磺胺類(lèi)抗生素分子印跡制備技術(shù)與應(yīng)用進(jìn)展

李心悅,張譯豐,賴(lài)靜嫻,蔡湘萍,梁清文,賴(lài) 婷,徐振林,韋曉群

(廣東省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,廣東廣州 510640)

分子印跡技術(shù)(molecular imprinting technique,MIT)是指制備對(duì)某一特定的目標(biāo)分子具有特異識(shí)別位點(diǎn)的聚合物的過(guò)程[1]。分子印跡聚合物(molecular imprinted polymer,MIP)的特別識(shí)別位點(diǎn)模仿了抗體或酶等生物體間的識(shí)別機(jī)制,模板分子與聚合物單體在合適的反應(yīng)體系中混合后,功能單體與模板分子通過(guò)氫鍵、靜電作用、疏水相互作用等分子間作用力形成結(jié)構(gòu)互補(bǔ)的有序排列,通過(guò)交聯(lián)劑使功能單體聚合,形成聚合物,最后從聚合物中除去模板分子可得到具有對(duì)模板分子有特異吸附鍵合位點(diǎn)的分子印跡聚合物[2-3]。MIP的高穩(wěn)定性和對(duì)大多數(shù)目標(biāo)分析物有效的通用性使它適用于眾多成分的檢測(cè)。

目前MIP已被廣泛應(yīng)用于食品中獸藥殘留的分析檢測(cè)。已被作為模板分子研究的抗生素包括天然抗生素β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素[4]、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素[5]、四環(huán)素族抗生素[6]等和合成抗生素喹諾酮類(lèi)抗菌藥物[7]、磺胺類(lèi)抗生素[8]等,幾乎涵蓋所有養(yǎng)殖用藥領(lǐng)域?；前奉?lèi)抗生素(sulfanilamide,SAs)作為一種與對(duì)氨苯甲酸(p-aminobenzoic acid,PBPA)結(jié)構(gòu)類(lèi)似[9]的抗生素,具有抗菌譜系廣、價(jià)格便宜[10]的特點(diǎn),被作為獸藥廣泛應(yīng)用于預(yù)防和治療細(xì)菌和病毒引起的動(dòng)物疾病和原生動(dòng)物感染疾病[11]。歐洲是磺胺類(lèi)藥物使用最為廣泛的地區(qū)之一,每年在豬的飼養(yǎng)中使用的磺胺噻唑就高達(dá)400000 kg,磺胺二甲嘧啶的使用量也高達(dá)350000 kg[12]。由于磺胺類(lèi)藥物被頻繁使用甚至違規(guī)濫用,它已成為目前最常被檢出的抗菌類(lèi)藥物之一。為解決磺胺類(lèi)抗生素濫用的問(wèn)題,動(dòng)物性食品中的磺胺類(lèi)藥物的最大殘留量(maximum residue limit,MRL)被規(guī)定為100 μg·kg-1[13]。為了實(shí)現(xiàn)磺胺類(lèi)藥物檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化,我國(guó)制定高效液相色譜法[14]的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB 29694-2013),這一檢測(cè)方法準(zhǔn)確性高,但是前處理步驟復(fù)雜,使用具有特異性的MIP作固相萃取材料可有效簡(jiǎn)化樣品前處理步驟,Rozaini等[8]使用分子印跡薄膜,實(shí)現(xiàn)了對(duì)水樣中SAs的直接檢測(cè),同時(shí),MIP處理后的樣品還存在富集率高、選擇性好等優(yōu)點(diǎn),有效地降低了樣品中復(fù)雜基質(zhì)對(duì)待測(cè)物檢測(cè)結(jié)果的干擾,在Xu等[15]的研究中,使用MIP后,豬肉等肉類(lèi)樣品的檢測(cè)限達(dá)0.20～0.72 μg/kg,儀器檢測(cè)精度高。因此,MIP在磺胺類(lèi)藥物的檢測(cè)中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

本綜述對(duì)各磺胺類(lèi)抗生素分子印跡聚合物的制備條件進(jìn)行了收集和匯總,分析在不同優(yōu)化條件下分子印跡聚合物的結(jié)構(gòu)和性能差異,總結(jié)了其在各樣品檢測(cè)中的多種應(yīng)用模式,并對(duì)其優(yōu)缺點(diǎn)及發(fā)展前景進(jìn)行綜述。

