殼聚糖復(fù)合硅酸鈉對(duì)冬棗采后苯丙烷代謝及病程相關(guān)蛋白的影響

張靜茹,張樂樂,常璐璐,張少穎

(山西師范大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,山西臨汾 041004)

冬棗為鼠李科(Rhamnaceae)棗屬(Zizyphus),別名冰糖棗、蘋果棗、雁來紅、凍棗[1]。因其果皮薄,果肉脆甜,果核小,可食率高且富含豐富的維生素、多種礦物質(zhì)、多酚、花色苷以及抗癌物質(zhì)環(huán)磷酸腺苷(cAMP)和環(huán)磷酸鳥苷(cGMP),成為被大眾所喜愛的一種鮮食棗品。然而其采后呼吸強(qiáng)度大,對(duì)空氣中的CO2敏感,極易失水、褐變、軟化、酒化和腐爛,在常溫條件下貯藏3 d左右就會(huì)失水、軟化、霉?fàn)€[2]。在冬棗收獲、儲(chǔ)存、加工和運(yùn)輸?shù)倪^程中都容易出現(xiàn)由鏈格孢菌(A.alternata)引起的黑斑病,導(dǎo)致冬棗腐爛。這不僅造成了冬棗的品質(zhì)下降,更造成了經(jīng)濟(jì)上的損失。有研究表明A.alternata還可在寄主細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生真菌毒素,對(duì)人體健康造成潛在危害[3]。近年來主要采用化學(xué)殺菌劑來控制真菌引起的病害。但是,化學(xué)殺菌劑的使用會(huì)造成環(huán)境污染、菌株抗藥性增強(qiáng)、致癌作用等問題,尋找無污染、無公害的新的防治植物采后病害的方法成為當(dāng)務(wù)之急。

殼聚糖(CTS)是甲殼素脫乙?；a(chǎn)生的一種多糖類物質(zhì)。因其具有無毒無味、生物可降解性、選擇透過性和抑菌性等優(yōu)點(diǎn),已被廣泛應(yīng)用于果蔬貯藏[4]。CTS可抑制或者殺滅水果上的多種病原菌,例如鏈格孢菌、灰霉菌、枯草芽孢桿菌[5]等。有研究表明,CTS能夠增強(qiáng)馬鈴薯[6]的苯丙烷類代謝酶的活性以及提高梨[7]防御相關(guān)酶的活性。謝春暉[8]發(fā)現(xiàn)用不同濃度CTS處理冬棗,與其他處理冬棗相比,1% CTS涂膜處理效果最佳,冬棗腐爛率最低,硬度、可滴定酸下降最緩慢。

硅作為地球表面第二大元素,在植物抗病性方面有著重要的作用。硅酸鈉作為硅的供體,可抑制杏果實(shí)[9]和冬棗[10]黑斑病等。Na2SiO3可以通過苯丙烷途徑激活活性氧代謝從而提高果實(shí)的抗逆性,保持果蔬品質(zhì)[11]。Na2SiO3與其他抗菌試劑的復(fù)合處理也能增強(qiáng)果實(shí)的抗病性,有研究報(bào)道Na2SiO3與脫氫乙酸鈉聯(lián)合使用對(duì)在貯藏期間柑橘果實(shí)酸腐病菌(Geotrichumcitri-aurantii)引起的酸腐病有顯著的抑制作用[12]。CTS和Na2SiO3處理對(duì)冬棗采后抗病性的影響已有研究,但二者結(jié)合使用對(duì)于果蔬的抗病性影響研究較少。通過結(jié)合使用可以發(fā)揮各自的特性,提高保鮮的總體效果。因此,本實(shí)驗(yàn)旨在研究CTS和Na2SiO3復(fù)合處理對(duì)冬棗果實(shí)苯丙烷代謝及相關(guān)防御酶的影響,以期豐富CTS和Na2SiO3復(fù)合處理在果蔬采后抗性誘導(dǎo)作用方面的研究,同時(shí)為果蔬采后病害防治提供一種新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試白熟期冬棗采自山西省臨汾市堯鄉(xiāng)冬棗種植基地,手工采摘,裝箱后迅速運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室,挑選大小均一、無病蟲害機(jī)械損傷的冬棗作為試驗(yàn)用果;鏈格孢菌(A.alternata) 在PDA上培養(yǎng)備用，北納生物有限公司;殼聚糖(相對(duì)分子質(zhì)量:15～20萬之間;脫乙酰度:87%～90%) 山東奧康科技公司;硅酸鈉、硼砂、雙氧水、氫氧化鈉 分析純,天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司;聚乙烯吡咯烷酮 Sigma;L-苯丙氨酸 天津博迪化工股份有限公司;愈創(chuàng)木酚 武漢東康源科技有限公司;p-香豆酸 上海邦景事業(yè)有限公司;β-巰基乙醇、福林酚 山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司。

