兩種方法提取佛手渣多糖及其對巨噬細(xì)胞RAW264.7免疫調(diào)節(jié)活性的研究

,3,*,3

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,廣東廣州 510642;2.廣東展翠食品股份有限公司,廣東潮州 515634;3.廣東省功能食品活性物重點實驗室,廣東廣州 510642)

佛手(CitrusmedicaL.var.sarcodactylisSwingle)為蕓香科香櫞屬植物佛手的果實,又名佛手柑、香櫞、蜜羅柑、福壽橘,具有疏肝理氣、和胃止痛、生津化痰的功效,可治療肝胃氣滯、胸悶脹痛、食少嘔吐、咳嗽痰多等癥,是我國名貴的傳統(tǒng)中藥材[1]。佛手含有揮發(fā)油、香豆素、黃酮、氨基酸、礦物質(zhì)和多糖等多種活性成分,隨著佛手化學(xué)成分、藥理作用等研究的不斷深入,其抗癌、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等作用也逐漸被大眾熟知[2-3]。據(jù)文獻報道,佛手含有總糖8. 01%[4],而廣佛手的多糖含量平均為5.56%[5]。目前關(guān)于佛手多糖的提取方法有熱水提取法[6-12]、堿提法[13]、超聲輔助提取法[14]、復(fù)合酶提取法[15]等,這些方法都存在耗時長、溶劑消耗大、操作不便等缺點,不適合大規(guī)模工業(yè)化連續(xù)性生產(chǎn)。連續(xù)相變萃取法(Continuous phase-transition extraction,CPE)是本課題組自主研發(fā)的一種新型高效萃取方法[16]。它是在超臨界、亞臨界萃取技術(shù)的基礎(chǔ)上,在密閉環(huán)境中控制壓力對物料進行連續(xù)的逆流萃取,無溶劑殘留,溶劑重復(fù)回收率高,無需過濾即可分離漿渣,且在密閉系統(tǒng)進行萃取,不會造成環(huán)境污染[17-18]。目前CPE法已廣泛應(yīng)用于提取油脂類物質(zhì)[17-21]和膳食纖維[22],而用于提取多糖則尚未見報道。

近年來,植物多糖的研究備受關(guān)注,大量研究結(jié)果表明植物多糖對小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7具有良好的免疫調(diào)節(jié)作用[23-28]。巨噬細(xì)胞是天然免疫系統(tǒng)中最重要的免疫細(xì)胞之一,是衰老細(xì)胞、病原體和癌細(xì)胞的第一效應(yīng)細(xì)胞,其活化被認(rèn)為是免疫系統(tǒng)刺激的主要和必要步驟[29]。巨噬細(xì)胞表面具有多種受體,與植物多糖結(jié)合后可轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨木奘杉?xì)胞,產(chǎn)生如一氧化氮(nitticoxide,NO)等活性細(xì)胞因子,參與細(xì)胞內(nèi)炎癥反應(yīng)過程,清除相關(guān)病原體,從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[30]。但目前關(guān)于佛手多糖免疫活性的研究鮮見報道?；谏鲜龇治?本文以CPE法提取精油和黃酮后的佛手渣作為原料,分別采用CPE法和熱水浸提法(Hot water extraction,HWE)提取佛手多糖,比較兩種提取方法的得率和提取率;并以RAW264.7巨噬細(xì)胞為模型,初步探究由兩種方法提取并經(jīng)醇沉和脫除蛋白質(zhì)的佛手多糖的體外免疫活性,為佛手資源的綜合開發(fā)利用及佛手多糖產(chǎn)品研發(fā)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

廣佛手干片 廣東展翠食品股份有限公司提供;小鼠腹腔RAW264.7巨噬細(xì)胞 中國科學(xué)院干細(xì)胞庫提供;DMEM高糖培養(yǎng)基 賽默飛世爾生物化學(xué)制品(北京)有限公司;PBS緩沖液(pH7.4) 賽默飛世爾(蘇州)儀器有限公司;四季青胎牛血清 浙江天杭生物科技股份有限公司;青-鏈霉素溶液 美國Gibco公司;噻唑藍(MTT)、脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS) 美國Sigma公司;中性紅 美侖生物;NO試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司;其它試劑均為市售分析純。

