天然和熱變性乳鐵蛋白與α乳白蛋白聚集體的超分子結構表征

Nazarenko Yulia李 波楊 偉*

(1.河南科技學院食品學院,河南新鄉(xiāng) 453003;2.蘇梅國立農業(yè)大學食品技術學院,烏克蘭蘇梅 40021)

蛋白質自組裝是指蛋白質分子間,在熱力學平衡條件下,通過建立特異性或非特異性相互作用,自發(fā)形成有序結構的過程[1]。它無需外部能量輸入,僅通過改變介質環(huán)境就可以觸發(fā)或“拆卸”組裝[1]。在單一蛋白質體系中,溶液pH環(huán)境接近蛋白質等電點(pI)時,蛋白質分子之間可發(fā)生自組裝[2-3];在含有兩種蛋白質的體系中,蛋白質可以在兩蛋白質pI之間的pH環(huán)境下發(fā)生自組裝[4-5]。形成的超分子結構可以使蛋白質在相關領域中具有包埋、保護和傳遞生物活性物質的功能[6]。Anne等發(fā)現:帶相反電荷的β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,BLG)和乳鐵蛋白(lactoferrin,LF)能夠自組裝,所形成的自組裝體具有作為維生素B9生物載體的潛力,每克蛋白最高可包埋16 mg B9[7];Fatoumata等利用BLG和溶菌酶之間的靜電相互作用組裝形成微球狀超分子結構組裝體,并成功的將維生素D3包埋在BLG-溶菌酶微球中,包埋率高達90.8%±4.8%[8]。

LF是從牛奶初乳中分離出來的一種鐵結合糖蛋白[9],分子量為88 kDa,具有抗菌、抗炎、抗病毒和免疫調節(jié)等多種生物功能[10-14]。LF具有8.9的等電點(pI),在低于其pI的pH環(huán)境下帶正電荷,可以與具有負電荷的蛋白質形成各種超分子結構。Anema等利用這個特性研究了LF與BLG在pH5～7條件下(該溶液pH介于兩蛋白質pI,8.9和4.6之間)形成的超分子結構[15]。深入研究基于LF為載體的傳遞體系,對于開發(fā)新型多功能食品添加劑和配料具有重要意義。

α-乳白蛋白(α-lactalbumin,ALA)是乳清蛋白中的優(yōu)質蛋白質,約占乳清總蛋白的20%(w/w),與BLG一樣,也具有較低的等電點(pI在4.2～4.5之間),但相比于BLG更易吸收[16]。推測LF和ALA也能夠在兩個蛋白質等電點之間的pH條件下自組裝,形成不同的超分子結構,從而擴展LF-ALA復合物在食品領域中包埋、運載和傳遞生物活性物質的功能。但目前,尚無LF-ALA復合物結構和組裝機制的相關報道,這限制了其作為活性物質載體的開發(fā)和應用。

雙蛋白組裝體的結構與功能與參與組裝的單一蛋白質的結構密切相關[17]。目前,雙蛋白自組裝的研究多集中在天然蛋白質間的組裝。LF具有兩葉基團(N-葉和C-葉),當在90 ℃加熱時,兩葉完全展開[18]。Yang等研究了熱變性前后LF和(-)-表沒食子兒茶素-3-沒食子酸酯((-)-epigallocatechin-3-gallate,EGCG)之間的相互作用,發(fā)現LF熱變性前后與EGCG的結合能力不同[19]。因此,推測熱變性LF與ALA自組裝復合物具有與天然LF與ALA自組裝復合物不同的結構。這些不同的結構對于擴展復合物的應用具有重要意義。但是目前尚無相關研究報道。

因此,本文在pH6.5環(huán)境下探究了熱變性前后的LF與天然ALA的自組裝行為。采用多重光譜法研究了LF-ALA復合物的結構特性及形成機制,為基于雙蛋白復合物運載活性物質的開發(fā)提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

