水堿連續(xù)提取黃皮疣柄牛肝菌粗多糖的理化性質(zhì)及抗氧化活性研究

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(1.滇西應(yīng)用技術(shù)大學(xué)普洱茶學(xué)院,云南普洱 665000;2.普洱茶研究院,云南普洱 665000;3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,云南昆明 650201)

黃皮疣柄牛肝菌(Leccinellumcrocipodium(Letellier.)Watliag),子實(shí)體中等。菌蓋直徑4～7.5 cm,菌蓋邊緣幼時(shí)微內(nèi)卷,呈土黃色、橘黃色、褐黃色,后期呈龜裂狀花紋,因此滇中地區(qū)又稱(chēng)其為黃癩頭[1]。黃皮疣柄牛肝菌味道鮮美,富含蛋白質(zhì)、膳食纖維、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分[2-3]以及多糖、多酚等生物活性成分[4-5],深受人們的青睞。

水提多糖法是一種傳統(tǒng)的提取方法,因該提取方法無(wú)毒無(wú)害,且操作簡(jiǎn)單成本低,適合大規(guī)模生產(chǎn)。目前對(duì)黃皮疣柄牛肝菌多糖的研究主要集中在熱水提取多糖上。岳萬(wàn)松[6]研究發(fā)現(xiàn),通過(guò)熱水法提取的黃皮疣柄牛肝菌多糖具有一定的抗氧化活性。常用的熱水提取法不能溶出胞內(nèi)多糖和細(xì)胞壁結(jié)合多糖[7-8],堿性溶液在提取過(guò)程中能夠更好地破壞細(xì)胞壁中纖維素和半纖維素之間的氫鍵[9],使得不溶性多糖從細(xì)胞壁當(dāng)中釋放出來(lái),轉(zhuǎn)化為可溶性多糖。Khatua等[10]研究表明堿提紅菇粗多糖具有較好的抗氧化活性。熱水提取多糖后的殘?jiān)茨艿玫匠浞掷帽銇G棄,既增加了環(huán)境的負(fù)擔(dān),而且降低了開(kāi)發(fā)利用的價(jià)值,研究表明[11-14],通過(guò)熱水提取多糖后剩余的殘?jiān)?可以通過(guò)堿液提取進(jìn)一步提取剩余多糖。為將黃皮疣柄牛肝菌中所含多糖提取最大化,本實(shí)驗(yàn)先采用水提法,提取黃皮疣柄牛肝菌粗多糖,剩余殘?jiān)?而后又采用堿提法對(duì)殘?jiān)械亩嗵沁M(jìn)行提取,并且考察了兩種粗多糖的理化性質(zhì)及抗氧化活性,為黃皮疣柄牛肝菌多糖的進(jìn)一步研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃皮疣柄牛肝菌鮮菌 云南易門(mén)康源菌業(yè)有限公司;葡萄糖、氫氧化鈉、四硼酸鈉、硫酸鋇、明膠、硫酸鉀、無(wú)水碳酸鈉、無(wú)水乙醇、苯酚、抗壞血酸、水楊酸、硫酸亞鐵、鐵氰化鉀、氯化鐵、NaH2PO4·2H2O、Na2HPO4·12H2O 天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司;鹽酸 西隴化工股份有限公司;濃硫酸 云南楊林工業(yè)開(kāi)發(fā)區(qū)汕滇藥業(yè)有限公司;咔唑、D-半乳糖醛酸 山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司;三氯乙酸 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;牛血清蛋白、考馬斯亮藍(lán)G-250 昆明杰輝生物有限公司;磷酸 成都市科龍化工試劑廠;沒(méi)食子酸 上海晶純生化科技股份有限公司;福林酚 北京索來(lái)寶科技有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)、吩嗪硫酸甲酯(PMS)、氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH) Sigma公司;所用試劑 均為分析純。

Heidolph Didital旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德祥科技有限公司;FD-1B-50型冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;UV-2450型紫外分光光度計(jì) 島津儀器(蘇州)有限公司;FST-PF-UP普利菲爾實(shí)驗(yàn)室超純水機(jī) 上海富詩(shī)特儀器設(shè)備有限公司;HC-3018R型高速冷凍離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司;HWS28型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科技有限公司;FW135型粉碎機(jī) 天津泰斯特儀器有限公司;Mettler-Toledo Pl1502型分析天平 上海微川精密儀器有限公司;Mettler-Toledo MS104TS分析天平 上海微川精密儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黃皮疣柄牛肝菌粗多糖提取 將黃皮疣柄牛肝菌鮮菌除雜后清洗干凈切片,于-80 ℃預(yù)凍處理,放入冷凍干燥機(jī)進(jìn)行真空升華干燥,然后打磨成粉過(guò)80目篩,真空包裝備用。采用水提醇沉法從黃皮疣柄牛肝菌子實(shí)體中提取得到水提粗多糖(LPS),再用堿提醇沉法從菌渣中提取得到堿提粗多糖(LPJ)。