1 磺胺類(lèi)藥物分子印跡聚合物的反應(yīng)體系研究現(xiàn)狀

1.1 模板和功能單體的選擇

磺胺類(lèi)抗生素由對(duì)氨基苯磺酰胺和取代了磺酰胺基上一個(gè)氫的雜環(huán)基團(tuán)(用R指代)兩部分組成[16],可作用位點(diǎn)如圖1所示,包括可與功能單體形成氫鍵作用力的氨基和硫氧鍵,以及能與部分功能單體或交聯(lián)劑形成疏水作用力和п-п相互作用力的苯環(huán)。

圖1 磺胺類(lèi)藥物的結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Structure of sulfonamides

磺胺類(lèi)抗生素的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)決定了它的分子印跡聚合方法多屬于非共價(jià)型聚合,這一聚合方法的分子間相互作用力弱,要求模板分子的功能位點(diǎn)個(gè)數(shù)適中,在模板與功能單體間有足夠作用強(qiáng)度的同時(shí),避免模板分子與功能單體的結(jié)合過(guò)于牢固而導(dǎo)致的模板分子難以從MIP中除去的情況。除此之外,分子印跡還要求模板分子具有較高的溶解性。磺胺嘧啶(sulfadiazine,SD)[17-20]、磺胺二甲基嘧啶(sulfamethazine,SMZ)[15,21-22]、磺胺二甲氧基嘧啶(sulfamethazine,SDM)[23-24]同屬磺胺嘧啶類(lèi)抗菌劑,三種化合物結(jié)構(gòu)相似,溶解性較好,R基團(tuán)嘧啶環(huán)上的兩個(gè)胺基可提供兩個(gè)氫鍵結(jié)合位點(diǎn),可輔助磺胺基上的四個(gè)氫鍵結(jié)合位點(diǎn)形成穩(wěn)定的非共價(jià)型絡(luò)合結(jié)構(gòu),有利于MIP特異性空腔的形成,因此,如圖2所示,擁有嘧啶雜環(huán)的磺胺類(lèi)抗生素作為模板分子的頻率,達(dá)57%,即一半的磺胺類(lèi)抗生素分子印跡的模板分子都屬于磺胺嘧啶類(lèi)。一方面,這是因?yàn)槠浠瘜W(xué)性質(zhì)的適配性,另一方面,這是由市場(chǎng)應(yīng)用情況決定的,SD、SMZ和SDM作為中效抗菌劑,使用范圍廣泛,殘留情況相對(duì)嚴(yán)重[12],用它們制備的MIP具有更高的實(shí)用性?；前芳讎f唑(sulfamethoxazole,SMO)[25]作為磺胺類(lèi)抗生素中的常用藥,同樣存在較嚴(yán)重的藥物污染問(wèn)題,而且其噁唑雜環(huán)也可為MIP提供兩個(gè)氫鍵結(jié)合位點(diǎn),是較為理想的模板分子材料,因此,磺胺甲噁唑也常被用作MIP的模板分子,其占比高達(dá)19%。

圖2 磺胺類(lèi)分子印跡模板分子使用情況Fig.2 Usage of template moleculein sulfonamide molecularly imprinted注：該圖以JCR I、II區(qū)文獻(xiàn)為主要統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù),2002～2018年。