LF 新西蘭國際有限公司，純度≥92%;ALA 美國Agropur公司，純度≥95%;溴化鉀 上海麥克林生化科技有限公司;磷酸二氫鉀 天津市德恩化學試劑有限公司;磷酸氫二鉀 天津市德恩化學試劑有限公司;其它所用化學藥品 均為國產分析純。

ALPHA1-2 LD plus真空凍干機 德國CHRIST凍干機有限公司;2100N濁度計 美國HACH公司;Zetasizer Nano-ZS90激光粒度儀 英國Malvern公司;Axio Vert.A1倒置生物顯微鏡 德國Zeiss公司;Cary-Eclipse熒光分光光度計 美國Agilent公司;SpectrumTensor27傅立葉變換紅外光譜儀 德國Bruker公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 復合物的制備 母液配制:在pH=6.5、20 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液中,分別配制0.5 mmol/L LF溶液和5 mmol/L的ALA溶液,室溫下攪拌2 h,使蛋白質充分水合。天然LF和天然ALA分別記為LF25 ℃和ALA25 ℃。室溫為25 ℃。

熱變性LF溶液的制備:首先,在超純水中配制1.0 mmol/L LF溶液,室溫下攪拌2 h,使蛋白質充分水合。然后,將上述溶液置于90 ℃恒溫水浴下熱處理30 min后,立即在冰水中冷卻至室溫,以防止進一步變性。之后,再添加等體積pH=6.5、40 mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液。此時得到了溶液環(huán)境為pH=6.5、20 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液、濃度為0.5 mmol/L的熱變性LF溶液。熱變性LF記為LF90 ℃。

LF-ALA復合物制備:取一定體積的0.5 mmol/L LF25 ℃溶液,分別與不同濃度的ALA25 ℃溶液等體積混合,得到LF25 ℃濃度為0.25 mmol/L,ALA25 ℃濃度分別為0.125、0.25、0.5、0.75、1.25、1.75和2.5 mmol/L的LF25 ℃和ALA25 ℃自組裝復合物,記為LF25 ℃-ALA25 ℃復合物。采用相同方法,將0.5 mmol/L LF25 ℃溶液換成0.5 mmol/L LF90 ℃溶液,制備得到LF90 ℃和ALA25 ℃自組裝復合物,記為LF90 ℃-ALA25 ℃復合物。

1.2.2 ζ-電位的測定 采用Zetasizer Nano-ZS90測定LF25 ℃-ALA25 ℃復合物和LF90 ℃-ALA25 ℃復合物的ζ-電位。測定溫度25 ℃。

1.2.3 濁度的測定 采用HACH 2100N濁度計測定LF25 ℃-ALA25 ℃復合物和LF90 ℃-ALA25 ℃復合物的濁度。濁度儀采用90 °散射光原理，在入射光恒定條件下，散射光強度與溶液的渾濁度成正比。測定溫度25 ℃。

1.2.4 粒徑的測定 采用Zetasizer Nano-ZS90測定LF25 ℃-ALA25 ℃復合物和LF90 ℃-ALA25 ℃復合物的粒徑大小，同時用多分散指數(PDI)表示粒徑分布。測定溫度25 ℃。

1.2.5 光學顯微鏡觀察 采用Axio Vert.A1倒置生物顯微鏡觀察LF25 ℃-ALA25 ℃復合物和LF90 ℃-ALA25 ℃復合物(其中ALA25 ℃的濃度為0.75 mmol/L)的形貌。放大倍數為1000倍。

1.2.6 熒光光譜測定 使用Cary-Eclipse熒光分光光度計進行熒光測量。激發(fā)波長設為292 nm,激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5 nm,記錄發(fā)射波長300～500 nm范圍的熒光光譜[20]。