連續(xù)相變萃取裝置 本課題組自主研發(fā);BJ-400A中草藥萬能粉碎機 浙江溫嶺市藥材機械廠;DF-101S型數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋 鞏義予華儀器有限公司;UV-3010型紫外分光光度計 日本日立高科技公司;AL104型萬分之一電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;Enspire 2003型多功能酶標(biāo)儀 美國PerkinElmer公司;BDS 200倒置生物顯微鏡 重慶奧特光學(xué)儀器有限責(zé)任公司;CCL-170B-8 CO2培養(yǎng)箱 新加坡藝思高(ESCO)科技有限公司;Airstream? A2型二級生物安全柜 新加坡藝思高(ESCO)科技有限公司。

圖1 連續(xù)相變萃取裝置構(gòu)造示意圖Fig.1 Structure diagram of continuousphase-transition extraction device注：S1:過濾器；S2：高壓泵；S3：流量計；S4：真空泵；S5：乙醇；S6：丁烷；Vi(i=1,2,3 to 9):閥門；Pi(i=1,2,3 to 6):壓力表；K1、K3：熱交換器；K2：萃取釜；K4、K8：解析釜；K5、K9：蒸餾塔；K6、K10：冷凝器；K7、K11：蓄液罐。

1.2 實驗方法

1.2.1 佛手干片預(yù)處理 將廣佛手干片粉碎后過30目篩,經(jīng)過CPE法依次提取佛手精油[31]和黃酮后[32],得到的佛手渣在55 ℃烘箱進行干燥,儲藏于4 ℃,備用。

1.2.2 提取流程

1.2.2.1 CPE法 稱取一定量的佛手渣于萃取釜中,以蒸餾水為溶劑,在0.2～0.4 MPa壓力下,設(shè)置萃取溫度為80～100 ℃,萃取流速50～70 L/h,連續(xù)萃取3.0～5.0 h,萃取得到的佛手多糖提取液進入解析釜中,解析溫度與萃取溫度一致,通過加熱減壓使萃取劑相變?yōu)闅怏w,再通過及時壓縮變?yōu)橐后w儲存在溶劑罐中,溶劑通過管道流回萃取釜,對物料再次進行加壓萃取,如此往復(fù)循環(huán),無需過濾即可實現(xiàn)漿渣分離得到佛手多糖粗提液。

1.2.2.2 HWE法 稱取一定量的佛手渣于燒杯中,以蒸餾水為溶劑,設(shè)置萃取溫度為85～95 ℃,液料比為50～70 mL/g,連續(xù)萃取2.0～3.0 h,過濾收集上清液,向濾渣加入相同比例的溶劑再次萃取相同時間,過濾后合并兩次濾液即得佛手多糖粗提液。

1.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化佛手多糖提取工藝 根據(jù)前期的單因素實驗結(jié)果,在0.2～0.4 MPa壓力下,選擇A溫度(℃)、B時間(h)、C流速(L/h)三個因素為CPE法的自變量,選擇A溫度(℃)、B時間(h)、C液料比(mL/g)三個因素為HWE法的自變量,以佛手多糖提取率為響應(yīng)值,采用Box-Behnken中心組合設(shè)計進行響應(yīng)面優(yōu)化。各因素的編碼值與真實值見表1。

表1 Box-Benhnken設(shè)計試驗因素水平表Table 1 Factor and level of Box-benhnken design test

