎn)生毒素的重要結(jié)構(gòu)是雙呋喃環(huán)[8]，該霉毒素對(duì)細(xì)胞有毒害作用，該毒素首先干擾DNA與mRNA的合成，進(jìn)而再影響蛋白質(zhì)的合成，最終導(dǎo)致整個(gè)機(jī)體的損害[9-10]。黃曲霉毒素只有在機(jī)體內(nèi)代謝活化之后才會(huì)表現(xiàn)出劇毒性[11]，其中因黃曲霉毒素與DNA的絡(luò)合導(dǎo)致的突變而引起的癌癥備受關(guān)注。黃曲霉毒素除了對(duì)肝臟有影響之外，對(duì)其他系統(tǒng)也會(huì)產(chǎn)生影響，如生物體攝入黃曲霉毒素后，會(huì)破壞其造血功能，導(dǎo)致血液成分的變化，還會(huì)導(dǎo)致機(jī)體免疫力降低等。魚(yú)類(lèi)攝入含有黃曲霉毒素的飼料后，黃曲霉毒素會(huì)通過(guò)新陳代謝蓄積在魚(yú)體的各個(gè)組織，經(jīng)尿液排出一部分后，仍有大部分殘留在肉中，因此黃曲霉毒素一方面直接影響動(dòng)物機(jī)體健康，同時(shí)毒素也會(huì)轉(zhuǎn)移到肉中，通過(guò)食物鏈來(lái)威脅人類(lèi)健康[12]。并且，黃曲霉毒素的毒性還可通過(guò)母體傳遞，對(duì)胚胎免疫系統(tǒng)的發(fā)育產(chǎn)生影響，導(dǎo)致胚胎免疫機(jī)能受損，具有致畸、致癌作用，所以控制好飼料中黃曲霉毒素的含量，保證水產(chǎn)品的質(zhì)量安全就是對(duì)人類(lèi)健康的保護(hù)。

3 黃曲霉毒素殘留檢測(cè)技術(shù)

目前現(xiàn)有國(guó)內(nèi)外對(duì)于飼料中黃曲霉毒素的檢測(cè)方法種類(lèi)繁多，大多集中于理化檢測(cè)法和免疫學(xué)檢測(cè)法，本文將對(duì)現(xiàn)有的黃曲霉毒素檢測(cè)方法按照理化檢測(cè)法和免疫學(xué)檢測(cè)法分類(lèi)進(jìn)行綜述。

3.1 理化檢測(cè)方法

3.1.1 薄層色譜法(TLC) 薄層色譜法是最早檢測(cè)黃曲霉毒素的方法，也是現(xiàn)行許多國(guó)家的作為國(guó)標(biāo)的檢測(cè)方法[13]，薄層色譜法是樣品在經(jīng)過(guò)提取、凈化、濃縮、分離后，在特定波長(zhǎng)的紫外光照射下，根據(jù)其發(fā)光顏色的不同判斷B族、G族，根據(jù)熒光強(qiáng)度判斷黃曲霉毒素的含量。Marijana[14]利用薄層色譜法測(cè)定飼料中單瑞孢霉烯族毒素等，檢出率達(dá)到16.8%，含量在0.05～3.4 mg/kg之間。該方法的優(yōu)點(diǎn)是設(shè)備簡(jiǎn)單，操作方便，分析成本低，較適合對(duì)黃曲霉素B1的定性檢測(cè)；其缺點(diǎn)是對(duì)檢測(cè)的規(guī)范和熟練程度要求高，準(zhǔn)確度低，且重復(fù)性較差。

3.1.2 高效液相色譜法(HPLC) 高效液相色譜法是檢測(cè)黃曲霉毒素的國(guó)標(biāo)方法之一，也是一種常用的方法，其原理是以有機(jī)溶劑和水混合作為流動(dòng)相，樣品通過(guò)分離、純化和濃縮后上機(jī)，通過(guò)計(jì)算待測(cè)樣品的峰面積來(lái)判斷樣品中毒素的含量。鄭會(huì)超等[15]研究了飼料中黃曲霉毒素的檢測(cè)方法，通過(guò)免疫親和柱凈化后，用熒光檢測(cè)器檢測(cè)，可以同時(shí)分離飼料中的4種黃曲霉毒素，靈敏度高、重復(fù)性好。高效液相色譜法的優(yōu)點(diǎn)是檢測(cè)靈敏度高，重復(fù)性好，且檢出限低，缺點(diǎn)是前處理操作復(fù)雜、分析成本高、且需要在專(zhuān)業(yè)實(shí)驗(yàn)室經(jīng)專(zhuān)業(yè)人員進(jìn)行檢測(cè)，不能滿(mǎn)足快速批量篩查的需求。