1.2.7 紅外光譜測定(FTIR) 將LF25 ℃-ALA25 ℃復合物和LF90 ℃-ALA25 ℃復合物(其中ALA25 ℃的濃度為0.75 mmol/L)置于-20 ℃下冷凍過夜后,使用真空凍干機將其冷凍干燥24 h,所得固體粉末按照1∶100的比例與溴化鉀混合,制成透明薄片,進行FTIR分析。測定波數為500～4000 cm-1,掃描11次,分辨率為4 cm-1[21]。

1.3 數據分析

每組實驗均重復兩次,每個樣品均檢測三組數據,結果用平均值M±標準差SD表示。利用SPSS 18.0軟件,采用Duncan法對數據進行單因素方差分析。利用Origin 9.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 電位分析

ζ-電位是判斷溶液中蛋白質電荷特性的重要指標,也是判斷蛋白質與其它物質是否結合的重要依據。圖1為不同ALA25 ℃濃度條件下,LF25 ℃-ALA25 ℃復合物和LF90 ℃-ALA25 ℃復合物的ζ-電位。LF25 ℃溶液和LF90 ℃溶液的ζ-電位分別為-3.36和-0.30 mV。這與Zhao等在相似pH環(huán)境下測得LF的ζ-電位為(+5.0±0.6) mV不同[22],推測LF上的陽離子基團吸附溶液中的陰離子磷酸鹽所致[23]。這與Tokle等的報道一致[24]。

圖1 ALA濃度對LF-ALA復合物電位的影響Fig.1 Influence of ALA concentration on theζ-potential of LF-ALA complexes

隨著ALA濃度的增加,LF25 ℃-ALA25 ℃復合物和LF90 ℃-ALA25 ℃復合物ζ-電位始終呈現下降趨勢。Tokle等指出:LF對磷酸鹽離子的吸附行為并不影響LF與陰離子物質的靜電吸引作用[24]。這表明ALA可能吸附在LF的表面[25]。通常,溶液中顆粒帶電荷越多,斥力越大,顆粒間聚集的可能性越小,溶液越穩(wěn)定。圖中LF25 ℃-ALA25 ℃復合物的ζ-電位始終低于LF90 ℃-ALA25 ℃復合物,這說明LF25 ℃-ALA25 ℃復合物的穩(wěn)定性較高。

2.2 濁度分析

濁度法是研究蛋白質聚集現象最直接、簡便的方法,通過測量溶液中LF-ALA復合物的濁度能夠直觀評價溶液中LF和ALA的聚集行為[26]。圖2為不同ALA25 ℃濃度條件下,LF25 ℃-ALA25 ℃復合物和LF90 ℃-ALA25 ℃復合物的濁度。

圖2 ALA濃度對LF25 ℃-ALA25 ℃復合物(a)、LF90 ℃-ALA25 ℃復合物(b)濁度的影響Fig.2 Influence of ALA concentration on the turbidity ofLF25 ℃-ALA25 ℃ complexes(a)、LF90 ℃-ALA25 ℃ complexes(b)

對于LF25 ℃-ALA25 ℃復合物,隨著ALA濃度的增加(0～0.75 mmol/L),LF25 ℃-ALA25 ℃復合物的濁度增加(盡管增加程度很小),這表明LF25 ℃與ALA25 ℃發(fā)生了相互作用,導致其濁度增加[27]。ALA濃度為0.75 mmol/L時,LF25 ℃-ALA25 ℃復合物的濁度達到最大值2.3 NTU;隨著ALA濃度繼續(xù)增加(0.75～2.5 mmol/L),濁度開始下降。這表明,此時溶液中的ALA過量,導致溶液中沒有足夠的LF與之結合;同時,由于越來越多的ALA吸附到LF表面,使得復合物表面負電荷增加(見圖1),靜電斥力增強,進而使溶液濁度降低[28]。

