富硒糙米蛋白理化特性及抗氧化活性的研究

馮明菊,熊 華,王曉雅,孫 永

(南昌大學(xué)食品學(xué)院,食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室,江西南昌 330047)

硒(Selenium,Se)是人體生命活動所必需的微量元素之一[1],目前認為生物體內(nèi)發(fā)揮生理功能的硒形態(tài)主要是以硒代半胱氨酸為活性中心的硒蛋白。研究表明硒蛋白具有抗氧化[2]、增強機體免疫[3]、抗癌活性[4]、抗腫瘤活性[5]、拮抗有害重金屬[6]、保護與修復(fù)營養(yǎng)細胞[7],抑制砷、鉛、鎘等重金屬誘導(dǎo)的動物組織損傷、炎癥反應(yīng)等生物活性功能[8-10],由此可見硒蛋白對機體是重要的也是必需的。然而,硒的可利用資源十分有限且分布相當(dāng)不均勻。據(jù)調(diào)查,我國有約72%的缺硒或低硒地區(qū)[11],并且由于硒的缺乏引發(fā)許多的疾病,如克山病、大骨節(jié)病、心腦血管疾病等[12-13]。

大米作為我國居民膳食主糧之一,是重要的膳食硒來源。人們從谷物食品中獲得的硒約占飲食中總硒含量的70%,且與人體硒營養(yǎng)狀況密切相關(guān)[14]。因此,通過食物鏈途徑強化硒元素,提高谷物中的硒含量,已成為目前功能性食品的研究熱點之一。周鑫斌,Chen等[15-16]研究表明通過在土壤中或者葉面上施入適量的硒肥,利用水稻的生物富集和轉(zhuǎn)化作用,可把無機硒轉(zhuǎn)化為毒性低、安全有效的活性有機硒,提高大米中硒含量,改善糙米營養(yǎng)品質(zhì),被認為是一種低成本、安全、有效提高水稻硒含量的方法,已被廣泛用于水稻中硒的富集。Fang等[17]研究發(fā)現(xiàn),富硒大米中有機硒的主要存在形態(tài)是硒蛋白,且主要以硒代甲硫氨酸(selenomethionine,SeMet)形式存在,SeMet具有很高的生物活性。Liu等[18]通過堿提酸沉法提取糙米中的硒蛋白,探究其體外抗氧化活性,結(jié)果表明硒蛋白可顯著清除機體內(nèi)的超氧陰離子自由基、羥自由基和DPPH自由基,表現(xiàn)出較好的抗氧化活性。

本文主要以通過葉面噴施硒肥進行富硒處理后的三種富硒糙米為研究對象,探究三種富硒糙米中蛋白質(zhì)、淀粉、粗脂肪、直鏈淀粉、脂肪酸含量的差異;通過堿提酸沉法提取富硒糙米蛋白并對其進行理化表征,包括蛋白質(zhì)的分子量分布、氨基酸組成、紅外光譜分析;同時測定硒蛋白的抗氧化活性(DPPH自由基清除率、羥自由基清除率、還原力),并與對照品VC進行比較,以期系統(tǒng)、全面地了解富硒糙米蛋白氨基酸組成、結(jié)構(gòu)特征及生物活性,為進一步評價富硒糙米的營養(yǎng)價值、篩選優(yōu)質(zhì)的富硒糙米等提供理論依據(jù),對富硒大米的生產(chǎn)、開發(fā)及應(yīng)用具有指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雙江口富硒糙米(Shuangjiangkou selenium-rich brown rice,SSR)、桃源富硒糙米(Taoyuan selenium-rich brown rice,TSR)、麻陽富硒糙米(Mayang selenium-rich brown rice,MSR)、普通糙米(Ordinary brown rice,OR) 湖南省桃源縣富硒產(chǎn)業(yè)基地提供;1,1-二苯基苦?；诫?DPPH) 生化試劑,美國Sigma;鐵氰化鉀 分析純,西隴化工;水楊酸 分析純,國藥集團。

AFS8230型原子熒光分光光度計 北京吉天有限公司;TU-1900型可見紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;S-433D型氨基酸分析儀 德國Skynm公司;Nicolet5700型傅里葉紅外光譜儀 美國Thermo Nicolet 儀器公司;7890B型高效氣相色譜儀 美國安捷倫公司;K9840型自動凱氏定氮儀 濟南海能儀器股份有限公司;SPX-250型電泳儀 美國Bio-Rad 公司;DFY-500型粉碎機 浙江大德儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 糙米富硒處理 富硒糙米原料均通過葉面噴施硒肥的方式進行富硒處理,噴施的硒液濃度為40 mg/kg,孕穗期一次,灌漿期一次,均勻噴到葉面呈現(xiàn)霧滴狀。