759S紫外可見分光光度計(jì) 上海棱光技術(shù)有限公司;IMS-40全自動(dòng)雪花制冰機(jī) 常熟市雪科電器有限公司;CP214電子天平 常州奧豪斯儀器有限公司;H1850R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司;MDF-U53V超低溫冰箱 日本三洋集團(tuán);SpectraMax M2/M2e酶標(biāo)儀 上海普迪生物科技有限公司;DZKW-D-4恒溫水浴鍋 上?？坪銓?shí)業(yè)發(fā)展有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 孢子懸浮液的配制 參照He等的方法[13],將斜面鏈格孢菌接種于PDA平板上,在28 ℃下恒溫培養(yǎng)7～10 d。孢子成熟后,用含有0.05% 吐溫20的生理鹽水將其從平板上刮下,用雙層紗布過濾掉多余菌絲,在顯微鏡下觀察計(jì)數(shù),將其最終孢子懸浮液的濃度調(diào)成1×105個(gè)/mL。

1.2.2 損傷接種及取樣 將冬棗平均分成5組,分別用蒸餾水、1% CTS、1% CTS+10 mmol/L Na2SiO3、1% CTS+40 mmol/L Na2SiO3、1% CTS+160 mmol/L Na2SiO3浸泡5 min,自然晾干。每組100個(gè)冬棗,重復(fù)三次。用打孔器在冬棗的赤道處打出一個(gè)深2 mm,直徑為3 mm的小孔,放置1 h。將5 μL孢子懸浮液打入小孔內(nèi),將接種后的果實(shí)放入大保鮮盒內(nèi),用保鮮膜封口。室溫(22 ℃),相對(duì)濕度(RH)90%下貯藏,每隔4 d取樣,進(jìn)行病斑直徑的測(cè)定。

取冬棗損傷處皮下0.2～10 mm范圍內(nèi)的果肉,液氮冷凍后磨粉,保存在-80 ℃的超低溫冰箱,用于后期指標(biāo)的測(cè)定。

1.2.4 苯丙烷類代謝相關(guān)酶活性的測(cè)定 苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的測(cè)定參照曹建康等[14]的方法,適當(dāng)修改。取4 g棗粉,加入4 mL提取液(含有40 g/L PVPP、2 mmol/L EDTA和5 mmol/Lβ-巰基乙醇)。4 ℃、12000×g離心30 min,收集上清液,即為提取酶液。PAL反應(yīng)體系為3 mL 50 mmol/L pH8.8的硼酸緩沖液、0.5 mL 20 mmol/L L-苯丙氨酸溶液、0.5 mL酶液。煮沸 6 min作為對(duì)照,37 ℃下保溫1 h,加入0.1 mol 6 mol/L HCl終止反應(yīng),在290 nm處測(cè)定其吸光度值。以每小時(shí)每克冬棗實(shí)(鮮重)酶促反應(yīng)體系吸光度值增加0.01為1個(gè)PAL活性單位(U),單位是U·h-1·g-1FW。