功能單體與模板分子在有機(jī)介質(zhì)中識(shí)別程度的差異也是選擇模板分子的影響因素之一[24],由于功能單體的pH、極性、結(jié)構(gòu)等存在差異,不同的磺胺類(lèi)模板分子與功能單體間的絡(luò)合效果也有所不同。在已有的報(bào)道中,甲基丙烯酸(methacrylic acid,MAA)的使用頻率最高,這可能與磺胺二甲基嘧啶被作為磺胺類(lèi)抗生素分子印跡的常用模板分子有關(guān)。對(duì)比表1 MIP-1和MIP-2發(fā)現(xiàn),當(dāng)SMZ和MAA分別作為模板分子和功能單體時(shí),MIP的選擇性顯著。Isarankura-Na-Ayudhya等[26]使用計(jì)算機(jī)模擬技術(shù),對(duì)這一現(xiàn)象進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)MAA與磺酰胺部分的結(jié)合能達(dá)-91.9364 kJ/mol,比1-乙烯基咪唑與磺酰胺部分的結(jié)合能高一倍,而當(dāng)功能單體與模板分子間能量較高時(shí),MIP的結(jié)合位點(diǎn)親和力更高[27]。由于磺胺類(lèi)抗生素分子印跡選用的模板結(jié)構(gòu)多與SMZ類(lèi)似,所以MAA功能單體在磺胺類(lèi)分子印跡中普遍適用。但是,MAA作為一種可同時(shí)成為氫鍵供體和受體的功能單體,MAA和MAA之間的結(jié)合能很高[26],當(dāng)模板分子與MAA間的結(jié)合能不足時(shí),MAA容易自聚,MIP效果反而不理想。表1 MIP-5顯示,當(dāng)SMO作為模板分子時(shí),功能單體MAA并不能為MIP帶來(lái)較好的特異性。除此之外,將表1 MIP-1、MIP-2和MIP-3的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比,還可以發(fā)現(xiàn),功能單體的復(fù)合使用對(duì)MIP的吸附性能和選擇性有了很大提升[28-29],乙烯基功能單體的復(fù)合使用為磺胺類(lèi)分子印跡的優(yōu)化提供了更多可能。

表1 模板分子和功能單體對(duì)分子印跡聚合物特異性的影響Table 1 Effects of template molecules and functional monomers on the selectivity of molecularly imprinted polymers

近年來(lái),為解決乙烯基功能單體聚合的MIP易受強(qiáng)極性溶劑干擾的問(wèn)題,部分報(bào)道提出了選用非乙烯基功能單體的研究思路。3-氨基丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyltriethoxysilane,APTEs)[18]、3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(KH570)[22]等需要使用溶膠-凝膠法聚合的硅烷偶聯(lián)劑功能單體,還有三聚氰胺和間苯二酚[30]等的水溶性親水性功能單體都屬于新型非乙烯基功能單體。這一類(lèi)型的功能單體區(qū)別于MAA、4-VP等傳統(tǒng)乙烯基功能單體,擁有較多的羥基和可在水相環(huán)境下聚合的能力,可有效抑制強(qiáng)極性環(huán)境對(duì)自身的干擾。除此之外,擁有特殊性質(zhì)的功能單體還可以賦予MIP特殊的控制性性能。Chen 等[17]利用4-[(4-甲基丙烯酰氧基)苯基偶氮]苯磺酸(4-[(4-methacryloyloxy)phenylazo]benzenesulfonic acid,MAPASA)中的偶氮苯留色子可在指定光波長(zhǎng)下發(fā)生異構(gòu)化的特點(diǎn),通過(guò)光波長(zhǎng)的變化改變其識(shí)別位點(diǎn)的空間排列,使得MIP具有控制模板分子結(jié)合和釋放的能力,設(shè)計(jì)出了以它作為功能單體的光敏分子印跡聚合物。功能單體種類(lèi)選擇和創(chuàng)新應(yīng)用是分子印跡制備中的一個(gè)重要課題。

1.2 交聯(lián)劑的選擇

交聯(lián)劑的作用是固定模板分子周?chē)墓δ軉误w及其官能團(tuán),從而形成高度交聯(lián)的剛性聚合物。交聯(lián)劑的使用量對(duì)于分子印跡聚合物的結(jié)合能力和構(gòu)型都有著顯著的影響,過(guò)低易造成聚合物的結(jié)構(gòu)坍塌,過(guò)高則不利于具有選擇性空腔的形成[31]。在磺胺類(lèi)藥物的乙烯基聚合過(guò)程中,最常用的交聯(lián)劑為乙二醇二甲基丙烯酸酯(ethylene glycol dimethacrylate,EGDMA),其他交聯(lián)劑如N,N-二甲基甲酰胺[32]和二乙烯基苯(divinylbenzene,DVB)[24]則只在部分文獻(xiàn)中出現(xiàn)。最新研究中開(kāi)發(fā)的溶膠-凝膠聚合法,如表2[8,18,33]所示,主要使用正硅酸乙酯(tetraethyl orthosilicate,TEOS)作交聯(lián)劑,通過(guò)摻雜熒光量子點(diǎn),利用熒光信號(hào)強(qiáng)度對(duì)SAs進(jìn)行定性定量檢測(cè)。因?yàn)門(mén)EOS聚合條件為常溫、堿性,而SAs在低溫堿性條件下性質(zhì)穩(wěn)定,所以區(qū)別于乙烯基60 ℃的聚合條件[28-29],TEOS作交聯(lián)劑能有效防止SAs在MIP聚合過(guò)程中分解的情況,為MIP形成穩(wěn)定印跡位點(diǎn)提供保障,除此之外,二氧化硅表面含有豐富的羥基[34],可為SAs提供除功能單體外的作用基團(tuán),強(qiáng)化印跡效果。