1.2.2 富硒糙米樣品前處理 富硒糙米于烘箱中60 ℃烘干,用實驗室規(guī)模的粉碎機磨粉后過100目篩,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 富硒糙米中營養(yǎng)成分的測定

1.2.3.1 蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì)含量的測定方法參照GB 5009.5-2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)“食品中蛋白質(zhì)的測定”中的凱氏定氮法[19],蛋白質(zhì)換算系數(shù)為5.95。

1.2.3.2 淀粉 淀粉含量的測定方法參照GB 5009.9-2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) “食品中淀粉的測定”中的酸水解法[20],先測定出還原糖的含量,最后折算成淀粉含量。

1.2.3.3 粗脂肪 粗脂肪含量測定方法參照GB 5009.6-2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)“食品中脂肪的測定”中的索氏提取法[21]進行測定。

1.2.3.4 直鏈淀粉 參考郭天宇等[22]的方法,并稍作修改。稱取過100目篩,且85%甲醇脫脂后的糙米樣粉(100±0.5) mg,置于離心管中,加入 1.0 mL 95%乙醇及9.0 mL 1.0 moL/L NaOH溶液,輕搖均勻,置于沸水浴中加熱10 min,取出冷卻至室溫后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中,加水定容并劇烈振搖混勻。準(zhǔn)確吸取5.0 mL樣品溶液,加入已盛有一半蒸餾水的100 mL容量瓶中,加入1.0 mL 1.0 mol/L的乙酸溶液,搖勻后加入2.0 mL碘試劑,加水至刻度,搖勻,靜置10 min。用5.0 mL 0.09 mol/L NaOH溶液代替樣品做空白。在波長720 nm處測樣品液的吸光值。用馬鈴薯直鏈淀粉和支鏈淀粉制備標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算直鏈淀粉含量。

1.2.4 總硒含量的測定 糙米樣品中硒含量的測定采用氫化物原子熒光光譜法(HG-AFS),參考Liu等[23]的方法,并做部分修改。將磨粉過篩的樣品用正己烷脫脂,準(zhǔn)確稱量0.5 g(精確至0.001 g)樣品于消化管中,加入5.0 mL硝酸,輕微振搖混合均勻,于微波消解儀中消化,消解結(jié)束待冷卻后,將消化管轉(zhuǎn)移至高溫加熱箱中繼續(xù)加熱至溶液變?yōu)榍辶翢o色并伴有白煙出現(xiàn),停止加熱,切不可蒸干。待冷卻后全部轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中,用超純水定容,混勻待測,同時做空白對照。

1.2.5 有機硒含量測定 參考方建軍等[24]方法,稍作修改。稱取糙米干粉1.00 g,加少量超純水后,在研砵中碾磨使細胞充分破裂,定量轉(zhuǎn)移至事先準(zhǔn)備好的透析袋中,用超純水在燒杯中透析24 h,每 6.0 h離心更換一次超純水,將透析后的樣品取出,在離心機中12000 r/min離心15 min,取沉淀,冷凍干燥。準(zhǔn)確稱量0.5 g(精確至0.001 g)樣品于消化管中,加入5.0 mL硝酸,輕微振搖混合均勻,于微波消解儀中消化,消解結(jié)束待冷卻后,將消化管轉(zhuǎn)移至高溫加熱箱中繼續(xù)加熱至溶液變?yōu)榍辶翢o色并伴有白煙出現(xiàn),停止加熱,切不可蒸干。待冷卻后全部轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中,用超純水定容,混勻待測,同時做空白對照。

1.2.6 脂肪酸組成成分測定

1.2.6.1 糙米油脂的提取 參考喻鳳香等[25]方法,稍作修改。稱取糙米粉100 g,用500 mL正己烷分3次浸提,每次浸提2.0～3.0 h,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑,收集油脂樣品。

1.2.6.2 樣品油脂甲酯化 參考喻鳳香等[25-26]的方法,稍作修改。準(zhǔn)確稱取 2.0 mg油脂樣品于10 mL玻璃試管中,分別加入1.5 mL正己烷,40 μL的乙酸甲酯和100 μL 0.5 mol/L的甲醇鈉溶液,漩渦混勻,于37 ℃下水浴加熱30 min,使其甲酯化,并適當(dāng)振搖。取出后置冰箱冷卻10 min,迅速加入60 μL飽和的草酸溶液,離心(4000 r/min,5.0 min)去除沉淀。取上清液過無水硫酸鈉,氮吹至干。準(zhǔn)確加入1.0 mL正己烷(色譜純),搖勻,0.45 μm膜過濾,上樣進行GC分析。