肉桂酸4-羧化酶(C4H)的測(cè)定方法參照范存斐等[15]的方法,適當(dāng)修改。取1 g棗粉,加入3 mL提取液(50 mmol/L pH8.9 Tris-HCl,15 mmol/Lβ-巰基乙醇、4 mmol/L MgCl2、5 mmol/L VC、5 μmol/L亮肽素、5 mmol/L PMSF、0.15% PVP、10%甘油),4 ℃、12000×g離心25 min,取上清液為提取酶液。反應(yīng)體系包括0.8 mL酶液,2.2 mL緩沖液(50 mmol/L pH8.9 Tris-HCl、2 μmol/L反式肉桂酸、2 μmol/L NADPNa、5 μmol/L G-6-PNa2),加入0.1 mL 6 mol/L HCl終止反應(yīng)。在340 nm處測(cè)定其吸光度值。OD值每分鐘變化0.01作為一個(gè)酶的活性單位,單位是U·min-1·g-1FW。

4-香豆酰-輔酶A連接酶(4CL)的測(cè)定方法參照張杼潤(rùn)等[16]方法,適當(dāng)修改。取2 g棗粉,加入6 mL預(yù)冷的0.2 mol/L的Tris-HCl(含有25%甘油和0.1 mol/L DTT,pH為8.0)緩沖液,4 ℃、12000×g離心20 min,取上清液為提取酶液。1 mL酶液中依次加入1.5 mL反應(yīng)液(含有0.9 mL 15 μmol/L MgSO4、0.3 mL 5 μmol/L P-香豆酸、0.3 mL 5 μmol/L CoA)、0.3 mL 50 μmol/L ATP,40 ℃水浴10 min后加入0.1 mol 6 mol/L HCl終止反應(yīng),在333 nm處測(cè)定其吸光度值。OD值每分鐘變化0.1 作為一個(gè)酶的活性單位(U),單位是U·min-1·g-1FW。

POD活性的測(cè)定參照曹建康等[14]的方法。取3 g棗粉,加入3 mL提取緩沖液(含1 mmol/L PEG、4% PVPP、1% TritonX-100)混勻后于4 ℃、12000×g離心30 min,取上清液為提取酶液。0.5 mL酶液中加入3 mL 25 mmol/L愈創(chuàng)木酚溶液,0.2 mL 0.5 mmol/L H2O2混勻,470 nm處測(cè)定吸光度值的變化。以每分鐘吸光度變化1所需的酶量為一個(gè)POD單位,單位是U·min-1·mg-1protein。

1.2.5 總酚、類黃酮和木質(zhì)素的測(cè)定 總酚含量的測(cè)定參照Xiao等[17]方法并修改。配制含有0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16、0.18 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)沒食子酸溶液。取0.2 mL各濃度標(biāo)準(zhǔn)液,加入2 mL Folin-Ciocalteau試劑(稀釋10倍)混勻后室溫放置5 min,然后加入2 mL 10% Na2CO3溶液,室溫避光放置90 min,在765 nm測(cè)定其吸光度值。以吸光度對(duì)濃度進(jìn)行線性回歸分析,求得回歸方程和決定系數(shù)分別為A=4.3216C+0.0694,R2=0.997。取0.5 g棗粉,加入4 mL 80%的乙醇,混勻后于4 ℃、8000×g離心20 min。取0.2 mL上清液,依次加入Folin-Ciocalteau、Na2CO3溶液,測(cè)量方法與制作標(biāo)曲方法相同。樣品中總酚的含量用沒食子酸當(dāng)量(mg·g-1)來表示。

類黃酮含量的測(cè)定參照J(rèn)ia等[18]方法并修改。配制含有0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。各取0.1 mL,加入0.3 mL 5% NaNO2搖勻后靜置5 min,加入0.3 mL 10% Al(NO3)3放置6 min。最后加入2 mL 1 mol/L NaOH溶液,室溫下放置15 min,在510 nm處測(cè)定其吸光度值。以吸光度對(duì)濃度進(jìn)行線性回歸分析,求得回歸方程和決定系數(shù)分別為A=0.0732C-0.0067,R2=0.9967。樣液的制備與測(cè)量總酚方法相同。取0.1 mL上清液,依次加入NaNO2、Al(NO3)3、NaOH溶液,測(cè)量方法與制作標(biāo)曲方法相同。樣品中的黃酮含量用蘆丁的當(dāng)量(mg·g-1)來表示。