對于LF90 ℃-ALA25 ℃復合物,其濁度變化趨勢與LF25 ℃-ALA25 ℃復合物一致,均隨著ALA25 ℃濃度的增加,呈現先增加后下降的變化規(guī)律。不同的是,當ALA25 ℃濃度為0.75 mmol/L時,LF90 ℃-ALA25 ℃復合物的濁度高達270.4 NUT。這可能是由于熱處理引起LF結構變化,LF90 ℃分子間較之LF25 ℃分子間更易于聚集[29];當與ALA25 ℃結合后,LF90 ℃分子間的聚集傾向更加明顯,進而導致形成了超分子結構,使光散射強度增強,溶液濁度迅速增加。在LF與BLG[15]、溶菌酶和BLG[8]組裝過程中,均觀察到相似的濁度變化規(guī)律。

基于上述分析,推測LF90 ℃與ALA25 ℃可能通過以下機制進行結合。即:當ALA25 ℃物質的量比較低時,ALA25 ℃可作為多齒配體將兩個LF90 ℃分子橋聯,形成-(LF90 ℃-ALA25 ℃-LF90 ℃-ALA25 ℃)n-結構的蛋白質聚集體。但是,由于ALA25 ℃濃度較低,此時所形成的網狀結構較小。所以,盡管溶液濁度增加,但不至于引起沉淀。隨著ALA25 ℃物質的量進一步增加,溶液中有足夠多的ALA25 ℃參與橋聯作用,使得網狀結構進一步增加,進而形成了顆粒較大的聚集體,溶液濁度增加,甚至產生沉淀。當ALA25 ℃物質的量繼續(xù)增加,過量的ALA25 ℃占據了LF90 ℃表面的結合位點,導致橋聯作用減弱,復合物出現復溶現象,濁度降低。Siebert等指出,蛋白質和多酚相互作用過程中,隨著多酚濃度的增加,也存在濁度先增加后減小的現象,同時,將濁度減小歸因于復溶現象[30]。這兩種機制之間的關系需要進一步深入研究。

2.3 粒徑分析

粒徑的測量是一種光散射方法,它依賴于散射粒子的濃度、大小、折射率和入射波長,通過測量溶液中LF-ALA復合物的粒徑大小及多分散性(PDI)變化,可以更深入地了解LF與ALA形成的超分子結構。圖3為LF25 ℃-ALA25 ℃復合物和LF90 ℃-ALA25 ℃復合物的粒徑、PDI隨ALA25℃濃度的變化曲線。

圖3 ALA濃度對LF25 ℃-ALA25 ℃復合物(a)、LF90 ℃-ALA25 ℃復合物(b)粒徑與PDI的影響Fig.3 Influence of ALA concentration on theparticle size and PDI of LF25 ℃-ALA25 ℃complexes(a),LF90 ℃-ALA25 ℃ complexes(b)

由圖3可知,與LF25 ℃(16.33±0.52 nm)相比,LF90 ℃(215.8±20.64 nm)的粒徑較大,表明在磷酸鹽緩沖溶液中,LF90 ℃較之LF25 ℃具有更強的自聚集能力。這也解釋了LF90 ℃-ALA25 ℃復合物濁度較高的原因。隨著ALA25 ℃濃度的增加,LF25 ℃-ALA25 ℃復合物和LF90 ℃-ALA25 ℃復合物的粒徑與濁度變化趨勢一致,均先增加后減小。LF25 ℃與ALA25 ℃形成的復合物為納米顆粒。當ALA25 ℃濃度為0.75 mmol/L時,LF25 ℃-ALA25 ℃復合物粒徑最大,為(35.24±0.82) nm。LF90 ℃-ALA25 ℃復合物多為微米顆粒。當ALA25 ℃濃度為0.75 mmol/L時,LF90 ℃-ALA25 ℃復合物的粒徑也最大,為(4.11±0.14) μm;隨著ALA25℃濃度的進一步增加,LF90 ℃-ALA25 ℃復合物的粒徑開始下降。需要指出的是,當ALA25 ℃濃度為2.5 mmol/L時,LF90 ℃-ALA25 ℃復合物的粒徑為(591.6±66.5) nm,為亞微米顆粒。這一結果表明:可以通過改變ALA的濃度來調控LF-ALA復合物的結構,進而得到納米級、亞微米級和微米級顆粒。