1.2.6.3 GC的測定條件 色譜柱為CP-Sil 88(100 m×250 μm×0.2 μm);檢測器為火焰離子化檢測器(FID);載氣為H2(純度≥99.999%);進樣口溫度為250 ℃;檢測器溫度為250 ℃;升溫程序:起始溫度45 ℃保持4.0 min,以3.0 ℃/min速率升到175 ℃,保持27 min,然后以4.0 ℃/min速率升到215 ℃,保持30 min;進樣量為2.0 μL。

1.2.7 蛋白質(zhì)的提取及蛋白硒含量測定 參考Liu[27],Fang[28]等方法,稍作修改。富硒糙米粉碎后過100目篩,正己烷(W/V=1∶3)攪拌脫脂6.0 h,通風(fēng)櫥過夜使溶劑揮發(fā)。稱取脫脂富硒糙米粉適量,用0.05 mol/L NaOH(料液比=1∶20)在常溫下攪拌提取3.0～4.0 h后,在4700 r/min下離心15 min,得到上清液,重復(fù)上述操作一次,合并上清液,用鹽酸溶液調(diào)pH至5.4沉淀蛋白,然后在4700 r/min下離心15 min,得到蛋白質(zhì)沉淀物,透析,冷凍干燥。提取的富硒糙米蛋白分別命名為雙江口富硒糙米蛋白(SSRP),桃源富硒糙米蛋白(TSRP),麻陽富硒糙米蛋白(MSRP),普通糙米蛋白(ORP)。通過凱氏定氮測定蛋白純度,按照1.2.4中的方法測定蛋白硒含量。

1.2.8 SDS-PAGE法測定分子量及亞基組成

1.2.8.1 制膠 按照SDS-PAGE試劑盒上各種膠配比分別配制12%分離膠,5.0%濃縮膠,其中TEMED和10%過硫酸銨最后加入,在加入前需混勻前面所加試劑。

1.2.8.2 電極緩沖液配制 稱取3.0285 g Tris,14.41 g甘氨酸,1.0 g SDS,加蒸餾水充分攪拌溶解,定容至1000 mL,室溫保存。

1.2.8.3 5×樣品緩沖液 組成為25%(v/v)1.0 mol/L Tris-HCI(pH6.8),50%(v/v)甘油,0. 5%(w/v)溴酚藍,10%(w/v)SDS和5.0%(v/v)β-琉基乙醇,小份(0.1 mL/份)分裝,-20 ℃保存。

1.2.8.4 樣品溶解 稱取富硒糙米蛋白樣品溶于樣品緩沖液中,配制成濃度為2.0 mg/mL的樣品溶液,樣品溶解后于100 ℃水浴中加熱5.0 min使其變性,取出,冷卻至室溫后于6000 r/min離心10 min,上清液即為電泳樣品。上樣前取上清液進行5倍稀釋后即可上樣,上樣量為10 μL。

1.2.8.5 電泳 在室溫條件下,開始時濃縮膠中的電流為恒流 15 mA,當(dāng)樣品完全進入分離膠后加大電流至 25 mA,直至樣品嗅酚藍條帶移至距下端1.0 cm時,停止電泳。

1.2.8.6 染色與脫色 凝膠取出后于染色液中染色約1.0 h,取出用水小心沖洗去表面染色液,置于脫色液中于搖床上進行反復(fù)脫色,直至凝膠上背景色脫凈為止結(jié)束。其中,脫色液為50 mL乙醇,75 mL冰醋酸定溶至1000 mL;染色液為0.25 g考馬斯亮藍R-250,50 mL乙醇,9.0 mL冰醋酸,加水定容至100 mL,過濾除去雜質(zhì)。

1.2.9 傅里葉紅外光譜分析 參照雷紅靈[29]的方法,稱取干燥后的富硒糙米蛋白樣品和溴化鉀按1∶100混合,研磨均勻,壓制成薄片,用紅外光譜儀進行掃描,繪制紅外光譜圖并進行對比分析。掃描的波數(shù)范圍為400～4000 cm-1,掃描次數(shù)為32次,分辨率為4.0 cm-1,測定結(jié)果應(yīng)扣除溴化鉀背景光譜。

