基于膽酸鹽吸附作用的藜麥蛋白質(zhì)酶解工藝研究

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(1.成都大學農(nóng)業(yè)農(nóng)村部雜糧加工重點實驗室,四川成都 610106;2.成都大學醫(yī)學院,四川成都 610106)

藜麥(ChenopodiumquinoaWilld.),又名南美藜、藜谷等,為莧科藜屬植物,營養(yǎng)價值高,被譽為“超級谷物”[1]。研究表明藜麥蛋白質(zhì)平均含量高達15%,高于水稻、大麥和玉米等大多數(shù)谷類[2],藜麥蛋白質(zhì)中氨基酸組成和比例均衡,其蛋白質(zhì)生物學價值和牛奶相當[3],具有降低膽固醇[4-5]、抑制脂質(zhì)過氧化[6]和抗氧化[7]等生物活性,近年來作為保健食品被廣泛推薦。體內(nèi)膽固醇含量的升高是引發(fā)高脂血癥(hyperlipidemia,HLP)的重要原因。膽固醇在體內(nèi)分解形成膽酸鹽,膽酸鹽可以被吸附并排出體外,從而促進膽固醇的降解代謝，達到降血脂的目的,大量研究表明對膽酸鹽的吸附作用可以有效地反映降血脂活性,大量學者用其作為研究降血脂活性的一個重要指標[8-9]。

藜麥作為一種優(yōu)質(zhì)的高蛋白雜糧,目前研究者對藜麥蛋白質(zhì)的提取方法和基本功能特性等方面進行了大量研究[10-12],對其具有生物活性的多肽研究較少,主要集中在抗氧化肽的制備和分離方面[13-14]。和繼剛等[15]采用酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶酶解藜麥蛋白提取液,結(jié)果表明木瓜蛋白酶酶解制得抗氧化肽對DPPH自由基清除率高達95.66%。Alice B等[16]采用兩種蛋白酶酶解藜麥蛋白質(zhì),并研究酶解物體外抑制DPP-IV和抗氧化能力,結(jié)果發(fā)現(xiàn),藜麥蛋白質(zhì)酶解物抑制DPP-IV的能力較好,可能存在潛在的降血糖成分。但是,對具有其他生物活性的藜麥活性肽的酶解工藝、酶解條件優(yōu)化等研究較少。

有研究發(fā)現(xiàn),酶解法由于其效率高、反應條件溫和、處理量大、成本低是制備活性肽最常用的方法[17]。因此,本文以藜麥蛋白質(zhì)為研究對象,采用不同種類的蛋白酶將其酶解制備藜麥活性肽,以水解度(DH)和體外膽酸鹽吸附作用為指標綜合評價,篩選出酶解產(chǎn)物水解度(DH)高、膽酸鹽吸附作用較好的反應蛋白酶,然后以酶添加量、酶解溫度、酶解pH、酶解時間和底物濃度為因素,設(shè)計單因素實驗和正交試驗,優(yōu)化并得到最佳酶解工藝,制備水解度(DH)較高、膽酸鹽吸附作用較好的藜麥活性肽,為藜麥活性肽的深入研究奠定基礎(chǔ),為進一步研究藜麥蛋白質(zhì)的生物活性功能提供一定的理論基礎(chǔ),以期為藜麥蛋白質(zhì)及其生物活性肽的產(chǎn)品開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藜麥種子 成都大學農(nóng)業(yè)農(nóng)村部雜糧加工重點實驗室提供,品種為農(nóng)藜3號;木瓜蛋白酶(2000 U/mg) 批號MO501A,美侖生物技術(shù)有限公司;堿性蛋白酶(10萬U/g) 批號M0316A,美侖生物技術(shù)有限公司;中性蛋白酶(20萬U/g) 批號M0301A,美侖生物技術(shù)有限公司;風味酶(20 U/mg) 批號P13D9B77250,源葉生物科技有限公司;牛血清白蛋白 批號170615,如吉生物科技有限公司;G-250考馬斯亮藍 批號2016050101,成都市科龍化工試劑廠;膽酸鈉 批號F1112A,美侖生物技術(shù)有限公司;?；悄懰徕c 批號J0421A,美侖生物技術(shù)有限公司;正己烷、甲醛、30%過氧化氫、氫氧化鈉、鹽酸、磷酸、磷酸二氫鉀、硫酸、糠醛 以上試劑均為國產(chǎn)分析純。