1.2.4 佛手多糖純化 將得到的佛手多糖粗提液濃縮至原體積的1/8,加入四倍體積的無水乙醇,在4 ℃條件下靜置沉淀24 h,過濾后脫水干燥得到醇沉多糖,再采用Sevag法[33]脫除醇沉多糖中的蛋白質(zhì),冷凍干燥即得到佛手多糖(CPE法提取的醇沉多糖CCP、脫蛋白多糖CDP和HWE法提取的醇沉多糖HCP、脫蛋白多糖HDP)。參照He等[34]的方法,以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品,采用苯酚-硫酸法測定佛手多糖含量,根據(jù)線性回歸方程計算佛手多糖提取率,根據(jù)凍干后的樣品質(zhì)量計算得率:

佛手多糖提取率(%)=C×F×V/M×100

式(1)

佛手多糖得率(%)=m/M×100

式(2)

式中(1)、(2)中:C為佛手多糖溶液質(zhì)量濃度,g/mL;F表示佛手多糖溶液稀釋倍數(shù);V表示佛手多糖溶液體積,mL;M表示佛手渣質(zhì)量,g;m表示凍干后得到的佛手多糖質(zhì)量,g。

1.2.5 佛手多糖對巨噬細(xì)胞RAW264.7的免疫調(diào)節(jié)作用

1.2.5.1 MTT法檢測巨噬細(xì)胞的增殖作用 取對數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個/mL,按照每孔200 μL加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,在37 ℃,5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。棄去培養(yǎng)基,分別加入200 μL含有不同濃度(10、25、50、100、250、500、800、1000 μg/mL)佛手多糖(CCP、CDP、HCP、HDP)的DMEM完全培養(yǎng)基,每組設(shè)置6個復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后,棄去上清液,每孔加入50 μL 1 mg/mL的MTT溶液,于37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h,棄去上清液,每孔加入150 μL DMSO溶液,震蕩混勻后測定490 nm處吸光值A(chǔ)。細(xì)胞增殖率(%)=(實驗組A值/對照組A值)×100。

1.2.5.2 佛手多糖對巨噬細(xì)胞NO分泌的影響 取對數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞,按4×104個/孔加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h,每孔200 μL。分別加入200 μL含有不同濃度(5、10、25、50、100、200、250、500 μg/mL)佛手多糖(CCP、CDP、HCP、HDP)的DMEM完全培養(yǎng)基,空白對照和陽性對照組分別加入等體積的DMEM完全培養(yǎng)基和2 μg/mL LPS,每組設(shè)置6個復(fù)孔,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h 后取50 μL細(xì)胞培養(yǎng)上清液,與等體積的Griess試劑混合,避光反應(yīng)10 min,在酶標(biāo)儀上測定540 nm處吸收值,并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算NO分泌量。

1.2.5.3 中性紅實驗檢測巨噬細(xì)胞吞噬活性 取對數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞,按4×104個/孔加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h,每孔200 μL。棄去上清液,分別加入200 μL含有不同濃度(5、10、25、50、100、200、250、500 μg/mL)佛手多糖(CCP、CDP、HCP、HDP)的DMEM完全培養(yǎng)基,空白對照和陽性對照組分別加入等體積的DMEM完全培養(yǎng)基和2 μg/mL LPS,每組設(shè)置6個復(fù)孔,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后棄去上清液,各孔分別加入50 μL含有0.05%中性紅PBS溶液,繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄去上清液,用PBS洗3遍,每孔加入細(xì)胞裂解液(乙醇∶冰醋酸=1∶1)100 μL,室溫下放置2 h,待細(xì)胞溶解后,在酶標(biāo)儀上測定540 nm處吸光值A(chǔ)。細(xì)胞吞噬率(%)=(實驗組A值/對照組A值)×100。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實驗均重復(fù)3次,實驗數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示;采用SPSS 17.0進行單因素方差分析,利用Origin 9.0和Design-Expert 8.0.6軟件分別對實驗結(jié)果進行作圖與響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 CPE法提取佛手多糖響應(yīng)面工藝優(yōu)化