1.2.10 氨基酸的組成分析 準(zhǔn)確稱取富硒糙米提取蛋白0.1000 g,用6.0 moL/L HCL,110 ℃下加熱水解22 h,用氨基酸自動分析儀測定氨基酸組成及各種氨基酸的質(zhì)量分數(shù)。

1.2.11 富硒糙米蛋白的抗氧化活性

1.2.11.1 ·OH的清除能力的測定 本實驗采用水楊酸法測定樣品清除羥基自由基的活性。參考胡玲玲等[2]的方法,稍作修改。分別配制不同濃度的樣品溶液。在試管中依次加入1.0 mL 9.0 mmol/L的硫酸亞鐵溶液以及1.0 mL 9.0 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液,混勻,各加入0.1 mL不同濃度的樣品溶液,最后加入1.0 mL 8.8 mmol/L的過氧化氫溶液啟動反應(yīng),用蒸餾水定容至10 mL,漩渦混勻后在37 ℃水浴鍋中反應(yīng)15 min,以超純水為參比物質(zhì),在510 nm 處測定吸光度,每組試驗做三組平行對照,空白組中不加樣品,對照組中用蒸餾水代替過氧化氫溶液,計算清除率。

式中:A0-空白組的吸光值;A2-加入樣品的吸光值;A1-對照組的吸光值。

在實驗中,選用了相同濃度的天然抗氧化劑抗壞血酸(VC)與硒蛋白的抗氧化活性進行對照,每種樣品重復(fù)三次平行實驗,取平均值。

1.2.11.2 1,1-二苯基苦酰基苯肼(DPPH)自由基清除能力的測定 參考Zhang等[30]的方法,稍作修改。用無水乙醇溶液配制1.0×10-4mol/L的DPPH溶液,4.0 ℃避光保存?zhèn)溆?現(xiàn)配現(xiàn)用。取2.0 mL不同濃度的硒蛋白樣品溶液于試管中,加入2.0 mL配制好的DPPH溶液,漩渦混勻后,在室溫條件下避光反應(yīng)30 min,用無水乙醇作參比液,于517 nm處測定其吸光度值A(chǔ)2。對照組為等體積的蒸餾水與2.0 mL DPPH溶液的吸光度值A(chǔ)0,空白組A1為2.0 mL的待測樣品與2.0 mL的乙醇溶液,每組試驗做三組平行對照,計算清除率。以抗壞血酸作對比,分析對比不同含硒量糙米蛋白對DPPH·的清除能力。按下式計算DPPH·清除率:

表1 富硒糙米中硒含量及各營養(yǎng)成分含量Table 1 The content of selenium and nutritive components of selenium-enriched brown rice

式中:A2為DPPH溶液和樣品溶液的混合溶液的吸光度值;A1為樣品溶液的吸光度值;A0為DPPH溶液的吸光度值。

1.2.11.3 還原力的測定 本實驗采用鐵氰化鉀法測定樣品還原力。參考劉昆侖[5]等方法,稍作修改。取1.0 mL不同濃度的樣品溶液于試管中,依次加入2.5 mL 0.2 mol/L的PBS緩沖溶液(pH6.6)和2.5 mL 1.0%的鐵氰化鉀溶液,漩渦混勻,50 ℃水浴20 min。取出后冰浴迅速冷卻至室溫,然后加入2.5 mL 10%的三氯乙酸溶液(TCA),振蕩混勻,在3000 r/min下離心10 min。取上清液2.5 mL,加入相同體積的蒸餾水及0.5 mL 0.1%的三氯化鐵溶液,混勻,于室溫下暗處靜置反應(yīng)10 min,于700 nm處測定其吸光度值,每組試驗做三組平行對照,以無水乙醇作參比溶液。以抗壞血酸作對照,評價不同含硒量糙米蛋白對三價鐵離子的還原力。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 富硒糙米硒含量及各營養(yǎng)成分含量

許多研究表明[31-32],水稻對硒具有生物富集作用,在富硒農(nóng)產(chǎn)品栽培過程中,通過葉面噴施硒肥會影響植物對硒的吸收利用,從而也會不同程度的影響到其它營養(yǎng)成分的積累。本實驗通過氫化物原子熒光光譜法測得雙江口富硒糙米(SSR)、桃源富硒糙米(TSR)、麻陽富硒糙米(MSR)、普通糙米(OR)中的硒含量分別為131.95±5.77、294.33±5.10、580.50±1.19、14.88±2.82 μg/kg。富硒糙米中的硒含量均顯著高于普通糙米蛋白且三種富硒糙米中的硒含量存在顯著性差異(P<0.05),此結(jié)果與Zhang[33]、Deng[34]等研究一致,即通過葉面噴施硒肥進行富硒處理可顯著提高糙米中的硒含量,且不同品種糙米中硒富集量差異顯著。這主要可能是由于不同品種的稻米對硒吸收和利用的效果不同,從而導(dǎo)致水稻籽粒中的硒含量不同[35]。