木質(zhì)素含量的測(cè)定參照Morrison[19]方法并作修改。取1 g棗粉加入4 mL預(yù)冷的95%乙醇混勻,于4 ℃、12000×g離心10 min。沉淀物用95%乙醇沖洗3次,再用乙醇∶正己烷=1∶2 (v/v)沖洗3次。收集沉淀干燥,干燥后加入1 mL 25%溴乙酰,70 ℃恒溫水浴30 min。加入1 mL 2 mol/L NaOH溶液中止反應(yīng)。再加入2 mL冰醋酸和0.1 mL 7.5 mol/L鹽酸羥胺。再次離心,取上清液0.25 mL用醋酸定容至5 mL。在280 nm處測(cè)定其吸光度值。木質(zhì)素含量用OD280·g-1FW表示。

在明確了著作權(quán)所特有的性質(zhì)后，我們就可得知，未經(jīng)許可演繹人取得著作權(quán)后，法律并未賦予其以法律規(guī)定以外的方式利用其作品的權(quán)利。其是否有權(quán)對(duì)其作品實(shí)施控制，仍須得到原作品著作權(quán)人的許可。這是因?yàn)椋睦镉歇?dú)創(chuàng)性表達(dá)，哪里就有保護(hù)，未經(jīng)許可演繹作品中包含有原作品著作權(quán)人的獨(dú)創(chuàng)性表達(dá)，因此原作品著作權(quán)人可依法對(duì)未經(jīng)許可演繹作品進(jìn)行控制，以禁止或許可未經(jīng)許可演繹人乃至于第三人利用未經(jīng)許可演繹作品。而賦予未經(jīng)許可演繹人著作權(quán)，僅賦予了其許可或禁止他人以特定方式利用其作品的權(quán)利。他人欲利用未經(jīng)許可演繹作品，需獲得雙重許可，除了得到未經(jīng)許可演繹人的許可之外，還須得到原作品著作權(quán)人的許可。

1.2.6 病程相關(guān)酶活性的測(cè)定 CHT活性的測(cè)定參照曹建康等[14]的方法。取3 g棗粉,加入5 mL預(yù)冷丙酮,混勻后于4 ℃、12000×g離心30 min。反應(yīng)體系中依次加入0.5 mL 50 mmol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH=5.2)、0.5 mL 10 g/L 膠狀幾丁質(zhì)懸浮液,反應(yīng)管和對(duì)照管各加入 0.5 mL酶液,對(duì)照管煮沸5 min。反應(yīng)管37 ℃水浴1 h后加入0.1 mL 30 g/L的脫鹽蝸牛酶混勻繼續(xù)水浴1 h,然后加入0.2 mL 0.6 mol/L四硼酸鉀溶液,煮沸3 min后迅速冷卻,于585 nm處測(cè)定吸光度值。酶活性單位是U·mg-1protein。

PPO活性的測(cè)定參照曹建康等[14]的方法。粗酶液與POD活性測(cè)定的提取方法相同。反應(yīng)體系中依次加入2 mL 50 mmol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH=5.5)、1 mL 50 mmol/L鄰苯二酚溶液,最后加入0.1 mL酶液。于420 nm處測(cè)定吸光度值的變化,以每分鐘吸光度變化增加1為一個(gè)活性單位,單位是U·min-1·mg-1protein。

GLU活性的測(cè)定參照曹建康等[14]的方法。粗酶液與CHT活性測(cè)定的提取方法相同。反應(yīng)體系加入100 μL 4 g/L的昆布多糖、100 μL酶液,煮沸5 min的酶液作為對(duì)照。反應(yīng)管37 ℃水浴40 min后,依次加入1.8 mL蒸餾水、1.5 mL DNS試劑,沸水加熱5 min,用蒸餾水稀釋至20 mL,混勻。于540 nm處測(cè)定吸光度值。酶活性單位是U·mg-1protein。