1.3 致孔劑的選擇

致孔劑的物理和化學(xué)特性對(duì)模板分子和功能單體的預(yù)聚合具有顯著影響力,是決定分子印跡聚合物能夠有效分子識(shí)別的最重要的因素之一。對(duì)于非共價(jià)型分子印跡,水相的溶劑聚合環(huán)境會(huì)降低分子印跡的吸附效果[24],因此非共價(jià)型磺胺類(lèi)分子印跡制備時(shí),多選用非中等極性或非質(zhì)子溶劑,如甲苯、二氯甲烷、氯仿、乙腈等,避免干擾模板分子和功能單體間的絡(luò)合作用。

目前,非共價(jià)型磺胺類(lèi)分子印跡的制備多使用乙腈[8,23,33]作為致孔劑,但嵇大圣[35]通過(guò)Tomasi極化統(tǒng)一模型(polarized continuum mode,PCM)模擬計(jì)算發(fā)現(xiàn),MAA和磺胺在乙腈中的溶劑化能比在氯仿、苯和丙酮中大,即高介電常數(shù)的乙睛溶劑不利于磺胺模板與MAA之間相互絡(luò)合。部分研究就該問(wèn)題開(kāi)始探索新型溶劑,如異辛烷[32]等。Guo等[36]以四氫呋喃作溶劑制得檢測(cè)限為1 ng/g,定量限為3.5 ng/g的分子印跡聚合物,證明了在分子印跡聚合物的致孔劑、溶劑的種類(lèi)選擇上具有廣闊的研究空間。

2 磺胺類(lèi)藥物分子印跡聚合物合成方法的研究現(xiàn)狀

分子印跡制備方法包括:本體聚合法、原位聚合法、沉淀聚合法、分散聚合法、二維分子印跡技術(shù)和表面分子印跡技術(shù)[37]。最常用于磺胺分子印跡的方法分別是本體聚合法和表面印跡法,但因?yàn)楸倔w聚合法擁有作用位點(diǎn)易包埋、成品處理困難等缺陷,僅適用于基礎(chǔ)研究[28-29],所以創(chuàng)新應(yīng)用型的研究?jī)A向于使用表面印跡法。

表面分子印跡技術(shù)是通過(guò)接枝、化學(xué)改性、涂覆等方法使印跡識(shí)別點(diǎn)分布在基體表面的一項(xiàng)技術(shù),解決了傳統(tǒng)方法包埋識(shí)別位點(diǎn)造成應(yīng)用效率不高的問(wèn)題。表面分子印跡的制備過(guò)程可分為三部分,分別是基體、基體表面改性以及印跡?；w的選擇與分子印跡的用途相關(guān),目前常用于磺胺表面分子印跡的基體包括:硅膠或二氧化硅[38-40]、磁珠[41-42]以及其他基體(如:電極[43-44]和高聚物[24,45]等),具體使用情況如表2所示。

表2 磺胺類(lèi)藥物分子印跡聚合物的研究現(xiàn)狀Table 2 Research status of sulfonamide molecularly imprinted polymers

2.1 硅膠表面分子印跡

硅膠作為基體的分子印跡聚合物可作為色譜柱填料應(yīng)用于固相萃取、色譜分離、吸附劑等多個(gè)前處理領(lǐng)域。目前,以硅膠為基體的表面分子印跡是研究重點(diǎn),共分為兩類(lèi),分別是:

2.1.1 傳統(tǒng)二氧化硅基體分子印跡 對(duì)納米二氧化硅顆粒、二氧化硅毛細(xì)管柱等傳統(tǒng)的二氧化硅產(chǎn)品[15,21]進(jìn)行表面分子印跡改性,可有效增大分子印跡的比表面積,有效提高印跡作用位點(diǎn)的吸附效率和利用率。納米二氧化硅顆粒被硅烷偶聯(lián)劑進(jìn)行表面改性,制備出一種包裹著一層印跡膠束結(jié)構(gòu)的球形二氧化硅納米顆粒[15],受基體形貌限制,成品僅作為SPE填料使用,但基體改性方式多,如:具有選擇性的新型限制性存取分子印跡材料(Restricted access-molecularly imprinted material,RA-MIP)[40]。二氧化硅毛細(xì)管柱則可被印跡層涂覆覆蓋,作為選擇性的萃取攪拌棒使用,有效增加了印跡的應(yīng)用途徑。這一類(lèi)型的印跡有較高的吸附效率和利用率,但本質(zhì)還是乙烯基聚合的分子印跡聚合物,易受水的影響,需在有機(jī)溶劑環(huán)境中使用。

2.1.2 新型二氧化硅分子印跡 溶膠-凝膠法在含水介質(zhì)中合成分子印跡二氧化硅(molecularly imprinted silica,MIS)。這類(lèi)聚合物受水等強(qiáng)極性溶劑的影響較小,一定程度上保留了應(yīng)用于模板分子和功能單體在強(qiáng)極性溶劑環(huán)境下的絡(luò)合能力。Ding等[18]將MIS與表面印跡有機(jī)結(jié)合,先讓TEOS在水中進(jìn)行初步聚合,形成摻雜熒光量子點(diǎn)的核殼結(jié)構(gòu),隨后加入模板分子SD、功能單體APTEs形成印跡層,得到摻雜熒光量子點(diǎn)的MIS。由于MIS在聚合階段是在水中進(jìn)行的,因此使用MIS萃取水性樣品時(shí),模板SD的IF值遠(yuǎn)高于另外5種磺胺類(lèi)藥物,特異性顯著。除此之外,MIS還衍生出了凝膠薄膜的狀態(tài)[8],該產(chǎn)品在針對(duì)水性樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí),檢測(cè)限低至0.06 μg/L,靈敏度優(yōu)于大部分商用免疫檢測(cè)產(chǎn)品[46],這一發(fā)現(xiàn),使分子印跡聚合物有望成為獨(dú)立的產(chǎn)品,對(duì)分子印跡應(yīng)用領(lǐng)域的進(jìn)一步擴(kuò)展起到了積極的作用。

2.2 以磁性顆粒為基體的表面分子印跡

磁性顆粒表面分子印跡聚合物是一種以磁珠為核心,油酸[42]或二氧化硅為連接層,分子印跡為外殼的核殼結(jié)構(gòu)[47]聚合物。這個(gè)基體的制作流程則與傳統(tǒng)表面印跡方法類(lèi)似,但需要注意的是,因?yàn)榇胖椴荒芘c印跡層直接連接,所以磁性顆粒表面分子印跡不能如硅膠般根據(jù)使用需求進(jìn)行形貌結(jié)構(gòu)調(diào)整。磁性顆粒作基體的分子印跡聚合物體積普遍較小,Zhao等[48]延用了他在制備2,2-雙(4-羥基苯基)丙烷印跡聚合物時(shí)的方法,制備出內(nèi)徑70 nm、外徑150 nm的核-殼納米氨基官能化磁性印跡聚合物(CS-NR-Mag-MIP)[43],檢測(cè)限低至0.004 μg/L。這個(gè)表面印跡方法在保留了二氧化硅表面印跡的比表面積大的優(yōu)勢(shì)的同時(shí),可利用磁性實(shí)現(xiàn)MIP與樣品的快速分離,具有使用步驟少,操作方便的優(yōu)點(diǎn)。崔一笑[49]利用磁性顆粒MIP可在外加磁場(chǎng)的作用下集中吸附于一處的特點(diǎn),簡(jiǎn)化固相萃取步驟,利用磁性基質(zhì)固相萃取方法分別對(duì)雞肉、牛奶、羊奶樣品進(jìn)行檢測(cè),回收率分別為82.27%～120.93%、78.67%～98.90%、62.66%～94.73%,回收效果較好,但是通過(guò)表2發(fā)現(xiàn),與其他基體的MIP相比,這類(lèi)型的分子印跡聚合物回收率效果中等,部分成品存在檢測(cè)限高的問(wèn)題[42],這可能是因?yàn)榇胖殚g存在磁性吸附關(guān)系,導(dǎo)致磁性MIP易發(fā)生團(tuán)聚,磁性MIP的印跡層利用率相對(duì)下降。