2.1.1 CPE法回歸模型的建立與方差分析 根據(jù)單因素實驗結(jié)果,以佛手多糖提取率(Y)為響應(yīng)值,將溫度、時間和流速三個因素進行Box-Behnken中心組合設(shè)計響應(yīng)面優(yōu)化,其結(jié)果見表2所示。

表2 CPE法Box-Benhnken試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Box-Benhnken experimental design arrangementand experimental results of CPE method

試驗結(jié)果采用Design-Expert.V 8.0.6.1軟件對表2中17個試驗點的響應(yīng)值進行多元回歸擬合得到佛手多糖提取率與溫度(A)、時間(B)和流速(C)各因素的二次多項回歸方程模型Y1:

Y1=14.74+2.54A+0.49B+0.11C-0.13AB+0.96AC+0.57BC-1.77A2-0.72B2-1.00C2對模型進行顯著性檢驗,由回歸模型的方差分析表3可以看出,CPE法提取佛手多糖的提取率整體模型的F為9.43(P<0.01),因此,模型因子具有極顯著性意義。該模型的失擬項F為6.19(P>0.05),無顯著性差異,說明這種試驗方法是可靠的,模型能夠很好的推測試驗結(jié)果。表3中,CPE法提取佛手多糖的提取率模型決定系數(shù)R2為0.9238,說明該模型擬合程度良好,試驗誤差小;校正擬合度R2Adj為0.8258,說明模型可以解釋82.58%響應(yīng)值的變化。變異系數(shù)CV為7.42%,CV反映模型的置信度,CV值越低,模型的置信度越高[35]。信噪比(Adeq Precision)為9.379,信噪比大于4為理想值,說明模型有著較好的信噪比,試驗穩(wěn)定性比較高,模型方程能夠較好地反映真實的試驗值[36]。因此,可以用該回歸方程模型來解釋CPE法提取佛手多糖設(shè)計方案。

表3 CPE法回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation of CPE method

表3中F值越大表明該因素對佛手多糖提取率影響越顯著,各因素對多糖提取率的影響大小依次為:溫度(A)>時間(B)>流速(C)。在此模型中A和A2是極顯著性因子項(P<0.01),而B、C、AB、AC、BC、B2、C2無顯著性差異(P>0.05),說明提取溫度、時間、流速兩兩間交互作用不顯著。

2.1.2 CPE法最佳工藝條件的確定及驗證試驗 通過Design-Expert 8.0.6軟件求解方程,系統(tǒng)預(yù)測得出CPE法提取佛手多糖的最佳工藝條件為:溫度98.62 ℃,時間4.5 h,流速66.09 L/h,模型預(yù)測的佛手多糖提取率為15.99%?？紤]到實際操作因素,將上述優(yōu)化條件修正為:溫度99 ℃,時間4.5 h,流速66 L/h。經(jīng)過試驗驗證得出,在此條件下佛手多糖的提取率為16.09%,與模型預(yù)測值僅相差0.10%。因此,響應(yīng)面法優(yōu)化CPE法提取佛手多糖是可行的,得到的多糖提取條件具有實際應(yīng)用價值。

2.2 HWE法提取佛手多糖響應(yīng)面工藝優(yōu)化

2.2.1 HWE法回歸模型的建立與方差分析 根據(jù)單因素實驗結(jié)果,以佛手多糖提取率(Y)為響應(yīng)值,將提取溫度、時間和液料比三個因素進行Box-Behnken中心組合設(shè)計響應(yīng)面優(yōu)化,其結(jié)果見表4所示。

表4 HWE法Box-Benhnken試驗設(shè)計及結(jié)果Table 4 Box-Benhnken experimental design arrangementand experimental results of HWE method

試驗結(jié)果采用Design-Expert.V 8.0.6.1軟件對表4中17個試驗點的響應(yīng)值進行多元回歸擬合得到佛手多糖提取率與提取溫度(A)、時間(B)和液料比(C)各因素的二次多項回歸方程模型Y2:

Y2=12.75+1.65A+0.94B-0.028C+0.14AB-0.022AC+0.088BC-0.25A2+0.37B2-0.097C2

對模型進行顯著性檢驗,由回歸模型的方差分析表5可以看出,HWE法提取佛手多糖的提取率整體模型的F為14.50(P<0.01),因此,模型因子具有極顯著性意義。該模型的失擬項F為2.79(P>0.05),無顯著性差異,說明這種試驗方法是可靠的,模型能夠很好的推測試驗結(jié)果。佛手多糖提取率模型的決定系數(shù)R2為0.9491,說明該模型擬合程度良好,試驗誤差小;校正擬合度R2Adj為0.8836,說明模型可以解釋88.36%響應(yīng)值的變化。變異系數(shù)CV為3.75%,說明模型有著較高的置信度,表明該實驗具有很高的精確度和良好的可靠性。信噪比(Adeq Precision)為14.120,說明實驗穩(wěn)定性高,模型方程可以很好反映試驗值的真實性。因此,可以用該回歸方程模型來解釋HWE法提取佛手多糖設(shè)計方案。

表5 HWE法回歸方程方差分析Table 5 Variance analysis of regression equation of HWE method

由表5分析結(jié)果可知,各因素對多糖提取率的影響大小依次為:溫度(A)>時間(B)>液料比(C)。在此模型中A和B是極顯著性因子項(P<0.01),而C、AB、AC、BC、A2、B2、C2無顯著性差異(P>0.05),說明提取溫度、提取時間、液料比兩兩間交互作用不顯著。

2.2.2 HWE法最佳工藝條件的確定及驗證試驗 通過Design-Expert 8.0.6軟件求解方程,系統(tǒng)預(yù)測得出HWE法提取佛手多糖的最佳工藝條件為:溫度95 ℃,時間3.0 h,液料比63.20 mL/g,提取2次，模型預(yù)測的佛手多糖提取率為15.62%?？紤]到實際操作因素,將上述優(yōu)化條件修正為:溫度95 ℃,時間3.0 h,液料比63 mL/g，提取2次。經(jīng)過試驗驗證得出,在此條件下佛手多糖的提取率為15.43%,與模型預(yù)測值僅相差0.19%。因此,響應(yīng)面法優(yōu)化HWE法提取佛手多糖是可行的,得到的多糖提取條件具有實際應(yīng)用價值。

2.3 兩種提取方法比較

圖2 佛手多糖對RAW264.7細(xì)胞增殖的影響Fig.2 The effect of bergamot polysaccharide on the proliferation of RAW264.7 cells注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05),圖3、圖4同。

從表6可知,CPE法在0.20～0.4 MPa的壓力下對佛手多糖進行提取,提取溫度比HWE法高,提取4.5 h后的提取率和得率都顯著高于提取了6.0 h的HWE法(P<0.05)。陳孝云等[37]分別采用傳統(tǒng)水提法、超聲輔助法、微波輔助法、超聲-微波協(xié)同提取法和復(fù)合酶法提取佛手多糖,其提取率均低于本文所采用的CPE法。這可能是因為天然植物的細(xì)胞壁在一定程度上會阻礙胞內(nèi)多糖的釋放,CPE法提取時會增加一定的壓力,使細(xì)胞內(nèi)外形成壓力差,增強細(xì)胞的破壁作用,胞內(nèi)多糖得到釋放并溶于提取溶劑中,從而完成目標(biāo)成分的提取[38]。而HWE法和其他方法是在常壓下進行的,細(xì)胞壁的阻擋使得多糖的釋放減少,故提取率比CPE法低。綜合比較,CPE法的提取時間遠少于HWE法,且操作簡單、無需過濾,提取率和得率高,是一種高效的提取方法。