直鏈淀粉含量是評價糙米品質(zhì)的一個重要指標(biāo)之一,與蒸煮品質(zhì)及食味品質(zhì)的好壞有著密切的關(guān)系[36]。本實驗利用馬鈴薯直鏈淀粉和支鏈淀粉繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=0.0091x+0.0152,R2=0.9994),測得SSR、TSR、MSR、OR中直鏈淀粉含量分別為14.67%、15.55%、15.99%、13.49%,富硒富硒糙米中直鏈淀粉的含量略高于普通糙米。

同時,由表1中可知,SSR、TSR、MSR、OR中脂肪、淀粉等營養(yǎng)成分的含量無顯著性的差異(P>0.05),但蛋白質(zhì)含量差異顯著(P<0.05),SSR中的蛋白含量最高達9.02%,產(chǎn)生這一現(xiàn)象的主要原因可能是[37]:對水稻進行富硒處理時,由于品種之間的差異導(dǎo)致水稻對硒的富集及轉(zhuǎn)化能力不同,而硒在轉(zhuǎn)化過程中會與硫產(chǎn)生競爭作用,硒沿著硫的吸收和代謝途徑取代了硫元素并與蛋白質(zhì)中的半胱氨酸和蛋氨酸結(jié)合,形成了硒代氨基酸化合物,進一步被轉(zhuǎn)運至水稻籽粒中以硒蛋白的形式貯存在蛋白質(zhì)中,從而造成蛋白質(zhì)含量存在顯著性差異。此結(jié)果與Hu等[38],吳得峰[39],朱文東[40]的研究結(jié)果一致,即通過葉面噴施適量硒肥可提高大米中蛋白質(zhì)含量,但對脂肪、灰分等含量影響不顯著。

2.2 富硒糙米油脂中脂肪酸組成及含量

糙米油脂中含有多種脂肪酸,脂肪酸含量可作為評價糙米米粉酸敗情況的質(zhì)量指數(shù)。本實驗采用浸提法提取糙米油脂,并對其進行了氣相色譜分析,用面積歸一化法測定其脂肪酸組分及含量,結(jié)果如表2所示:共鑒定出11種成分,其中SSR、TSR、MSR、OR中油酸、亞油酸及棕櫚酸之和分別約占總脂肪酸含量的95.32%、95.70%、94.63%、91.74%,由此可見富硒糙米油脂中含有豐富的油酸、亞油酸及棕櫚酸成分,其含量略高于普通糙米油脂,這一結(jié)果與Ramezanzadeh等[41]的研究結(jié)果一致。油酸、亞油酸比例均約為1.2∶1,接近國際衛(wèi)生組織推薦的最佳標(biāo)準(zhǔn)1∶1;油酸、亞油酸等不飽和脂肪酸含量高達76%左右,不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的比列均約為3.2∶1;相較于普通糙米油脂,富硒糙米油脂中的肉豆蔻酸和硬脂酸含量差異顯著(P<0.05),富硒糙米油脂中的肉豆蔻酸含量均低于OR,硬脂酸含量則與之相反;SSR、TSR、MSR中未檢測出葵酸。此結(jié)果與喻鳳香等[25]的研究結(jié)果一致,均證明米糠油是典型的油酸、亞油酸型植物油,其不飽和脂肪酸∶飽和脂肪酸≈4∶1,油酸∶亞油酸≈1.2∶1。

富硒糙米SSR、TSR、MSR油脂中各脂肪酸含量的變化可用脂肪酸合成與代謝的機理來進行解釋。在脂肪酸合成途徑中,丙二酸單酰輔酶 A(malonyl-CoA)作為重要的參與合成時的三碳單元中間體,其中,硫元素作為此輔酶的重要組成元素之一,若植物在生長的環(huán)境中存在著硒元素,硒與硫相互競爭,硒會取代硫元素與酶結(jié)合[42],結(jié)合后的硒降低了含硫酶的活性,從而造成糙米油脂中脂肪酸含量的變化;同時,在脂肪酸的代謝途徑中,脂肪酸均是在酶的催化下通過β-氧化而降解,如不飽和脂肪酸是在烯酰-CoA異構(gòu)酶(isomerase)和2,4-二烯酰-CoA(2,4-dienoyl-CoA reductase)的催化下進行β-氧化,而硒元素作為此兩種酶的重要組成成分,影響酶的活性[43]。因此,在富硒糙米中,硒的存在有助于脂肪酸的組成和積累的改變。

