野豬源大腸桿菌的分離鑒定及腸毒素與耐藥性分析

趙 位，鄧 晴，喻 東，楊曉軍，楊 森，蔣 海，唐 浩，張清宇，張曉敏，龍 梅，羅 燕

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，成都 611130；2.四川臥龍國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)管理局，四川汶川 623006)

大腸桿菌(Escherichiacoli)是定植于人和動(dòng)物腸道、呼吸道內(nèi)的重要條件性致病菌，在自然界中廣泛存在，自Escherich于1885年首次分離到該菌以來(lái)，在人、家禽、家畜及野生動(dòng)物機(jī)體中也分離到了該菌[1-2]。大量研究表明，大腸桿菌致病菌株能夠?qū)θ撕蛣?dòng)物產(chǎn)生致病，常引起嚴(yán)重?cái)⊙Y、腹瀉以及水腫等多種臨床癥狀[3]。其中，產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(EnterotoxigenicEscherichiacoli，ETEC)是引起嬰兒和幼畜腹瀉的一種重要病原菌。在畜牧養(yǎng)殖中，ETEC常引起仔豬、牦牛、犢牛、羔羊、雞等多種動(dòng)物腹瀉，初生幼畜常常因ETEC引起的劇烈水樣腹瀉和脫水而死亡，發(fā)病率和死亡率均很高，給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[4]。研究發(fā)現(xiàn)，ETEC首先通過黏附性菌毛對(duì)宿主的腸上皮細(xì)胞進(jìn)行黏附，然后大量增值并產(chǎn)生不耐熱腸毒素(Heat labile enterotoxin，LT)或耐熱腸毒素(Heat stable enterotoxin，ST)，進(jìn)而發(fā)揮致病作用[4]。

在多種ETEC宿主中，仔豬尤為易感。在家豬研究中，Verdonck等[5]于2002年就對(duì)比利時(shí)斷奶仔豬感染ETEC進(jìn)行報(bào)道，并對(duì)F4型ETEC和F18型產(chǎn)Vero毒素大腸埃希氏菌(Verocytotoxin-productionEscherichiacoli,VTEC)引起機(jī)體的免疫反應(yīng)進(jìn)行比較，結(jié)果證實(shí)，F(xiàn)4型ETEC能夠更早地引起豬機(jī)體產(chǎn)生IgA、IgM和IgG。Do等[6]也報(bào)道越南北部ETEC引起大量斷奶仔豬腹瀉。在國(guó)內(nèi)，周雙德等[7]對(duì)豬ETEC進(jìn)行報(bào)道，并針對(duì)豬ETEC常見毒素LTⅠ、STa和VT2e建立了多重PCR檢測(cè)方法。謝俊偉等[8]對(duì)河南某豬場(chǎng)患腹瀉2月齡仔豬進(jìn)行病原研究證實(shí)，該豬場(chǎng)腹瀉是由豬瘟與ETEC的混合感染引起。而在野豬的相關(guān)研究中，有關(guān)于產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌(Shiga toxin-producingEscherichiacoli)、腸致腸病性大腸桿菌(EnteropathogenicEscherichiacoli)、腸出血性大腸桿菌(EnterohemorrhagicEscherichiacoli)的報(bào)道[9-10]。目前，國(guó)內(nèi)外鮮見ETEC在野生野豬上的報(bào)道。本研究從四川省臥龍自然保護(hù)區(qū)野豬糞便中分離出1株大腸桿菌，對(duì)其進(jìn)行生化和16S rRNA基因分子鑒定，并通過藥敏試驗(yàn)、特異性毒力基因和耐藥基因擴(kuò)增，以期對(duì)其分類及耐藥性進(jìn)行分析，為ETEC在野豬上引起腹瀉的防控和治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、Mueller-Hinton(MH)培養(yǎng)基以及藥敏紙片等均購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司；2×TaqPCR MasterMix Kit、糞便基因組DNA提取試劑盒、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，購(gòu)自天根生化試劑(北京)有限公司；PCR反應(yīng)的引物合成以及產(chǎn)物測(cè)序，均由杭州有康生物科技有限公司完成；家豬血液樣品為四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物檢疫實(shí)驗(yàn)室 保存。

1.2 野豬糞便樣品采集及分子鑒定

采集四川省臥龍自然保護(hù)區(qū)7份野豬糞便，保存于4 ℃凍存盒中，并立即送往實(shí)驗(yàn)室，然后采用糞便基因組DNA提取試劑盒提取糞便總DNA，并參照文獻(xiàn)引物(表1)，對(duì)總DNAcytb基因及致瀉性大腸桿菌特異性基因Stx1、Stx2、LT、ST Ⅰ、STⅡ、EaeA和ial進(jìn)行PCR擴(kuò)增。同時(shí)，設(shè)置家豬血液DNAcytb基因?qū)φ誟11]。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送至有康生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，并將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行在線比對(duì)。