表6 CPE法與HWE法對比Table 6 Comparison between CPE method and HWE method

2.4 佛手多糖免疫調(diào)節(jié)活性研究

2.4.1 佛手多糖對RAW264.7細(xì)胞增殖的影響 采用MTT法檢測細(xì)胞活性,不同濃度的佛手多糖對巨噬細(xì)胞的增殖活性結(jié)果如圖2所示。從圖2(a)中可看出,RAW264.7細(xì)胞的存活率隨CCP濃度的增高而下降,具有劑量依賴作用,在10 μg/mL存活率(85.76%)最高,而當(dāng)濃度高于500 μg/mL時,CCP則顯著抑制了細(xì)胞的增殖(P<0.05);圖2(b)中,CDP濃度對RAW264.7細(xì)胞的增殖作用大致呈現(xiàn)先上升后下降的“鐘罩型”,存活率均大于81%,在濃度50～500 μg/mL時存活率大于95%,對RAW264.7細(xì)胞無明顯損傷,在500 μg/mL濃度有最高存活率為99.4%;圖2(c)中,HCP濃度為10～250 μg/mL時顯著促進RAW264.7細(xì)胞的增殖活性,尤其是在10 μg/mL濃度時的促增殖能力最高(P<0.05),HCP濃度高于500 μg/mL時,RAW264.7細(xì)胞的促增殖能力隨濃度增大而下降,在1000 μg/mL時的存活率低于80%(P<0.05);圖2(d)中,HDP濃度對RAW264.7細(xì)胞的促增殖能力呈先下降后上升的波浪形趨勢,RAW264.7細(xì)胞的存活率均大于96%,對RAW264.7細(xì)胞無明顯毒性,在濃度為800 μg/mL時細(xì)胞存活率(144.09%)最高。綜合考慮,低于500 μg/mL的佛手多糖濃度對RAW264.7細(xì)胞毒性較小,不會影響其增殖活性,選擇0～500 μg/mL的佛手多糖濃度進行后續(xù)實驗。

圖3 佛手多糖對RAW264.7細(xì)胞NO分泌的影響Fig.3 The effect of bergamot polysaccharide on NO secretion of RAW264.7 cells

圖4 佛手多糖對RAW264.7細(xì)胞吞噬活性的影響Fig.4 The effect of bergamot polysaccharide on phagocytosis activity of RAW264.7 cells

2.4.2 佛手多糖對RAW264.7細(xì)胞NO分泌量的影響 NO是一種重要的炎癥介質(zhì),活化巨噬細(xì)胞可合成NO,參與細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)和宿主對病原體或外來物質(zhì)的防御;同時,NO也能促進巨噬細(xì)胞的溶解和吞噬[39]。由圖3可知,四種多糖組分(CCP、CDP、HCP和HDP)均能提高RAW264.7細(xì)胞NO釋放量。從圖3(a)中可看出,CCP在濃度10～250 μg/mL范圍內(nèi)NO釋放量無顯著性差異(P>0.05),而在最高濃度500 μg/mL時,NO釋放量(10.69 μmol/L)達到最大,顯著高于空白對照組(0.35 μmol/L)和LPS陽性對照組(5.22 μmol/L)以及中低劑量組(P<0.05);圖3(b)～(c)中,CDP和HCP濃度對RAW264.7細(xì)胞NO釋放量具有劑量依賴性,NO釋放量大致均隨CDP和HCP濃度升高而升高,在25～500 μg/mL范圍內(nèi)的NO分泌量顯著高于對照組和低劑量組(5～10 μg/mL)(P<0.05),CDP在200 μg/mL時有最大NO釋放量(12.78 μmol/L),與LPS陽性對照組(13.33 μmol/L)無顯著性差異(P>0.05),而HCP在濃度250 μg/mL時的NO分泌量為14.02 μmol/L,與LPS刺激組(13.19 μmol/L)無顯著性差異(P>0.05),表明CDP和HCP都可以促進RAW264.7細(xì)胞NO的分泌,均具有良好的免疫活性;圖3(d)中,HDP對應(yīng)的NO釋放量呈低濃度促進、高濃度抑制的“鐘罩型”劑量依賴關(guān)系,與空白對照組、LPS陽性對照組和高劑量組(250～500 μg/mL)相比,中低劑量組(10～200 μg/mL)顯著促進RAW264.7細(xì)胞分泌NO(P<0.05),在50 μg/mL時NO分泌量達到11.84 μmol/L,表明HDP也具有良好的免疫活性。與空白對照組相比,CCP、CDP、HCP和HDP在各自最佳有效濃度促進RAW264.7細(xì)胞釋放NO能力分別提高了29.54、16.06、16.10和11.87倍,說明佛手多糖具有一定的免疫活性作用,與Peng等的報道一致[40]。