2.3 以其他物質(zhì)為基體的表面分子印跡

通過(guò)使用分子印跡對(duì)化學(xué)傳感器的電極進(jìn)行改造,可使電化學(xué)傳感器有選擇的對(duì)樣品中的目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行定量檢測(cè),實(shí)現(xiàn)電化學(xué)傳感器檢測(cè)的定性定量分析。在電極表面進(jìn)行印跡需要將MIP用低沸點(diǎn)的溶劑分散在電極表面,經(jīng)過(guò)干燥、拋光、水洗等步驟[44],在溶劑揮發(fā)后電極表面形成一層印跡薄膜,即可得到改性電極,通過(guò)研究,已出現(xiàn)了改性碳糊電極(carbon paste electrode,CPE)、石墨烯氧化物(graphene oxide,GO)改性的玻碳電極(glassy carbon electrode,GCE)[50]、改性的表面聲波(surface acoustic wave,SAW)芯片的金電極[45]等,這些電極與電化學(xué)傳感器結(jié)合使用,能有效抑制樣品中雜質(zhì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾、檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定、重現(xiàn)性好、靈敏度高。

至于以聚合物為基體的分子印跡聚合物,主要能起到增大印跡應(yīng)用面積,拓寬印跡使用途徑的目的。Chen等[45]和Diaz-Alvarez等[24]分別嘗試了聚苯乙烯種子微球和聚丙烯中空纖維作基體,制備出的聚合物通過(guò)對(duì)不同組分的提取效率差異,有效分離樣品中的各磺胺類(lèi)抗生素,但如表2所示,該類(lèi)聚合物的檢測(cè)限僅有0.2～3 μg/L[24]，略遜色于另外幾種基體。

3 磺胺類(lèi)藥物分子印跡聚合物在樣品分析中的應(yīng)用

自從Sellergren使用MIP從尿液樣品中萃取出潘他米丁[8],MIP作為固相萃取材料得到了廣泛而深入的研究,隨著市場(chǎng)對(duì)快速檢測(cè)產(chǎn)品的需求增加,磺胺類(lèi)抗生素分子印跡的應(yīng)用正逐漸簡(jiǎn)化,朝快速檢測(cè)產(chǎn)品方向轉(zhuǎn)變。

3.1 作為固相萃取柱的應(yīng)用

磺胺類(lèi)藥物作為水產(chǎn)品養(yǎng)殖業(yè)、畜牧業(yè)中的抗菌劑使用,多出現(xiàn)在畜牧類(lèi)產(chǎn)品中,部分藥物通過(guò)養(yǎng)殖用水流入環(huán)境,因此,該藥物的檢測(cè)樣品集中在環(huán)境樣品和食品樣品中。

MIP作為固相萃取材料應(yīng)用在禽畜類(lèi)產(chǎn)品中時(shí),步驟最復(fù)雜。禽畜類(lèi)產(chǎn)品包括牛奶[51-52]、雞蛋[53]、肉[54]等,富含蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和纖維等大分子,在使用MIP富集前,一般需進(jìn)行初提取以排除樣品中的大分子對(duì)MIP的干擾。牛奶可用少量乙酸鉛溶液沉淀并除去蛋白質(zhì)[51],禽畜肉類(lèi)則需要經(jīng)歷均化、吸水、多種溶劑反復(fù)提取、蒸發(fā)復(fù)溶等一系列步驟[55]。這一類(lèi)樣品的初提取普遍用時(shí)長(zhǎng)、步驟復(fù)雜,萃取效率受待測(cè)物在提取劑中的溶解度等因素影響。若MIP能排除大分子干擾,使禽畜類(lèi)樣品無(wú)需經(jīng)過(guò)復(fù)雜的初提取步驟即可直接應(yīng)用,可有效簡(jiǎn)化MIP使用程序,提高M(jìn)IP使用效率。