表2 不同種類的富硒糙米油脂中脂肪酸組成及含量Table 2 Fatty acid composition and content of different varieties of selenium-enriched brown rice oil

2.3 蛋白質(zhì)提取及純度

本實驗采取堿提酸沉法提取的ORP、SSRP、TSRP、MSRP糙米蛋白,其純度分別為84.85%、88.66%、90.29%、87.46%,硒含量分別為0.074、1.35、2.97、6.38 mg/kg。由此可知,蛋白質(zhì)中硒含量的變化與糙米中硒的變化一致(表1)且糙米中的硒主要與蛋白質(zhì)結(jié)合。

表3 富硒糙米蛋白的純度及硒含量Table 3 The purity and selenium content in differentvarieties of selenium-enriched brown rice protein

2.4 糙米蛋白分子量及亞基組成

采用 SDS-PAGE 法分析測定了富硒糙米蛋白及普通糙米蛋白分子量的分布及亞基組成,結(jié)果如圖1 所示。分析比較ORP、SSRP、TSRP、MSRP的SDS-PAGE電泳圖,由圖1可以看出不同的糙米硒蛋白與普通糙米蛋白亞基條帶基本一致,既沒有蛋白譜帶消失,也沒有新的蛋白譜帶產(chǎn)生,說明其亞基組成無明顯差異,它們所包含的亞基結(jié)構(gòu)幾乎相同。同時,根據(jù)蛋白質(zhì)分子量的分布,將這些條帶分為六組,即Ⅰ-Ⅵ,其分子量的范圍均在 10.0～70.0 kDa 之間,其中條帶Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ為主要的亞基條帶。研究結(jié)果表明,葉面噴施外源硒肥雖然會改變糙米硒蛋白的含硒量,但對蛋白質(zhì)亞基的分布與組成不會產(chǎn)生影響,這主要由于硒被植物轉(zhuǎn)運進入到植株內(nèi)和果實中時,雖然會影響到糙米籽粒中蛋白質(zhì)的含量,但不會改變蛋白質(zhì)代謝的途徑[44],故而不會改變蛋白質(zhì)亞基的組成及分布。

圖1 富硒糙米蛋白SDS-PAGE電泳圖Fig.1 SDS-PAGE analysis ofselenium-enriched brown rice protein

2.5 蛋白質(zhì)氨基酸組成

氨基酸作為蛋白質(zhì)的基本組成單位,其成分分析是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)特性和營養(yǎng)價值的重要手段之一。由表4可看出,三種富硒糙米及普通糙米蛋白氨基酸組成及含量基本相似,其中谷氨酸含量最為豐富,高達到14.87～17.02 g/100 g protein;其次是天冬氨酸、精氨酸和亮氨酸。ORP、SSRP、TSRP、MSRP中的必需氨基酸分別約占32.19%、33.17%、33.21%、33.67%。賴氨酸作為大米蛋白的第一限制氨基酸,僅約為3.14%～3.67%。E/T、E/N用于評估蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值,各比值均相對穩(wěn)定。與普通糙米蛋白相比,富硒糙米蛋白中的含硫氨基酸如半胱氨酸和蛋氨酸含量變化較為明顯,這一結(jié)果與周遺品[37],Hu等[38]的研究結(jié)果一致,即通過噴施硒肥在提高稻米籽粒蛋白質(zhì)含量的同時,也會降低半胱氨基酸含量、增大蛋氨酸含量。產(chǎn)生這一現(xiàn)象的主要原因是[45]:植物對硫和硒的吸收存在相互競爭作用,硒通過植物器官轉(zhuǎn)運進入植物體內(nèi)后會取代含硫氨基酸中的硫與含硫氨基酸結(jié)合,結(jié)合后形成的硒代含硫氨基酸化合物直接參與到植物蛋白質(zhì)合成的過程中,從而造成植物體內(nèi)的某些含硫氨基酸如半胱氨酸(Cys)和蛋氨酸(Met)含量的變化。

表4 富硒糙米蛋白氨基酸組成(g/100 g protein)Table 4 Amino acid composition of selenium-rich brown rice protein(g/100 g protein)