3.1.3 親和柱高效液相色譜法(IAC-HPLC) 親和柱高效液相色譜法可以避免薄層色譜法和高效液相色譜法的缺點(diǎn)，通過(guò)免疫親和柱與薄層色譜和高效液相色譜相結(jié)合，可以在一定程度上提高檢測(cè)效率、檢測(cè)結(jié)果的靈敏度和準(zhǔn)確度，達(dá)到準(zhǔn)確定量。姚兆興等[16]用甲醇、水溶液作為流動(dòng)相采用親和柱高效液相色譜法提取飼料中的黃曲霉毒素，通過(guò)免疫層系柱凈化后，采用高效液相色譜測(cè)定黃曲霉毒素的含量，檢出限為0.5 μg/kg，且線性范圍良好，精密度和準(zhǔn)確度能夠滿(mǎn)足要求。該方法同樣具有靈敏度高、檢測(cè)限低等優(yōu)點(diǎn)，并且在操作過(guò)程中檢測(cè)人員無(wú)中毒危險(xiǎn)。

3.1.4 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS) 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法以其是一種結(jié)合了液相色譜的分離技術(shù)和質(zhì)譜高靈敏度的特點(diǎn)，是目前應(yīng)用最廣的一種檢測(cè)技術(shù)，經(jīng)常被用作確證方法使用。朱聰英等[17]建立了液相質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定飼料中多種黃曲霉毒素的方法，被測(cè)樣品中的各組分均得到了有效的分離，檢測(cè)靈敏度高，檢出限為0.2 μg/kg，定量限為0.5 μg/kg，檢測(cè)回收率為66%～108%，均在允許范圍內(nèi)。該方法在精密度、靈敏度存在一定優(yōu)勢(shì)，適用于定量、定性檢測(cè)，且檢測(cè)周期短節(jié)省時(shí)間，樣品制備簡(jiǎn)單。

3.2 免疫學(xué)檢測(cè)法

3.2.1 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA) 利用ELISA檢測(cè)黃曲霉毒素的原理是毒素抗原抗體直接的競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng)，也是我國(guó)測(cè)定飼料中黃曲霉素B1的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法之一[18]。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中該方法的檢出限為0.2 μg/kg。孫清[19]用酶聯(lián)免疫方法檢測(cè)魚(yú)粉中黃曲霉毒素B1，檢測(cè)結(jié)果與液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)結(jié)果相符，且線性范圍良好。ELISA法靈敏度高，操作便捷，分析速度快，并且可以同時(shí)處理大批量樣品，但是由于同類(lèi)分子的相似性，ELISA法容易對(duì)結(jié)構(gòu)類(lèi)似的其它黃曲霉毒素或化學(xué)物質(zhì)產(chǎn)生一定的交叉反應(yīng)，有可能帶來(lái)假陽(yáng)性、假陰性結(jié)果，檢驗(yàn)精確度有待提高。

3.2.2 免疫膠體金技術(shù)(GICT) 免疫膠體金技術(shù)的原理是讓待測(cè)樣品中的毒素與金標(biāo)物結(jié)合，抑制了抗體和硝酸纖維素膜檢測(cè)線上黃曲霉毒素B1偶聯(lián)物的免疫反應(yīng)，使檢測(cè)線變淺，通過(guò)檢測(cè)線顏色變化進(jìn)行測(cè)定[20]。膠體金免疫層析技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)為簡(jiǎn)單、快速、成本低廉，適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和大規(guī)模樣品篩查。但其靈敏度低和不能定量的缺點(diǎn)，也使膠體金免疫層析技術(shù)在一些領(lǐng)域內(nèi)的應(yīng)用受到限制。目前研究膠體金免疫層析方法與其他儀器結(jié)合，建立黃曲霉素B1快速檢測(cè)綜合體系將是未來(lái)的發(fā)展趨勢(shì)。

3.2.3 免疫層析法(ICA) 免疫層析法是二十世紀(jì)九十年代興起的一種基于免疫膠體金技術(shù)的快速檢測(cè)方法，其原理是樣品在毛細(xì)管的作用下移動(dòng)至固定抗體的區(qū)域后，該區(qū)域會(huì)顯示一定顏色。劉艷麗等[21]建立了一種用于檢測(cè)黃曲霉毒素B1的免疫層次試紙條，靈敏度為1.0 ng/mL。說(shuō)明該方法有很好的應(yīng)用前景。

3.2.4 放射免疫法(PIA) 放射免疫法與酶聯(lián)免疫方法的區(qū)別只是標(biāo)記物的不同，放射免疫法的標(biāo)記物為放射性元素，一般采用元素氚為標(biāo)記物，使標(biāo)記物與抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，通過(guò)測(cè)定樣品放射性的強(qiáng)弱來(lái)判斷毒素含量的高低。閆磊等[22]通過(guò)PIA法測(cè)定牛奶中黃曲霉毒素的含量，得到檢出限為0.25 μg/kg。放射免疫法的優(yōu)點(diǎn)是測(cè)定周期短、前處理簡(jiǎn)單，缺點(diǎn)是放射性元素污染問(wèn)題。