水產(chǎn)品樣品和土壤樣品同樣需要進(jìn)行初提取后才能被MIP富集目標(biāo)成分,但相比禽畜類(lèi)產(chǎn)品的初提取步驟,水產(chǎn)品樣品和土壤樣品的初提取步驟更簡(jiǎn)單,只需要使用能快速提取目標(biāo)分子的有機(jī)溶劑提取即可[56]。唯一的難點(diǎn)主要集中在水產(chǎn)品樣品中含水量較高,易出現(xiàn)MIP特異性降低的現(xiàn)象,這個(gè)缺陷可通過(guò)把MIP制作成固相萃取柱,通過(guò)調(diào)整洗滌溶劑的極性和流速,實(shí)現(xiàn)樣品中各組分的有效分離[57-58]。Shi等[23]制備的MIP靜態(tài)吸附時(shí)選擇性較差,但正是利用了各組分在相同溶劑環(huán)境下與功能基團(tuán)作用力的差異,有效分離了樣品中的各磺胺類(lèi)藥物。方法利用了洗滌溶劑在固相萃取過(guò)程中,能在破壞分析物與功能基團(tuán)間相互作用力的同時(shí),保留目標(biāo)待測(cè)物和印跡位點(diǎn)的鍵合能力[59-60]的特點(diǎn),目標(biāo)分子及其結(jié)構(gòu)類(lèi)似物在MIP固相萃取柱中擁有比其他結(jié)構(gòu)更慢的洗脫速度,從而有效區(qū)分目標(biāo)分子及其他組分,同樣適用于水性樣品的直接應(yīng)用。

3.2 在水性樣品中的直接應(yīng)用

理論上,MIP固相萃取柱可以讓實(shí)際含水樣品無(wú)需經(jīng)過(guò)有機(jī)溶劑的提取直接使用,但是真實(shí)水樣中存在多種雜質(zhì),如酸或者鹽等,都會(huì)對(duì)MIP的選擇性進(jìn)行破壞,降低回收率[61]。對(duì)于這類(lèi)雜質(zhì),可以調(diào)節(jié)水性樣品的pH或者讓水性樣品先通過(guò)常規(guī)吸附劑(如C18,DVD)進(jìn)行初步除雜,之后MIP固相萃取柱對(duì)各成分進(jìn)行吸附提取,并和水產(chǎn)品樣品一樣,選用一種不會(huì)破壞MIP各功能位點(diǎn)和待測(cè)目標(biāo)物的洗滌劑,誘導(dǎo)空腔對(duì)目標(biāo)分析物進(jìn)行選擇性保留,最后收集MIP中的目標(biāo)檢測(cè)物,實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品中各組分有效分離[62-64]。一般在檢測(cè)磺胺類(lèi)藥物的時(shí)候,選用甲醇水溶液作洗滌劑除去雜質(zhì)[65],甲醇的比例隨MIP保留能力強(qiáng)度的加強(qiáng)而加強(qiáng)。乙酸∶甲醇(5∶95,v/v)作為洗脫劑萃取,該比例下的甲醇溶液能最大程度上回收MIP中的磺胺類(lèi)藥物[66]。

圖3 手性向列型印跡復(fù)合膜的制備和應(yīng)用流程Fig.3 Preparation and application process of chiral nematic imprinted composite membrane

隨著MIS的發(fā)展與應(yīng)用,分子印跡逐漸擺脫傳統(tǒng)乙烯基聚合法易受水影響導(dǎo)致特異性下降的限制。制備溶劑為水的MIS受水強(qiáng)極性影響較小,摻雜熒光量子點(diǎn)后與熒光檢測(cè)器聯(lián)合使用,可在提高靈敏度的同時(shí)減小樣品的除雜步驟,部分報(bào)道中,水性樣品只需要經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單的過(guò)濾步驟即可直接使用MIS萃取目標(biāo)物質(zhì)[18,33]。MIS的出現(xiàn)進(jìn)一步簡(jiǎn)化了分子印跡的使用流程,提高了分子印跡聚合物成為一種針對(duì)水性樣品的獨(dú)立快檢產(chǎn)品的潛力。