SynergyHTX型酶標儀 美國Bio Tek公司;TDL-4A型高速離心機 上海菲恰爾分析儀器有限公司;HH-S型恒溫水浴鍋 江蘇正基儀器有限公司;DF-101S型磁力攪拌器 鄭州匯成科工貿(mào)有限公司;SCIENTZ-18N型多歧管普通型冷凍干燥機 寧波新芝凍干設(shè)備股份有限公司;FE20型PH計 梅特勒-托利多;TGL-16C型離心機 上海安亭科學儀器廠;CHA-S型恒溫振蕩器 常州澳華儀器有限公司;CPA2250型分析天平 Sartorius。

1.2 實驗方法

1.2.1 藜麥蛋白質(zhì)的提取 采用堿溶酸沉法提取藜麥蛋白質(zhì)。參照文獻[12]的方法,略有改動。

藜麥用溫水洗滌3次以除去皂苷,45 ℃烘干至水分含量(10%±1%)。將烘干后的藜麥粉碎過80目篩,用正己烷脫脂(藜麥粉:正己烷=1∶5 (v/v)),室溫下攪拌1 h后抽濾,重復2次,抽濾后的藜麥粉揮發(fā)12 h以去除殘留的正己烷。脫脂藜麥粉按料水比1∶12,pH=11.0(用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié))、溫度45 ℃的條件下攪拌提取3 h,提取過程隔30 min檢測一次提取液pH,若pH不為11.0,則用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至11.0。浸提后的產(chǎn)物4000 r/min離心30 min,收集上清液,之后在相同條件下進行第2次浸提,合并2次上清液并用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至4.5,靜置30 min后3000 r/min離心20 min,收集沉淀,用去離子水洗滌2次除去可溶性鹽后調(diào)節(jié)pH至7.0,沉淀冷凍干燥得到藜麥粗蛋白質(zhì)。

1.2.2 藜麥蛋白質(zhì)酶解工藝 分別按照風味蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶的常見酶解條件對藜麥蛋白質(zhì)進行酶解,不同蛋白酶酶解的用量及反應條件見表1,以酶解度(DH)和膽酸鹽吸附作用為指標,篩選出對藜麥蛋白質(zhì)酶解效果較好的蛋白酶作為后續(xù)試驗的蛋白酶。精密稱取藜麥蛋白質(zhì)400.00 mg于100 mL錐形瓶中,加蒸餾水配制成2%的藜麥蛋白質(zhì)溶液,用0.1 mol/L NaOH或稀鹽酸溶液調(diào)節(jié)至添加酶的酶解反應pH,放入預先設(shè)定好蛋白酶反應溫度的水浴鍋中孵育,加入蛋白酶,每隔30 min測定酶解液的pH,并用0.1 mol/L NaOH或稀鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH,使酶解液的pH始終基本保持在蛋白酶的酶解反應pH。酶解反應完成后放入95 ℃水浴鍋中滅活10 min,取出放冷,調(diào)節(jié)pH至7.0,8000 r/min離心10 min除去尚未溶解的酶及沉淀物,收集上清液置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 不同蛋白酶酶解的用量及反應條件Table 1 Dosage and reaction conditions ofenzymatic hydrolysis of different kinds of proteases

1.2.3 酶解單因素實驗 根據(jù)1.2.2的實驗結(jié)果,選擇酶解效果較好的風味蛋白酶,以水解度(DH)和體外膽酸鹽吸附作用為評價指標,在其他條件固定為pH6.0,酶添加量5000 U/g,酶解時間2 h,底物濃度2%,酶解溫度50 ℃的條件下,按1.2.2操作分別考察pH(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)、酶添加量(1000、2000、3000、4000、5000、6000 U/g)、酶解時間(1、1.5、2、2.5、3 h)、底物濃度(1%、2%、3%、4%、5%)和酶解溫度(40、45、50、55、60 ℃)對藜麥蛋白質(zhì)酶解效果的影響。

1.2.4 正交試驗 由1.2.3單因素實驗所得結(jié)果,選取對水解度(DH)和膽酸鹽吸附作用影響較大的4個因素:酶解pH、酶添加量、底物濃度、酶解溫度,以膽酸鹽吸附作用為指標,設(shè)計L9(34)正交試驗,優(yōu)化酶解工藝,正交試驗因素水平見表2。

表2 L9(34)正交試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of L9(34)orthogonal experiment

1.2.5 驗證實驗 根據(jù)正交試驗結(jié)果分析得到的最佳酶解條件做三次平行驗證實驗,驗證正交試驗結(jié)果的準確性,同時與未酶解的藜麥蛋白質(zhì)吸附膽酸鹽的作用做對比研究,驗證使用蛋白酶酶解藜麥蛋白質(zhì)制備具有膽酸鹽吸附作用的生物活性肽的科學性。