2.6 富硒糙米蛋白紅外光譜分析

蛋白質(zhì)在紅外區(qū)有很多的特征吸收帶:其中包括由C=O伸縮振動引起的酰胺I帶(1700～1600 cm-1);由N-H彎曲振動引起的酞胺II帶(1570～1500 cm-1)及對應(yīng)波長于1350～1220 cm-1的酞胺III帶。酰胺I帶(1700～1600 cm-1)包含了蛋白質(zhì)豐富的二級結(jié)構(gòu)信息,如a-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、β-折疊、無規(guī)卷曲等,因此酰胺I帶常用于解析蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)。

對糙米蛋白在4000～400 cm-1范圍內(nèi)進行紅外光譜分析掃描,其結(jié)果如圖2所示。由圖2A可知,三種富硒糙米蛋白及普通糙米蛋白的紅外光譜圖線基本相似,并未觀察到新的特征峰,這說明糙米蛋白在進行富硒處理后未產(chǎn)生新的鍵。分析對比,硒蛋白的吸收峰位置略微紅移。在波數(shù)3420 cm-1附近出現(xiàn)較強的吸收峰,這是由于酰胺基團中的N-H和分子間、分子內(nèi)的-OH的伸縮振動所引起的。波數(shù)2926 cm-1附近出現(xiàn)的吸收峰是飽和烴中的C-H的伸縮振動產(chǎn)生的;在波數(shù)1640 cm-1左右出現(xiàn)窄而尖的吸收峰屬于酰胺I帶,是由C=O的伸縮振動產(chǎn)生的,是蛋白質(zhì)的特征譜帶。此外,在波數(shù)772、573 cm-1附近有一特征峰為對稱環(huán)伸縮振動引起的,可能有Se=O、C-Se結(jié)構(gòu)[46]。

圖2 富硒糙米蛋白傅里葉紅外(FT-IR)光譜圖(A)和去卷積曲線擬合圖(B)Fig.2 Fourier transform infrared spectrometerspectra(A) and deconvolution curve fitting diagram(B)of selenium-rich brown rice protein

圖2A紅外光譜的酰胺I帶(1700～1600 cm-1)進行去卷積,其擬合結(jié)果如圖2B所示:所有樣品經(jīng)二階擬合均得到六個峰,與普通糙米蛋白相比,富硒糙米蛋白波峰明顯發(fā)生了偏移。各峰的歸屬為1652 cm-1為α-螺旋,1610、1623 cm-1為β-折疊,1667、1684 cm-1為β-轉(zhuǎn)角,1636 cm-1為無規(guī)卷曲[47]。各二級結(jié)構(gòu)組分含量如表5所示:與普通糙米蛋白相比,富硒糙米蛋白中的β-折疊、無規(guī)則卷含量顯著增加,β-轉(zhuǎn)角、α-螺旋含量降低。而在三種富硒糙米蛋白中,SSRP與MSRP的各二級結(jié)構(gòu)組分含量無顯著差異;與SSRP和MSRP相比,TSRP中α-螺旋與β-轉(zhuǎn)角含量較低,分別占14.89%、9.54%,然而無規(guī)則卷曲與β-折疊則與之相反,均在TSRP中含量最高,分別占29.44%、46.12%。這一現(xiàn)象表明,富硒處理后,三種富硒糙米蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化,各二級結(jié)構(gòu)含量存在差異。這一結(jié)果與Hu等[48]的研究結(jié)果一致,Hu通過葉面噴施不同濃度(25、50、75和100 g Se/ha)的亞硒酸鈉硒肥進行富硒處理,對提取的糙米谷蛋白進行FT-IR分析,結(jié)果表明富硒處理后谷蛋白的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。

表5 富硒糙米蛋白二級結(jié)構(gòu)含量Table 5 Secondary contents of selenium-rich brown rice protein