3.2.5 熒光偏振免疫法(FPIA) 熒光免疫分析法是一種定量免疫分析技術(shù)，原理是用熒光物質(zhì)做標(biāo)記，與待測(cè)樣品中的抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗體，通過(guò)結(jié)合物熒光偏振程度來(lái)判斷樣品中毒素的含量。楊曉涵等[23]利用熒光偏振免疫法檢測(cè)茶中黃曲霉毒素的含量，檢測(cè)限為20 ng/mL，檢測(cè)范圍為92.76～252.32 ng/mL。該方法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)速度快、可進(jìn)行批量檢測(cè)，但易出現(xiàn)假陽(yáng)性，且設(shè)備價(jià)格昂貴。

3.2.6 時(shí)間分辨熒光免疫分析法(TRFIA) 時(shí)間分辨熒光免疫分析法是使用鑭系元素為標(biāo)記物，利用其螯合物發(fā)光的特點(diǎn)，通過(guò)該技術(shù)來(lái)測(cè)定熒光來(lái)判定樣品中的毒素。樊曉播[24]利用時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)檢測(cè)大米、黃豆和干果中黃曲霉毒素B1，靈敏度為0.02 ng/mL。該方法在排除非特異熒光干擾的前提下大大提高了靈敏度，同時(shí)克服了同位素的污染問(wèn)題。

3.2.7 免疫傳感器法(IS) 免疫傳感器法是一種基于抗原抗體特異性識(shí)別功能而研制的一種生物傳感器。王瑞鑫[25]利用該方法包埋固定抗黃曲霉毒素B1抗體，構(gòu)建一種基于石墨烯的免疫傳感器，用于測(cè)定花生和玉米油中黃曲霉毒素B1，檢出限為0.04 ng/mL，回收率為94%～104%，均在允許范圍內(nèi)。該方法雖然靈敏度高，但固化抗原抗體技術(shù)尚未成熟。

3.3 其他方法

3.3.1 電子鼻法 電子鼻是一種新興的檢測(cè)技術(shù)，是由傳感系統(tǒng)和自動(dòng)化識(shí)別系統(tǒng)組成的一種電子感官儀器，它是將神經(jīng)、數(shù)學(xué)、物理等多方面的理論運(yùn)用到一起，可以快速辨別氣味和氣體，建立一種氣味的模型，可以檢出樣品的特殊氣味。沈飛[26]利用電子鼻技術(shù)檢測(cè)糙米中的黃曲霉毒素。這種方法是一種間接的檢測(cè)方法，即不是直接檢測(cè)樣品中的黃曲霉毒素，而是待樣品污染后檢測(cè)其揮發(fā)性物質(zhì)的改變。該方法為檢測(cè)提供了一種新的思路，但應(yīng)用較少，仍需進(jìn)一步探索。

3.3.2 分子生物學(xué)檢測(cè)方法(PCR技術(shù)) 近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，PCR技術(shù)在霉菌毒素的檢測(cè)中得到了廣泛的應(yīng)用。秦文彥等[27]通過(guò)對(duì)黃曲霉毒素的基因調(diào)控，建立了單管多重PCR檢測(cè)黃曲霉毒素的體系，對(duì)黃曲霉毒素的DNA樣本進(jìn)行檢測(cè)，靈敏度為1 ng/μL。該方法具有方便快捷且成本低等優(yōu)點(diǎn)。

4 總結(jié)與展望

4.1 總結(jié)

魚(yú)類(lèi)飼料中黃曲霉毒素的檢測(cè)技術(shù)種類(lèi)繁多，且檢測(cè)技術(shù)趨于成熟，現(xiàn)將檢測(cè)方法總結(jié)如表1。

表1 魚(yú)類(lèi)飼料中黃曲霉毒素檢測(cè)方法對(duì)比

綜上所述，免疫學(xué)檢測(cè)法為半定量、定性檢測(cè)方法，多應(yīng)用于初篩或者批量檢測(cè)中，準(zhǔn)確性稍差；理化檢測(cè)方法為定性、定量檢測(cè)方法，穩(wěn)定性、重復(fù)性、準(zhǔn)確性較高，且液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法為國(guó)標(biāo)的檢測(cè)方法之一；近年來(lái)新興起來(lái)的檢測(cè)方法雖然能夠達(dá)到檢測(cè)效果，但仍需進(jìn)一步研究。綜合當(dāng)前研究，液相色譜(HPLC)和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)應(yīng)用最廣。

4.2 展望

本文綜述了多種檢測(cè)黃曲霉毒素的方法，如理化檢測(cè)方法、免疫學(xué)檢測(cè)方法以及一些新興的檢測(cè)方法，有些雖未涉及到魚(yú)類(lèi)飼料的檢測(cè)但是具有十分廣闊的發(fā)展前景。密切關(guān)注國(guó)內(nèi)外的新技術(shù)，推出更適合我國(guó)黃曲霉毒素的檢測(cè)技術(shù)，對(duì)加強(qiáng)飼料安全的控制，保障人民的身體健康具有重要意義。