1.2.6 指標檢測方法

1.2.6.1 蛋白質(zhì)含量和水解度的測定 藜麥蛋白質(zhì)含量測定:考馬斯亮藍法[18-19];水解度的測定:甲醛滴定法[20]。

1.2.6.2 膽酸鹽標準曲線的制作 體外膽酸鹽吸附作用測定:糠醛比色法。參照文獻[21]的方法,略有改動。

精密稱取?；悄懰徕c、膽酸鈉各200 mg置于50 mL容量瓶中,以蒸餾水溶解并定容至刻度分別配制成4 mg/mL的牛磺膽酸鈉、膽酸鈉溶液。分別移取4 mg/mL的?；悄懰徕c、膽酸鈉溶液0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0 mL于具塞試管中,用蒸餾水補足體積為1.0 mL。分別加入45%的硫酸6 mL,混勻,再加入0.3%的糠醛1 mL,混勻,置于65 ℃恒溫水浴鍋中反應30 min,取出冷卻至室溫,于620 nm波長處測吸光度值,以膽酸鹽濃度為橫坐標,吸光度值為縱坐標繪制標準曲線。

1.2.6.3 膽酸鹽吸附作用的測定 分別移取4 mg/mL的?；悄懰徕c、膽酸鈉溶液各8 mL于100 mL錐形瓶中,分別加入藜麥蛋白質(zhì)酶解液2 mL,于37 ℃恒溫下振蕩反應60 min,再5000 r/min離心10 min。分別取離心后的樣液和膽酸鹽空白溶液各1 mL,加入45%的硫酸6 mL,混勻,再加入0.3%的糠醛1 mL,混勻,置65 ℃恒溫水浴鍋中反應30 min,取出冷卻至室溫,測定在620 nm波長處的吸光度值,由標準曲線求得樣液中膽酸鹽的濃度,以所加入膽酸鹽的濃度減去樣液中膽酸鹽的濃度即為被藜麥蛋白質(zhì)酶解物結(jié)合了的膽酸鹽的濃度,從而計算藜麥蛋白質(zhì)酶解物對膽酸鹽的吸附作用。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 藜麥粗蛋白質(zhì)粉蛋白質(zhì)含量測定

根據(jù)1.2.6.1所述的蛋白質(zhì)含量測定方法,以牛血清白蛋白濃度(μg/mL)為橫坐標,于595 nm處測定OD值為縱坐標,繪制標準曲線,得出回歸方程為y=0.003x-0.0066,R2=0.9995。提取得到的藜麥粗蛋白粉蛋白質(zhì)含量為68.22%±3.19%,n=5。

2.2 膽酸鈉、?；悄懰徕c標準曲線的制作

根據(jù)1.2.6.2所述的膽酸鈉、?；悄懰徕c標準曲線制作方法,分別以膽酸鈉、?；悄懰徕c濃度(mg/mL)為橫坐標,于620 nm處測定吸光度A值為縱坐標,繪制標準曲線,膽酸鈉回歸方程為:y=2.7907x+0.0214,R2=0.9951;牛磺膽酸鈉回歸方程為:y=2.752x-0.015,R2=0.9974,結(jié)果表明在0～0.5 mg/mL濃度范圍內(nèi),膽酸鈉、?；悄懰徕c線性關(guān)系良好。

2.3 酶解工藝優(yōu)化試驗結(jié)果

2.3.1 不同蛋白酶酶解效果的比較 由圖1可以看出,風味蛋白酶酶解藜麥蛋白質(zhì)的水解度(DH)最高,顯著高于其他3種蛋白酶(P<0.05),達到28.04%±0.99%;除木瓜蛋白酶外,其他3種蛋白酶酶解獲得的活性肽對?；悄懰徕c均顯示出較好的吸附作用,風味蛋白酶酶解獲得的活性肽對膽酸鈉的吸附作用顯著高于其他蛋白酶(P<0.05)。蛋白酶具有底物專一性,不同蛋白酶的作用位點不同,其酶解產(chǎn)物的組成和特性也有所差別[22],所以不同蛋白酶酶解獲得的活性肽吸附膽酸鹽的作用也不同。其中,風味蛋白酶酶解獲得的活性肽吸附膽酸鹽的量最高,達(3.10±0.36) mg/mL。因此選用風味蛋白酶進行后續(xù)酶解工藝優(yōu)化試驗。

圖1 各蛋白酶酶解效果比較Fig.1 The comparison of enzymatic hydrolysiseffects of various proteases注:相同指標標有不同小寫字母為差異顯著(P<0.05);圖2～圖6同。