2.4.3 佛手多糖對RAW264.7細(xì)胞吞噬活性的影響 吞噬作用是巨噬細(xì)胞對病原體和癌細(xì)胞反應(yīng)的主要特征之一[41]。測定活化巨噬細(xì)胞的吞噬能力可以反映受試樣品對免疫功能的影響。圖4中,CCP、CDP、HCP和HDP四種佛手多糖對RAW264.7細(xì)胞的吞噬能力的作用均大致隨濃度上升呈先增加后下降的趨勢,具有劑量依賴性。圖4(a)和(b)中,CCP和CDP均在5 μg/mL時顯著促進RAW264.7細(xì)胞吞噬活性(P<0.05),吞噬指數(shù)分別為208.00%和145.77%,顯著高于LPS陽性對照組、空白對照組(以100%計,下同)和中高劑量組(P<0.05);圖4(c)和(d)中,HCP和HDP在5～250 μg/mL濃度范圍內(nèi)可以很好促進RAW264.7細(xì)胞吞噬活性,吞噬指數(shù)均在100%以上,且兩者分別在50和25 μg/mL時吞噬活性高達224.67%和157.81%,均顯著高于LPS陽性對照組、空白對照組和其它劑量組(P<0.05)。與空白對照組相比,CCP、CDP、HCP和HDP在各自最佳有效濃度促進RAW264.7細(xì)胞吞噬作用能力分別提高了1.08、0.46、1.25和0.58倍。與脫除蛋白質(zhì)的CDP和HDP相比,保留了部分活性蛋白的CCP和HCP促進RAW264.7細(xì)胞吞噬作用的能力更好,這可能是與糖蛋白和巨噬細(xì)胞表面上的特定受體結(jié)合有關(guān)[42]。

3 結(jié)論

本研究通過CPE和HWE兩種方法提取佛手多糖,經(jīng)過響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計得出兩種方法提取佛手多糖的最佳條件為分別為:CPE提取溫度99 ℃,時間4.5 h,流速66 L/h,提取率為16.09%±0.12%,得率21.31%±0.13%;HWE提取溫度95 ℃,時間6.0 h(提取2次，每次3.0 h),液料比63 mL/g,提取率為15.43%±0.21%,得率20.22%±0.16%。與HWE法相比,采用CPE法使佛手多糖提取率提高了4.28%,得率提高了5.39%,并且縮短了1/4提取時間,表明CPE法適用于提取佛手多糖,為其他多糖的提取提供了一定的參考價值。

采用MTT法檢測四種佛手多糖對RAW264.7細(xì)胞的毒性作用,結(jié)果表明當(dāng)佛手多糖濃度低于500 μg/mL對細(xì)胞沒有明顯毒性;NO釋放量和中性紅吞噬能力的測定結(jié)果表明,四種佛手多糖均可促進RAW264.7細(xì)胞分泌NO和增加吞噬活性,且促進能力大小分別為CCP>HCP>CDP>HDP,HCP>CCP>HDP>CDP,說明由兩種方法提取且經(jīng)過醇沉和脫除蛋白質(zhì)之后得到的四種佛手多糖均具有一定免疫調(diào)節(jié)活性,為藥食同源的佛手資源深入開發(fā)利用和多糖增強免疫類保健食品和藥物的研發(fā)提供一定參考。