1.3 數(shù)據(jù)處理

以上指標(biāo)均取3個(gè)平行樣,重復(fù)測(cè)定3次。使用Excel 2010計(jì)算平均值并繪制圖表,SPSS statistics 20進(jìn)行Duncan’s多重比較進(jìn)行差異分析。圖中不同字母表示差異顯著(P<0.05)。使用Adobe Photoshop CC 2018作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 CTS+Na2SiO3處理對(duì)果實(shí)病斑直徑的影響

貯藏期間冬棗病斑直徑逐漸增大,且處理組的病斑直徑顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。前12 d各處理組之間并差異不明顯,貯藏后期整體來說CTS+Na2SiO3處理效果優(yōu)于CTS單獨(dú)處理(圖1和圖2)。第20 d CTS處理組的病斑直徑比復(fù)合40、160 mmol/L Na2SiO3處理組的高出36.29%、21.11%。CTS+40 mmol/L Na2SiO3處理組對(duì)病斑直徑的抑制效果最好,因此,選擇CTS+40 mmol/L Na2SiO3處理組進(jìn)行后續(xù)指標(biāo)的分析。

圖1 CTS+Na2SiO3處理對(duì)冬棗挑戰(zhàn)接種A. alternata病斑直徑的影響Fig.1 Effects of CTS+Na2SiO3 treatment on colony diameterin winter jujube inoculated with A. alternata注:不同小寫字母表示不同處理組間差異顯著(P<0.05)。

2.2 CTS+Na2SiO3處理對(duì)果實(shí)苯丙烷代謝相關(guān)酶活性的影響

圖2 CTS+Na2SiO3處理對(duì)冬棗挑戰(zhàn)接種A. alternata貯藏20 d后各處理的病斑擴(kuò)展情況Fig.2 Effects of CTS+Na2SiO3 treatment on theexpansion of lesions in winter jujube inoculatedwith A. alternata after storage for 20 d注:對(duì)照(a);1% CTS處理(b);1% CTS+10 mmol/LNa2SiO3處理(c);1% CTS+40 mmol/L Na2SiO3處理(d);1% CTS+40 mmol/L Na2SiO3處理(e)。

PAL、C4H、4CL是苯丙烷代謝途徑中的三個(gè)關(guān)鍵酶,POD處于苯丙烷代謝途徑末端[20]。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng),果實(shí)中PAL、C4H的活性呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì),且在第12 d出現(xiàn)活性高峰(圖3A、B)。從第8 d開始處理組與對(duì)照組出現(xiàn)顯著差異(P<0.05)。在第20 d CTS+Na2SiO3處理組PAL、C4H比對(duì)照組分別高出37.16%、120.48%。如圖3C所示,4CL的活性呈上升趨勢(shì)且復(fù)合處理組的活性高于對(duì)照組,貯藏4 d之后差異顯著(P<0.05)。尤其是在第8 d,CTS+Na2SiO3處理組是對(duì)照組4CL活性的1.73倍。貯藏期間棗果實(shí)中POD的變化趨勢(shì)與C4H相似,但其活性峰值出現(xiàn)在第8 d(圖3D)，比C4H活性高峰提前4 d出現(xiàn)。

2.3 CTS+Na2SiO3處理對(duì)果實(shí)總酚、類黃酮和木質(zhì)素的影響

總酚、類黃酮、木質(zhì)素是苯丙烷代謝途徑的重要產(chǎn)物。總酚和類黃酮是苯丙烷代謝的最終產(chǎn)物,與植物抗氧化活性[21]及果實(shí)抗病性密切相關(guān)。如圖4A、4B所示,在整個(gè)貯藏期間,CTS+Na2SiO3處理組與對(duì)照組的總酚與類黃酮含量均呈先下降再上升最后下降趨勢(shì),在第12 d出現(xiàn)峰值。CTS+Na2SiO3處理在貯藏中后期(8～20 d)顯著提高了棗果實(shí)的總酚、類黃酮含量(P<0.05)。貯藏結(jié)束時(shí),CTS+Na2SiO3處理組果實(shí)的總酚、類黃酮含量分別比對(duì)照組高17.34%、6.18%。