2.3.2 不同pH對酶解效果的影響 由圖2可以看出,水解度(DH)先隨pH的上升而逐漸升高,在pH=6.0時到達到峰值為30.60%±0.74%,之后隨著pH的升高有所下降。吸附?；悄懰徕c的量隨著pH的升高而逐漸升高,吸附膽酸鈉的量在pH=7.0時達到最大值,說明在不同pH條件下酶解獲得的活性肽吸附不同膽酸鹽的能力不同;當pH=8.0時,酶解獲得的活性肽吸附膽酸鹽的總量最高,達到(4.41±0.32) mg/mL。因此選擇pH范圍為7.0～9.0進行正交試驗作進一步優(yōu)化。

圖2 不同初始pH對DH和膽酸鹽吸附作用的影響Fig.2 Effect of different initial pHon DH and cholate adsorption

2.3.3 酶添加量對酶解效果的影響 由圖3可以看出,水解度(DH)隨著酶添加量的升高而不斷升高,其中在酶添加量為1000～3000 U/g時增長速率較快,至3000 U/g后增長速率減緩并趨于平穩(wěn)。膽酸鹽吸附作用和DH變化趨勢基本一致,隨著酶添加量的升高而不斷增加,至6000 U/g時吸附膽酸鹽總量達到最大值(5.05±0.76) mg/mL。由此可知,底物濃度充分的情況下,酶添加量的增加可使蛋白酶分子與底物碰撞的幾率增大,提升與底物結(jié)合的效率[23],酶解的效果更好,進而使底物變?yōu)榫哂心懰猁}吸附作用的活性肽的幾率增加。當酶添加量增加到一定程度,超過酶的最適濃度時,酶添加量的增加反而會使酶與底物的接觸困難,此時若再添加蛋白酶對溶液的反應速率及DH的提升不大,導致成本的上升[24]。因此選擇酶添加量范圍為4000～6000 U/g作正交試驗進一步優(yōu)化。

圖3 酶添加量對DH和膽酸鹽吸附作用的影響Fig.3 Effect of enzyme additionon DH and cholate adsorption

2.3.4 酶解時間對酶解效果的影響 由圖4可以看出,水解度(DH)隨著酶解時間的延長表現(xiàn)出不同的增長趨勢,在1.5 h前增速較快,1.5 h后增速較慢,在2.5 h后基本趨于平穩(wěn)。隨著酶解時間的不斷延長,膽酸鹽吸附作用和DH表現(xiàn)出一致的增長速率,在2 h前,酶解獲得的活性肽吸附膽酸鹽的作用不斷增強,2 h后趨于平穩(wěn)。可能是由于剛開始酶解時蛋白酶的活力很好,隨著酶解時間的延長,酶的活力逐漸降低[25],且隨著酶解時間的延長,酶解反應基本達到飽和,使得水解度(DH)變化趨于穩(wěn)定,同時酶解液中的短肽的數(shù)量及組成不再迅速改變,吸附膽酸鹽的量也就趨于穩(wěn)定。但總體來看,酶解時間對DH和膽酸鹽的吸附作用影響沒有其他4個因素大,故直接選擇酶解時間為2 h,未再進行優(yōu)化。

圖4 酶解時間對DH和膽酸鹽吸附作用的影響Fig.4 Effect of enzymatic hydrolysis timeon DH and cholate adsorption

2.3.5 底物濃度對酶解效果的影響 由圖5可以看出,水解度(DH)隨著底物濃度的增加而不斷降低,在該酶添加量條件下,加入的酶與底物全部結(jié)合發(fā)生酶解反應,隨著底物濃度的增加,能和底物結(jié)合的酶卻沒有增加,酶解物的水解度(DH)降低;還可能是當?shù)孜餄舛冗^高時,底物與蛋白酶之間發(fā)生了競爭性抑制[26],導致水解度(DH)反而下降。隨著底物濃度的增加,藜麥蛋白質(zhì)酶解獲得的活性肽吸附?；悄懰徕c和膽酸鈉的作用均先增加后降低,在底物濃度為3%時對膽酸鹽的吸附作用達到最大值(4.83±0.13) mg/mL。可能是藜麥蛋白質(zhì)本身對于膽酸鹽也有吸附作用,未酶解的藜麥蛋白質(zhì)吸附了部分膽酸鹽;當?shù)孜餄舛冗^大,未酶解的蛋白質(zhì)對膽酸鹽的吸附達到最大值,同時隨著底物濃度的增大,酶濃度降低,使得酶促反應速度下降,酶解產(chǎn)生活性肽的速度減慢,對膽酸鹽的吸附作用降低[27]。因此選擇底物濃度范圍為2%～4%作正交試驗進一步優(yōu)化。