PDI值是評價顆粒在溶液中分布情況的重要指標。LF25 ℃-ALA25 ℃復合物的PDI隨著ALA25℃濃度的增加呈現上升趨勢,但其數值始終在0.2～0.4之間,表明LF25 ℃與ALA25 ℃形成的納米顆粒較為均一穩(wěn)定;而LF90 ℃-ALA25 ℃復合物的PDI始終在0.5～0.8之間,表明LF90 ℃與ALA25 ℃所形成的聚集體大小不均一,易發(fā)生聚集而導致沉淀。

2.4 光學顯微鏡觀察

通過光學顯微鏡更加直觀地觀察了當ALA25℃濃度為0.75 mmol/L時,LF25 ℃-ALA25 ℃復合物和LF90 ℃-ALA25 ℃復合物的微觀形貌。由圖4可知,在磷酸鹽緩沖溶液中,ALA25 ℃和LF90 ℃均為球形顆粒,分布較均一。在LF25 ℃-ALA25 ℃復合物溶液中,可以清晰地觀察到大量的球形聚集體,這些聚集體尺寸介于100～200 nm之間,分布較均勻;而LF90 ℃-ALA25 ℃復合物則形成清晰的網狀聚集體,尺寸約為2～3 μm,分布不均勻。這進一步證實了LF90 ℃-ALA25 ℃超分子結構的形成。同時也進一步證實了所推測的可能結合機制(見濁度分析部分)。

圖4 ALA、LF和LF-ALA復合物(ALA濃度為0.75 mmol/L)的顯微鏡照片Fig.4 Micrograph of ALA,LF and LF-ALAcomplexes containing 0.75 mmol/L ALA

2.5 熒光光譜分析

圖5 不同ALA濃度下LF-ALA復合物和單獨ALA的熒光光譜圖(a～c)及熒光峰值變化(d)Fig.5 Fluorescence emission spectra(a～c)and peak value(d)of LF-ALA complexes and ALA alone at different ALA concentration注:(a)為LF25 ℃-ALA25 ℃復合物;(b)為LF90 ℃-ALA25 ℃復合物;(c)為單獨ALA空白。

熒光淬滅法可以用來研究蛋白質與蛋白質之間的相互作用[31]。色氨酸(Trp)殘基通常完全或部分埋藏在蛋白質內部的疏水核心中[32],通過監(jiān)測色氨酸熒光發(fā)射峰的變化(強度變化和峰位移),可以獲取色氨酸周圍微環(huán)境變化和蛋白質結構變化的信息。當色氨酸基團位于天然蛋白質的內部時,色氨酸發(fā)射峰可能發(fā)生藍移;當蛋白質變性展開,色氨酸發(fā)射峰可能發(fā)生紅移[33]。

圖6 LF,ALA25 ℃和LF-ALA25 ℃復合物(ALA濃度為0.75 mmol/L)的傅里葉變換紅外光譜圖Fig.6 FTIR spectra of LF,ALA25 ℃ and LF-ALA25 ℃ complexes containing 0.75 mmol/L ALA