圖4 CTS+Na2SiO3處理對(duì)冬棗挑戰(zhàn)接種A. alternata苯丙烷代謝產(chǎn)物的影響Fig.4 Effect of CTS+Na2SiO3 treatment on metabolites ofphenylpropan in winter jujube inoculated with A. alternata注:總酚含量(A)、類黃酮含量(B)和木質(zhì)素含量(C)。

木質(zhì)素是植物細(xì)胞壁成分之一,可以通過與細(xì)胞壁的結(jié)合使植物組織木質(zhì)化,保護(hù)細(xì)胞免受病原菌的侵害。如圖4C所示,各處理?xiàng)椆麑?shí)中的木質(zhì)素含量呈先上升后下降的趨勢(shì),在第8 d達(dá)到峰值且第12 d CTS+Na2SiO3復(fù)合處理木質(zhì)素含量比對(duì)照組高11.02%。CTS+Na2SiO3復(fù)合處理冬棗的木質(zhì)素含量在貯藏8～20 d內(nèi)均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

2.4 CTS+Na2SiO3處理對(duì)CHT、PPO和GLU活性的影響

CHT是一種存在于植物中以幾丁質(zhì)為底物的一種水解酶,GLU的水解底物是某些真菌和一些病原菌細(xì)胞壁的主要成分,這兩種酶對(duì)于植物防衛(wèi)反應(yīng)具有協(xié)同作用。各處理組在貯藏過程中的CHT、GLU活性均先升高后降低,對(duì)照外CHT的活性高峰出現(xiàn)在第8 d,GLU的活性高峰推遲4 d出現(xiàn)(圖5A和圖5B),其酶活性分別是對(duì)照組的2.5倍和1.47倍。復(fù)合處理組CHT、GLU活性從第8 d開始顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

PPO可以將植物中的酚類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為醌和單寧從而抑制病原菌的擴(kuò)散。貯藏期間PPO的活性呈上升趨勢(shì),且在第12～16 d之間對(duì)照組活性顯著高于復(fù)合處理組(P<0.05,圖5C)。

圖5 CTS+Na2SiO3處理對(duì)冬棗挑戰(zhàn)接種A. alternata病程相關(guān)酶活性的影響Fig.5 Effect of CTS+Na2SiO3 treatment on theactivities of enzymes related to the pathogenesisin winter jujube inoculated with A. alternata注:CHT活性(A)、PPO活性(B)和GLU活性(C)。

3 討論

苯丙烷途徑是植物特有的次生代謝途徑,植物受到逆境脅迫時(shí),其代謝產(chǎn)物酚類、類黃酮可以作為抗病毒劑,保護(hù)植物免受生物或非生物脅迫,并且賦予果蔬顏色及味道[25]。PAL是苯丙烷衍生物途徑中的第一個(gè)關(guān)鍵限速酶,可以催化苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為反式肉桂酸。C4H將反式肉桂酸轉(zhuǎn)化為P-香豆酸。4CL是苯丙烷途徑中最后一個(gè)關(guān)鍵酶,可以催化肉桂酸為相應(yīng)的輔酶A酯,控制苯丙烷代謝主途徑向分支途徑轉(zhuǎn)折,其下游次級(jí)代謝產(chǎn)物為花青素、水楊酸、木質(zhì)素等其他參與抗性反應(yīng)的物質(zhì)[26]。CTS可以誘導(dǎo)植物產(chǎn)生萜類、異黃酮、生物堿等植保素,進(jìn)而誘導(dǎo)抗性蛋白活性提高并且木質(zhì)素含量增加。CTS處理蘋果后,其PAL 和 POD 活性增加,總酚、類黃酮和木質(zhì)素的含量也有所上升[27]。研究表明Na2SiO3處理可以提高SOD、PAL活性,誘導(dǎo)杏果實(shí)總酚、木質(zhì)素增加,提高杏果實(shí)的活性氧與苯丙烷代謝[11]。魏娟等[28]研究表明Na2SiO3處理提高了甜瓜果實(shí)PAL、CHS基因mRNA的表達(dá)量,說明Na2SiO3處理可在基因轉(zhuǎn)錄水平上促進(jìn)苯丙烷代謝途徑的關(guān)鍵酶的表達(dá),從而提高果實(shí)抗病性。本研究表明,CTS+Na2SiO3處理冬棗,激活了PAL、C4H、4CL及POD等苯丙烷代謝相關(guān)酶的活性,且增加了總酚、類黃酮、木質(zhì)素等苯丙烷代謝產(chǎn)物的含量。總酚、類黃酮、木質(zhì)素的增加可能與PAL活性的增加有關(guān),第12 d時(shí)PAL、總酚、類黃酮同時(shí)達(dá)到峰值,但木質(zhì)素含量在第8 d達(dá)到峰值,說明CTS+Na2SiO3處理可能通過其他途徑誘導(dǎo)木質(zhì)素的形成。4CL也可以通過催化香豆酸合成酚類物質(zhì)前體,其活性高低與其他苯丙烷代謝酶的平衡可調(diào)節(jié)酚類物質(zhì)的合成有關(guān)[29]。POD參與了木質(zhì)素的合成,并且氧化酚類物質(zhì)形成對(duì)病原菌毒害較大的醌類物質(zhì)[27]。木質(zhì)素含量的提高可以增強(qiáng)果實(shí)細(xì)胞壁抵御病原菌的能力。這表明CTS+Na2SiO3可通過調(diào)節(jié)植物的苯丙烷代謝酶的活性及產(chǎn)物積累,增強(qiáng)冬棗的抗病性,維持其采后品質(zhì)。