圖5 底物濃度對DH和膽酸鹽吸附作用的影響Fig.5 Effect of substrate concentrationon DH and cholate adsorption

2.3.6 酶解溫度對酶解效果的影響 由圖6可以看出,隨著酶解溫度的增加,水解度(DH)、膽酸鹽吸附量均表現(xiàn)先緩慢增加后降低的趨勢,溫度為55 ℃時,DH出現(xiàn)最大值為27.31%±0.37%,膽酸鹽吸附量出現(xiàn)最大值(4.81±0.37) mg/mL,當酶解溫度升高至60 ℃時,水解度(DH)和膽酸鹽吸附量均開始下降?？赡苁钱敎囟瘸^蛋白酶的最適溫度時,酶的空間結(jié)構(gòu)被改變,蛋白酶逐漸變性而喪失催化活性使得酶解反應變緩,酶解產(chǎn)生的活性肽減少,從而水解度(DH)和膽酸鹽吸附量降低。因此選擇溫度范圍為50～60 ℃進行正交試驗作進一步優(yōu)化。

圖6 酶解溫度對DH和膽酸鹽吸附作用的影響Fig.6 Effect of hydrolysis temperatureon DH and cholate adsorption

2.3.7 正交試驗結(jié)果 由單因素實驗結(jié)果分析,選取對水解度(DH)和膽酸鹽吸附作用影響較大的4個因素:酶解pH、酶添加量、底物濃度、酶解溫度,以膽酸鹽吸附作用為指標,設(shè)計L9(34)正交試驗,優(yōu)化酶解工藝,正交試驗結(jié)果見表3。

表3 正交試驗結(jié)果Table 3 Results of orthogonal experiment

由表3、表4可知,各因素對藜麥蛋白質(zhì)酶解獲得的活性肽吸附膽酸鹽作用的影響程度為A>C>D>B,即pH>底物濃度>酶解溫度>加酶量,其中pH對活性肽吸附膽酸鹽作用的影響最為顯著,因此酶解最優(yōu)工藝為A1C2D2B3,即酶解pH7.0,底物濃度3%,酶解溫度55 ℃、酶添加量為6000 U/g。

表4 正交實驗方差分析Table 4 Orthogonal experimental analysis of variance

2.3.8 驗證實驗結(jié)果 根據(jù)正交試驗結(jié)果分析得到的最佳酶解條件做三次平行驗證實驗,同時與未酶解的藜麥蛋白質(zhì)吸附膽酸鹽的作用做對比研究,結(jié)果表明,最優(yōu)組合A1C2D2B3酶解獲得的活性肽,水解度(DH)為38.22%±0.65%,吸附膽酸鈉的量為(3.01±0.16) mg/mL,吸附?；悄懰徕c的量為(4.55±0.20) mg/mL,吸附膽酸鹽的總量為(7.56±0.11) mg/mL,高于正交試驗最優(yōu)值(6.45±0.26) mg/mL,表明該酶解工藝合理可行;與未酶解的藜麥蛋白質(zhì)吸附膽酸鹽的總量(4.63±0.36) mg/mL相比提高了63.28%,差異極顯著(P<0.01)。由此,表明此酶解工藝科學合理,使用蛋白酶酶解藜麥蛋白質(zhì)制備具有膽酸鹽吸附作用的生物活性肽具有一定的研究價值。結(jié)合單因素實驗所得最佳酶解時間2 h,故風味酶酶解藜麥蛋白質(zhì)制備活性肽的最佳酶解工藝為:酶解pH7.0,底物濃度3%,酶解溫度55 ℃、酶添加量為6000 U/g,酶解時間2 h。

3 結(jié)論

風味蛋白酶對藜麥蛋白質(zhì)的酶解效果較好,最佳酶解工藝為酶解pH7.0,酶解溫度55 ℃,酶添加量6000 U/g,底物濃度3%,酶解時間2 h。在最優(yōu)酶解條件下,水解度(DH)為38.22%±0.65%,活性肽吸附膽酸鹽的總量達到(7.56±0.11) mg/mL,比未酶解的藜麥蛋白質(zhì)吸附膽酸鹽的總量提高了63.28%,這一結(jié)果顯示,風味蛋白酶酶解藜麥蛋白質(zhì)獲得的活性肽具有較好的膽酸鹽吸附作用,為藜麥蛋白質(zhì)及其活性肽的研究提供了思路,也為藜麥蛋白質(zhì)及其活性肽產(chǎn)品的開發(fā)提供了參考。同時有關(guān)藜麥降血脂活性肽的分離純化、結(jié)構(gòu)解析和其他藥理學活性等還需進一步研究。