3.3 作為快檢方法的應(yīng)用研究

分子印跡技術(shù)的基本原理是模仿免疫抗原抗體相結(jié)合的特性衍生出的仿生技術(shù),MIS[18,33]和電極[44-45]為基體的分子印跡聚合物一定程度上可作為一種快檢產(chǎn)品直接使用,但由于吸附現(xiàn)象不顯色、現(xiàn)象不明顯等缺陷,需要依附檢測(cè)儀器使用,無(wú)法像免疫抗原抗體法一樣制備出膠體金一類(lèi)的快速檢測(cè)用的試紙條,不利于推廣。部分研究為解決磺胺類(lèi)藥物分子印跡聚合物的應(yīng)用問(wèn)題進(jìn)行探索。Zhang等[67]基于納米晶體纖維素模板化的分子印跡樹(shù)脂制造光學(xué)磺酰胺傳感器技術(shù),合成了手性向列型印跡復(fù)合膜,該薄膜通過(guò)手性向列結(jié)構(gòu)中重新印刷的印跡位點(diǎn),對(duì)磺胺類(lèi)藥物產(chǎn)生黃色變化反應(yīng),觀察該薄膜的顏色反應(yīng)后,可直接選擇出磺胺類(lèi)藥物(圖3)。手性向列型印跡復(fù)合膜對(duì)磺酰胺有選擇性,與免疫抗原抗體法中的試紙條效果相似,有廣泛推廣使用的潛力,但其檢測(cè)限范圍高達(dá)0.05～10 mg/mL,靈敏度不如儀器分析法,若能有效提高該技術(shù)的靈敏度,磺胺類(lèi)抗生素分子印跡快速檢測(cè)技術(shù)將有望實(shí)現(xiàn)進(jìn)一步的推廣和應(yīng)用。

4 結(jié)語(yǔ)

分子印跡聚合物的穩(wěn)定性、制作周期短、低成本和特異選擇性使其能在一定程度上替代酶聯(lián)免疫技術(shù),目前,分子印跡聚合物用于磺胺類(lèi)藥物的分析檢測(cè)已被大量報(bào)道?；前奉?lèi)抗生素分子印跡的優(yōu)化可通過(guò)分析模板分子和功能單體間的非共價(jià)作用力,選用作用位點(diǎn)適中、易形成穩(wěn)定空腔結(jié)構(gòu)的模板分子、功能單體和交聯(lián)劑,實(shí)現(xiàn)分子印跡聚合物性能的優(yōu)化。

磺胺類(lèi)抗生素分子印跡還可以通過(guò)調(diào)整制備工藝進(jìn)行優(yōu)化。制備工藝和應(yīng)用模式存在聯(lián)系,傳統(tǒng)的制備工藝,如本體聚合物法，以二氧化硅、磁珠、高聚物等作為基體的表面分子印跡聚合法等制備的MIP多作為固相萃取材料,應(yīng)用于常規(guī)肉類(lèi)食品之中,這部分的技術(shù)最為成熟,部分技術(shù)已轉(zhuǎn)化為產(chǎn)品投入市場(chǎng),如:MIP Technologies(瑞典Lund)和Semorex(North Brunswick,NJ,USA)[68]等。溶膠-凝膠法制備的MIS則是分子印跡技術(shù)在水性樣品中使用的主要趨勢(shì),雖然在大多數(shù)情況下,目標(biāo)分子在水性介質(zhì)中的直接選擇性結(jié)合仍然是困難的案例,但具有成為快速檢測(cè)單一產(chǎn)品的潛力。此外,基于納米晶體纖維素模板化的分子印跡樹(shù)脂制造光學(xué)磺酰胺傳感器技術(shù)合成的手性向列型印跡復(fù)合膜,使分子印跡技術(shù)能以試紙條的形式應(yīng)用于實(shí)際樣品,有望實(shí)現(xiàn)磺胺類(lèi)分子印跡技術(shù)的商業(yè)化,但目前該技術(shù)仍有改進(jìn)空間。