水提粗多糖:采用熱水法提取黃皮疣柄牛肝菌多糖:取適量?jī)龈煞?按液料比34∶1 (mL/g)充分混勻,51 ℃下水浴3.1 h,提取液經(jīng)4000 r/min離心10 min,沉淀備用。取上清液,50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至原體積的1/5,冷卻后邊攪拌邊緩慢加入4倍體積濃縮液的無(wú)水乙醇,置于4 ℃冰箱靜置過(guò)夜。4000 r/min離心10 min棄上清,沉淀用適量去離子水溶解,于-80 ℃預(yù)凍處理,放入冷凍干燥機(jī)進(jìn)行真空升華干燥。

堿提粗多糖[15-16]:水提后的黃皮疣柄牛肝菌殘?jiān)盟春?按照20∶1的液料比用0.3 mol/L NaOH浸提2.5 h,4000 r/min離心10 min取上清,用0.5 mol/L HCl調(diào)至中性,在50 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至原體積的1/5,冷卻后邊攪拌邊緩慢加入4倍體積濃縮液的無(wú)水乙醇,置于4 ℃冰箱靜置過(guò)夜。4000 r/min離心10 min棄上清,沉淀用適量去離子水溶解,于-80 ℃預(yù)凍處理,放入冷凍干燥機(jī)進(jìn)行真空升華干燥。

1.2.2 黃皮疣柄牛肝菌粗多糖理化性質(zhì)

1.2.2.1 多糖得率 水提粗多糖(LPS)稱(chēng)重,計(jì)算得率。

堿提粗多糖(LPJ)稱(chēng)重,計(jì)算得率。

1.2.2.2 多糖含量測(cè)定 采用苯酚-硫酸法[17]繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線,回歸線性方程為y=0.0096x-0.0035,R2=0.9998,其中y代表490 nm波長(zhǎng)下的吸光值A(chǔ),x代表葡萄糖濃度(μg/mL)。

樣品測(cè)定,分別稱(chēng)取一定量的LPS與LPJ,配制成濃度為0.1 mg/mL的多糖溶液。離心取上清。平行三次測(cè)定吸光值。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算LPS與LPJ多糖含量。

1.2.2.3 糖醛酸含量測(cè)定 采用咔唑-硫酸比色法[18-20]繪制糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線,回歸線性方程為y=7.3957x+0.0005,R2=0.9988,其中y代表523 nm下的吸光值A(chǔ),x代表糖醛酸濃度(mg/mL)。

樣品測(cè)定:精密稱(chēng)取LPS與LPJ,分別配制成濃度為1 mg/mL的多糖溶液,平行三次測(cè)定吸光值,按照標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算樣品中糖醛酸含量。

樣品測(cè)定:分別取LPS與LPJ,以1 mol/L的鹽酸配制成2.5 mg/mL的多糖溶液。于100 ℃水浴8 h,4000 r/min離心20 min取上清。平行三次測(cè)定吸光值,按照標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算LPS與LPJ硫酸根含量。

1.2.2.5 蛋白質(zhì)含量測(cè)定 采用考馬斯亮藍(lán)法(bradford法)[24-25]繪制蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線,回歸線性方程為 y=0.0071x-0.0020,R2=0.9978,其中y代表595 nm下的吸光值A(chǔ),x代表蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(μg/mL)。

樣品測(cè)定:分別配制LPS與LPJ為0.1 mg/mL多糖溶液,平行三次測(cè)定吸光值,按照標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算LPS與LPJ蛋白質(zhì)含量。

1.2.2.6 總酚含量測(cè)定 采用Folin-Ciocalteau法[26-28]繪制總酚標(biāo)準(zhǔn)曲線,回歸線性方程為y=8.6886x+0.0046,R2=0.9996,其中y代表765 nm下的吸光值A(chǔ),x代表沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(mg/mL)。

樣品測(cè)定:分別配制LPS與LPJ為0.1 mg/mL多糖溶液,平行三次測(cè)定吸光值,按照標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算LPS與LPJ的總酚含量。