病程相關(guān)蛋白是指植物在病理或病理相關(guān)的環(huán)境下產(chǎn)生的一類可以直接攻擊病原菌的蛋白,受病原菌或者其他外部脅迫誘導(dǎo)表達(dá),與植物的抗病性及其適應(yīng)環(huán)境脅迫有重要作用。CHT與GLU的底物分別是真菌細(xì)胞壁中的幾丁質(zhì)與葡聚糖,可水解真菌細(xì)胞壁,從而具有抗真菌作用。Meng等[30]發(fā)現(xiàn)CTS處理?yè)p傷接種后的梨果實(shí),會(huì)顯著增強(qiáng)其CHT、GLU、POD的活性,并抑制病原菌的生長(zhǎng)。本研究發(fā)現(xiàn),CTS+Na2SiO3處理冬棗提高其CHT、GLU活性,但抑制其PPO活性。這與CTS處理F.sulphureum挑戰(zhàn)接種馬鈴薯塊莖研究結(jié)果相反[31]。可能是CTS+Na2SiO3復(fù)合處理改變了果蔬的內(nèi)部環(huán)境,也可能是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)材料和病原菌的不同引起了差異。同時(shí),實(shí)驗(yàn)結(jié)果也暗示,CTS+Na2SiO3復(fù)合處理并不能通過提高PPO活性來抑制A.alternata引起的冬棗腐爛。CTS+Na2SiO3處理增加了果實(shí)抗病性,不僅表現(xiàn)在苯丙烷代謝的增強(qiáng),也表現(xiàn)在抑制病原菌和采后病害的發(fā)生。CHT、GLU、PAL、POD活性增加,可以抵御病原菌的擴(kuò)張。CTS+Na2SiO3處理對(duì)A.alternata抑制作用及其如何在果實(shí)內(nèi)部發(fā)揮信號(hào)分子作用還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

1% CTS+40 mmol/L Na2SiO3能有效地控制冬棗采后病害的發(fā)生,貯藏效果最佳。CTS+Na2SiO3復(fù)合處理采后冬棗,可減少病斑直徑的擴(kuò)展;增加苯丙烷途徑相關(guān)酶PAL、C4H、4CL、POD活性,并且促進(jìn)了苯丙烷途徑產(chǎn)物總酚、類黃酮、木質(zhì)素的形成;提高了抗病相關(guān)蛋白CHT、GLU活性,但不能誘導(dǎo)PPO活性的升高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,CTS+Na2SiO3復(fù)合處理能調(diào)節(jié)冬棗的苯丙烷代謝,誘導(dǎo)病程相關(guān)蛋白活性升高,從而增強(qiáng)冬棗的抗病性。