2.7 富硒糙米蛋白抗氧化作用

2.7.1 DPPH自由基清除活性 如圖3所示,富硒糙米蛋白SSRP、TSRP、MSRP與普通糙米蛋白ORP及VC均具有一定的DPPH自由基清除能力,富硒糙米蛋白與普通糙米蛋白對DPPH自由基的清除率與樣品濃度均呈正相關(guān)關(guān)系,而VC對DPPH自由基的清除率隨著濃度的增加基本保持不變。在本試驗所測定的樣品濃度范圍內(nèi)(0.1～1.0 mg/mL),相同濃度下,富硒糙米蛋白對DPPH自由基的清除率顯著(P<0.05)高于普通糙米蛋白,這是因為硒以硒代半胱氨酸存在于酶的活性中心,特別是谷胱甘肽過氧化物酶[49],具有很強的抗氧化性,能有效清除DPPH自由基[50]。當(dāng)樣品濃度為1.0 mg/mL時,ORP、SSRP、TSRP、MSRP及VC對DPPH自由基的清除率分別為22.94%、38.72%、40.03%、41.56%、95.34%。此結(jié)果與胡玲玲等[2]的研究一致,均說明了進行富硒處理后的糙米蛋白具有更強的DPPH自由基的清除能力。

圖3 富硒糙米蛋白對DPPH自由基的清除率Fig.3 DPPH free radical scavenging rate ofdifferent selenium-rich brown rice protein

2.7.2 羥自由基清除活性 圖4結(jié)果表明,在本試驗所測定的樣品濃度范圍內(nèi)(0.1～1.0 mg/mL),富硒糙米蛋白SSRP、TSRP、MSRP與普通糙米蛋白ORP及VC對·OH都具有一定的清除能力,且清除率與樣品濃度呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系。當(dāng)樣品濃度在0.1～0.4 mg/mL范圍內(nèi)時,糙米硒蛋白對·OH的清除率隨樣品濃度的增加而急劇上升;當(dāng)樣品濃度在0.4～1.0 mg/mL范圍內(nèi)時,VC對·OH的清除率隨濃度的變化趨于平緩,而硒蛋白對·OH的清除率隨樣品濃度的上升而緩慢增加,且當(dāng)濃度為1.0 mg/mL時,OPR、SSRP、TSRP、MSRP及VC對·OH的清除率分別為36.05%、91.22%、89.41%、87.51%和99.88%。相同濃度下SSRP、TSRP、MSRP的·OH的清除能力差異很小,但均高于OPR。SSRP、TSRP、MSRP之間對·OH的清除作用無顯著性差異(P>0.05)。

圖4 富硒糙米蛋白對羥自由基的清除率Fig.4 Clearance rate of hydroxyl free radicalsin selenium-rich brown rice protein

2.7.3 還原力 由圖5中可知,在本文所測定的樣品濃度范圍內(nèi)(0.2～1.0 mg/mL),SSRP、TSRP、MSRP及VC對Fe3+均具有一定的還原力,且還原力隨樣品濃度的增加而呈上升趨勢;當(dāng)樣品濃度為1.0 mg/mL時,ORP、SSRP、TSRP、MSRP及VC的還原力分別為0.312、0.341、0.368、0.357、1.966。三種富硒糙米蛋白的還原力顯著高于相同濃度下的普通糙米蛋白的還原力(P<0.05),這可能是因為以硒代半胱氨酸形式存在于蛋白質(zhì)中的硒,能有效除去起催化作用的金屬離子[51],從而提高了蛋白的還原力。

圖5 富硒糙米蛋白的還原力Fig.5 Reducing power of selenium rich brown rice protein

本研究結(jié)果表明,富硒糙米蛋白SSRP、TSRP、MSRP均顯示了較強的DPPH自由基、羥自由基清除能力及還原力,且均高于普通糙米蛋白,此結(jié)果與劉昆侖[52]的研究結(jié)果一致。富硒糙米蛋白中結(jié)合了硒,形成了以硒代半胱氨酸為中心的硒蛋白,抗氧化能力顯著增強,Xu等[53]、曹斌[54]的研究也報道了相似的結(jié)果,富硒蛋白具有較強的自由基清除能力與抗氧化活性。

3 結(jié)論

本文以富硒糙米為原料,對糙米和蛋白的理化特性及富硒糙米蛋白的抗氧化活性進行分析與測定。結(jié)果表明:富硒處理可顯著(P<0.05)提高糙米中的硒含量及粗蛋白含量,造成肉豆蔻酸含量降低,硬脂酸含量升高;相較于普通糙米蛋白,富硒糙米蛋白中蛋氨酸含量上升,半胱氨酸含量下降;富硒處理對蛋白質(zhì)分子量及亞基組成無顯著影響,但會增加β-折疊、無規(guī)則卷含量增加,降低β-轉(zhuǎn)角、α-螺旋含量。富硒糙米蛋白具一定的DPPH自由基、羥自由基清除能力與還原力,且均明顯高于普通糙米蛋白,表現(xiàn)出了較強的體外抗氧化活性,可用于食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域,為消費者提供新型食療保健產(chǎn)品。