1.2.3 不同提取方法所得多糖體外抗氧化活性測(cè)定 通過(guò)測(cè)定LPS與LPJ清除DPPH自由基的能力、清除羥基自由基的能力、清除超氧陰離子自由基的能力、清除ABTS陽(yáng)離子自由基的能力及還原能力,評(píng)價(jià)LPS與LPJ體外抗氧化活性。

1.2.3.1 清除DPPH自由基能力的測(cè)定 用去離子水溶解LPS與LPJ,分別配制LPS與LPJ為不同濃度的多糖樣品溶液(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、3.0、4.0 mg/mL);配制濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、3.0、4.0 mg/mL的VC溶液。參照姜美云等[29-32]的方法,配制0.1 mmol/L DPPH-乙醇溶液,避光保存。將1 mL多糖樣品與2 mL DPPH-乙醇溶液漩渦混合后避光30 min,使其充分反應(yīng)。分光光度計(jì)用無(wú)水乙醇調(diào)零,測(cè)定波長(zhǎng)517 nm下的吸光值。平行測(cè)定三次,取平均值。DPPH自由基清除率計(jì)算公式如下:

其中,A1指多糖樣品與DPPH-乙醇混合溶液的吸光值;A2為多糖樣品溶液與不含DPPH的無(wú)水乙醇混合液的吸光值;A0為去離子水替代樣品溶液與DPPH-乙醇混合溶液的吸光值。VC溶液對(duì)DPPH自由基的清除同上,作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.3.2 清除羥基自由基能力的測(cè)定 配制不同濃度的多糖溶液及VC溶液參照1.2.3.1。參照Gong等[31-33]的方法,將1 mL的多糖溶液與1 mL FeSO4(6 mmol/L),1 mL H2O2(6 mmol/L)混合,37 ℃孵育10 min,再加入1 mL 水楊酸-乙醇溶液(6 mmol/L)混勻,37 ℃孵育30 min。用分光光度計(jì)在510 nm下測(cè)定吸光值。平行測(cè)定三次,取平均值。羥基自由基清除率計(jì)算公式如下:

其中,A1指樣品與反應(yīng)溶液混合的吸光值;A2為樣品與去離子水(替代H2O2)混合的吸光值;A0為去離子水替代樣品溶液與反應(yīng)溶液混合的吸光值。VC溶液對(duì)羥基自由基的清除同上,作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.3.3 清除ABTS陽(yáng)離子自由基能力的測(cè)定 配制不同濃度的多糖溶液及VC溶液參照1.2.3.1。參照Yu等[30,34]的方法,7 mmol/L ABTS溶液與2.45 mmol/L過(guò)硫酸銨混合避光氧化12 h。ABTS混合液用pH=7.4的PBS稀釋至在734 nm波長(zhǎng)下,吸光值為0.80±0.02。2 mL ABTS混合液與1 mL多糖樣品混合,室溫放置6 min,在734 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光值。平行測(cè)定三次,取平均值。ABTS陽(yáng)離子自由基清除率計(jì)算公式如下:

其中,A1指樣品與反應(yīng)溶液混合的吸光值;A2為樣品與PBS(代替反應(yīng)溶液)混合的吸光值;A0為去離子水(替代樣品溶液)與反應(yīng)溶液混合的吸光值。VC溶液對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基的清除同上,作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.3.4 清除超氧陰離子自由基能力的測(cè)定 配制不同濃度的多糖溶液及VC溶液參照1.2.3.1。參照文獻(xiàn)[30-32]方法,采用NADH-NBT-PMS體系測(cè)定黃皮疣柄牛肝菌多糖清除超氧陰離子自由基能力,1 mL多糖樣品溶液與1 mL 557 μmol/L NaDH-Na、1 mL 45 μmol/L PMS、1 mL 108 μmol/L NBT混勻,于25 ℃下溫浴5 min,以去離子水進(jìn)行調(diào)零。在波長(zhǎng)510 nm下測(cè)定吸光值。平行測(cè)定三次,取平均值。超氧陰離子自由基清除率計(jì)算公式如下:

其中,A1指樣品與反應(yīng)溶液混合的吸光值;A2為樣品與去離子水(代替反應(yīng)溶液)混合的吸光值;A0為去離子水(替代樣品溶液)與反應(yīng)溶液混合的吸光值。VC溶液對(duì)超氧陰離子自由基的清除同上,作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.3.5 還原力的測(cè)定 配制不同濃度的多糖溶液及VC溶液參照1.2.3.1。參照文獻(xiàn)[30-31]方法,1 mL多糖液與2 mL 0.2 mol/L磷酸緩沖液(pH=6.6)、2 mL鐵氰化鉀(1%)混合,在50 ℃下孵育20 min,加入2.5 mL 10%的三氯乙酸,3000 r/min離心10 min,在上清液中加入2 mL去離子水、0.4 mL 0.1%的氯化鐵溶液,在50 ℃下孵育10 min,在700 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光值。平行測(cè)定三次,取平均值。

表1 LPS與LPJ的理化性質(zhì)Table 1 Physical and chemical properties of LPS and LPJ

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)平行,所得結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用GraphPad Prism 5作圖軟件和SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析及繪圖制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 LPS與 LPJ

按照1.2.1的方法得到LPS與LPJ,如圖1所示。LPS呈海綿狀,顏色呈淺咖色;LPJ呈蓬松粉末狀,顏色呈黃褐色。LPS在50 ℃熱水中可溶解;LPJ在40 ℃熱水中即可溶解,LPJ相比LPS溶解性能好。

圖1 LPS與LPJFig.1 LPS and LPJ

2.2 LPS與LPJ得率及理化性質(zhì)比較

如表1所示,LPS得率與LPJ得率相比差異顯著(P<0.05),說(shuō)明相比堿提法,水提法能提取更多的黃皮疣柄牛肝菌多糖。此外,LPS多糖含量、糖醛酸含量、硫酸根含量、總酚含量顯著高于LPJ(P<0.05)。LPS與LPJ蛋白質(zhì)含量差異不顯著(P>0.05),說(shuō)明LPS和LPJ在提取過(guò)程中均含有大量蛋白質(zhì)。

2.3 LPS與LPJ體外抗氧化活性研究

2.3.1 DPPH自由基清除效果 VC、LPS、LPJ清除DPPH自由基的能力如圖2所示,VC為陽(yáng)性對(duì)照。LPS與LPJ均表現(xiàn)出一定清除DPPH自由基的能力,且表現(xiàn)出濃度依賴(lài)的特征。DPPH自由基清除率隨著LPS與LPJ的濃度增大而逐漸增大。當(dāng)多糖濃度在4 mg/mL時(shí),LPS、LPJ對(duì)DPPH自由基清除率分別為87.55%±0.51%、54.31%±2.72%,均低于VC對(duì)DPPH自由基清除率:96.84%±0.13%。LPS與LPJ的IC50值分別為0.217 mg/mL與3.158 mg/mL,LPS清除DPPH自由基的能力高于LPJ。

圖2 VC和兩種黃皮疣柄牛肝菌多糖的DPPH自由基清除能力Fig.2 DPPH radical scavenging activity of VC and the twopolysaccharides from Leccinellum crocipodium(Letellier.)Watliag

2.3.2 羥基自由基清除效果 VC、LPS、LPJ清除羥基自由基的能力如圖3所示,VC為陽(yáng)性對(duì)照。在0～4 mg/mL濃度范圍內(nèi),隨著多糖濃度的升高,多糖清除羥基自由基的能力逐漸增強(qiáng)。陽(yáng)性對(duì)照組VC的IC50值為0.284 mg/mL,LPS的IC50值為2.327 mg/mL。LPJ濃度為4 mg/mL時(shí),對(duì)羥基自由基清除率小于50%,因此LPJ在所測(cè)試范圍內(nèi)不能計(jì)算IC50值。當(dāng)多糖濃度在4 mg/mL時(shí),LPS、LPJ對(duì)羥基自由基清除率分別為54.53%±1.61%、46.50%±0.64%,均低于VC對(duì)羥基自由基清除率:98.71%±0.06%。LPS相比LPJ表現(xiàn)出較好的清除羥基自由基的能力。

圖3 VC和兩種黃皮疣柄牛肝菌多糖的羥基自由基清除能力Fig.3 Hydroxyl radical scavenging activity of VCand the twopolysaccharides from Leccinellum crocipodium(Letellier.)Watliag