如圖5所示,LF25 ℃、LF90 ℃和ALA25 ℃的最大發(fā)射峰分別為335、340和329 nm。隨著ALA25 ℃濃度的增加,LF25 ℃-ALA25 ℃復合物和LF90 ℃-ALA25 ℃復合物的熒光強度逐漸降低,表明:熱變性前后LF和ALA25 ℃之間均存在結合行為。同時,最大發(fā)射峰均藍移至331 nm,但并沒有與ALA25 ℃的最大發(fā)射峰重疊。這表明Trp基團位于LF的內部,熒光強度降低說明了ALA25 ℃的添加增加了LF25 ℃和LF90 ℃分子中色氨酸的疏水性。即,LF25 ℃/LF90 ℃與ALA25 ℃之間的相互作用導致埋藏在LF分子內部的Trp殘基暴露程度降低[33]。該結果與Monteiro等研究結果相似,在ALA和溶菌酶結合時,溶菌酶中Trp殘基更加難以暴露于溶液環(huán)境中[31]。

2.6 FTIR分析

FTIR(400～5000 cm-1)是分析蛋白質結構變化的有力工具[34]。當蛋白質結構變化時,其紅外光譜,尤其是酰胺A帶、酰胺I帶和酰胺II帶的峰強度或峰位置會發(fā)生改變[35]。同時,通過FTIR可以判斷LF與ALA非共價相互作用類型。圖6分別為單獨LF、ALA25 ℃,LF25 ℃-ALA25 ℃、LF90 ℃-ALA25 ℃復合物的紅外光譜。

如圖6所示,ALA25 ℃在1076.2 cm-1處有較寬的特征峰,代表C-O間的伸縮振動,LF25 ℃、LF90 ℃分別在863.5、864.5 cm-1有肩峰,這與CO2H中的彎曲振動有關[35],而在LF25 ℃-ALA25 ℃復合物和LF90 ℃-ALA25 ℃復合物中,這些峰均消失,這進一步表明LF25 ℃/LF90 ℃與ALA25 ℃之間發(fā)生了相互作用。

FTIR中酰胺A帶(3310～3270 cm-1)通常與O-H間氫鍵的伸縮振動有關[19]。LF25 ℃和LF90 ℃的酰胺A帶分別在3299.6和3299.0 cm-1處,而ALA25 ℃的酰胺A帶在3299.6 cm-1處。在LF25 ℃-ALA25 ℃復合物和LF90 ℃-ALA25 ℃復合物的紅外光譜中,復合物的酰胺A帶分別藍移了0.3和1.1 cm-1。這清晰地表明:氫鍵參與了LF25 ℃/LF90 ℃與ALA25 ℃之間的相互作用。

酰胺I帶(1625和1750 cm-1)的C=O伸縮振動和酰胺II帶(1475和1575 cm-1)的C-N伸縮振動均與蛋白質的二級結構單元間的氫鍵有關[36]。由圖6可知,LF25 ℃和LF90 ℃的酰胺I帶分別在1656.0和1657.4 cm-1處,ALA25 ℃的酰胺I帶在1654.8 cm-1處。而在LF25 ℃-ALA25 ℃復合物和LF90 ℃-ALA25 ℃復合物中,酰胺I分別藍移至1659.5和1659.1 cm-1。酰胺I的藍移表明:熱處理前后,LF中的C=O基團均參與了與ALA25 ℃的相互作用。LF25 ℃和LF90 ℃的酰胺II帶分別在1540.9和1543.1 cm-1處。而在LF25 ℃-ALA25 ℃復合物和LF90 ℃-ALA25 ℃復合物中,酰胺II分別紅移了1.9和3.7 cm-1。這一結果表明:LF中的C-N基團也參與了與ALA25 ℃的相互作用。

3 結論

綜上,LF-ALA25 ℃復合物受LF結構的影響。天然LF與ALA自組裝可形成納米顆粒,粒徑最大為(35.24±0.82) nm,顆粒分布均勻,穩(wěn)定性較高;經過熱變性,LF結構發(fā)生改變,與ALA自組裝可形成的超分子結構,粒徑最大為(4.11±0.14) μm。同時,ALA的添加降低了埋藏在LF內部的Trp殘基的暴露程度。LF中的C=O和C-N基團均參與了與ALA25 ℃的相互作用。該研究為構建新型雙蛋白結構提供了理論依據。