2.3.3 ABTS陽(yáng)離子自由基清除效果 VC、LPS、LPJ清除ABTS自由基的能力如圖4所示,VC為陽(yáng)性對(duì)照。LPS與LPJ在0～4 mg/mL濃度范圍內(nèi),ABTS陽(yáng)離子自由基清除率隨著濃度的不斷增加而增加,即ABTS陽(yáng)離子自由基清除率與濃度呈依賴(lài)關(guān)系,LPS與LPJ的IC50值分別為0.413 mg/mL、1.081 mg/mL,均高于陽(yáng)性對(duì)照組VC的0.074 mg/mL。當(dāng)濃度為4 mg/mL時(shí),LPS與LPJ對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基清除率分別為81.56%±4.43%、68.79%±1.23%,均低于VC對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基清除率。LPS與LPJ均具有一定的清除ABTS陽(yáng)離子自由基的效果,且LPS優(yōu)于LPJ。

圖4 VC和兩種黃皮疣柄牛肝菌多糖的ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力Fig.4 ABTS cationic radical scavenging activity ofVC and the two polysaccharides fromLeccinellum crocipodium(Letellier.)Watliag

2.3.4 超氧陰離子自由基清除效果 VC、LPS、LPJ清除超氧陰離子自由基的能力如圖5所示,VC為陽(yáng)性對(duì)照。LPS與LPJ在0～3 mg/mL濃度范圍內(nèi),超氧陰離子自由基清除率隨著濃度的不斷增加而增加,當(dāng)濃度為3 mg/mL時(shí),LPS與LPJ對(duì)超氧陰離子自由基清除率分別為89.16%±2.42%、85.94%±2.98%,均低于VC對(duì)超氧陰離子自由基清除率:99.19%±0.11%。當(dāng)多糖濃度大于3 mg/mL時(shí),LPS與LPJ清除能力有所下降。LPS與LPJ的IC50值分別為0.119、0.214 mg/mL,均高于陽(yáng)性對(duì)照組VC的0.001 mg/mL。LPS與LPJ清除超氧陰離子自由基的趨勢(shì)相同,且在0～3 mg/mL濃度范圍內(nèi),LPS清除能力略高于LPJ。

圖5 VC和兩種黃皮疣柄牛肝菌多糖的超氧陰離子自由基清除能力Fig.5 Superoxide anion radical scavenging activity ofVC and the two polysaccharides fromLeccinellum crocipodium(Letellier.)Watliag

2.3.5 還原力測(cè)定 吸光值大小反映還原力高低,吸光值越大還原力越強(qiáng)。如圖6所示,LPS與LPJ還原力隨著濃度的不斷增加而增大,即還原力與濃度呈依賴(lài)關(guān)系。當(dāng)LPS和LPJ濃度為4 mg/mL時(shí),還原力吸光度值分別為1.41±0.02、1.16±0.01,LPS還原力與VC還原力1.41±0.003相當(dāng),LPJ還原力低于VC。這與LPS與LPJ的DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基、ABTS陽(yáng)離子自由基清除效果一致。

圖6 VC和兩種黃皮疣柄牛肝菌多糖的還原能力Fig.6 Reducing power of VCand the two polysaccharides fromLeccinellum crocipodium(Letellier.)Watliag

根據(jù)上述抗氧化指標(biāo)分析可知,LPS相比LPJ抗氧化性較強(qiáng),但均弱于陽(yáng)性對(duì)照組VC。這可能是因?yàn)閮煞N提取方式多糖含量,糖醛酸含量與硫酸根含量存在差異所致,據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,多糖糖醛酸含量與自由基清除呈正相關(guān)[35];茶葉多糖中糖醛酸含量越高,抗氧化能力越強(qiáng)[36]。多糖中硫酸根的含量與其生物活性密切相關(guān)[37],而本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)LPS多糖含量、糖醛酸與硫酸根含量均高于LPJ,因此,LPS的抗氧化活性?xún)?yōu)于LPJ。

3 結(jié)論

LPS與LPJ得率分別為18.44%±1.30%與5.50%±0.69%,LPS得率明顯高于LPJ。對(duì)LPS與LPJ理化性質(zhì)進(jìn)行研究,對(duì)比分析得出LPS多糖含量,糖醛酸含量,硫酸根含量均高于LPJ。LPS與LPJ抗氧化活性均隨著濃度的增加而逐漸增強(qiáng),結(jié)合DPPH自由基、羥基自由基、ABTS陽(yáng)離子自由基和超氧陰離子自由基清除率、IC50值以及還原力吸光度大小比較分析可知,LPS與LPJ均具有一定的抗氧化活性,且LPS強(qiáng)于LPJ。黃皮疣柄牛肝菌多糖有望開(kāi)發(fā)為新的天然抗氧化劑。