1.3 菌株分離

將致瀉性大腸桿菌特異性基因擴(kuò)增陽(yáng)性的野豬糞便樣品進(jìn)行梯度稀釋后涂布于麥康凱培養(yǎng)基平板上，每個(gè)梯度做3個(gè)重復(fù)，麥康凱培養(yǎng)基平板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24 h后挑選單菌落進(jìn)行劃線純化，然后進(jìn)行革蘭染色，確定為純培養(yǎng)物后，以甘油保存于-70 ℃冰箱，備用。

1.4 菌株生化鑒定

將菌種劃線接種于LB瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng) 16 h后觀察菌落顏色、形態(tài)，并采用細(xì)菌微量生化反應(yīng)管依據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》進(jìn)行生化鑒定，操作步驟按照細(xì)菌微量生化反應(yīng)管說明書 進(jìn)行。

1.5 菌株16S rRNA基因擴(kuò)增

將純化好的菌種接種于LB培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)16 h，利用細(xì)菌DNA提取試劑盒提取基因組DNA，作為PCR反應(yīng)模板，應(yīng)用通用引物(表1)對(duì)16S rRNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系參照文獻(xiàn)[12]進(jìn)行，PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送至有康生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，并將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行在線比對(duì)。

1.6 菌株毒力基因和耐藥基因的擴(kuò)增

利用提取的菌株DNA為模板，參照SN/T 3640-2013設(shè)計(jì)引物，對(duì)該菌株可能攜帶的Stx1、Stx2、LT、STⅠ、STⅡ、EaeA、ial等毒力基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。同時(shí)，對(duì)其可能攜帶的耐藥基因mecA、blaOXA、blaIMP、blaDHA、ant(4′,4′)、tetA、tetB、sulⅠ、sulⅡ、aph(3′)-Ⅱa、aac(3′)-Ⅱa、carO、KPC-2和blaNDM等進(jìn)行PCR擴(kuò)增，特異性擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送至有康生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果進(jìn)行在線比對(duì)，引物相關(guān)信息見表1。

1.7 藥敏試驗(yàn)

將純培養(yǎng)的菌液經(jīng)活菌計(jì)數(shù)，調(diào)整活菌數(shù)為 2.4×108CFU/mL，無(wú)菌棉簽均勻涂布于MH培養(yǎng)基，待稍干后用無(wú)菌鑷子將20種藥敏紙片分別貼在培養(yǎng)基表面，然后置37 ℃恒溫培養(yǎng)16～ 18 h，游標(biāo)卡尺測(cè)定抑菌圈直徑。藥敏結(jié)果參照CLSI進(jìn)行判定。

2 結(jié)果與分析

2.1 糞便總DNA分子鑒定

以提取的7份野豬糞便總DNA和家豬血液總DNA為模板，分別進(jìn)行cytb基因擴(kuò)增。結(jié)果顯示(圖1)，采集的7份野豬糞便總DNA和家豬cytb基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小均為635 bp，與預(yù)期結(jié)果一致。將目的條帶膠回收后測(cè)序，比對(duì)結(jié)果顯示二者相似性為99.98%。在線比對(duì)分析表明，糞便cytb基因擴(kuò)增產(chǎn)物與數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的豬cytb基因相似性最高。cytb基因PCR擴(kuò)增證實(shí)，采集的7份糞便均為野豬糞便。對(duì)7份野豬糞便總DNA進(jìn)行致瀉性大腸桿菌特異性基因擴(kuò)增結(jié)果顯示，7份糞便樣品總DNA中Stx1、Stx2、LT、ST Ⅰ、EaeA和ial基因擴(kuò)增均為陰性，而1份糞便樣品ST Ⅱ基因?yàn)殛?yáng)性，其擴(kuò)增產(chǎn)物大小約為421 bp (圖2)，與數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄的大腸桿菌STⅡ基因(KY581591.1)相似性為98.64%。

2.2 細(xì)菌的分離培養(yǎng)

對(duì)1份STⅡ基因陽(yáng)性野豬糞便進(jìn)行培養(yǎng) 16 h后，在麥康凱培養(yǎng)基，形成大量紅色、邊緣光滑、濕潤(rùn)的菌落，在LB平板上面可見乳白色、圓形、表面光滑、直徑約2 mm的菌落。革蘭染色可見紅染的直桿菌，菌落形態(tài)及革蘭染色結(jié)果見圖3。

2.3 菌株的生化性質(zhì)

各項(xiàng)生化指標(biāo)檢測(cè)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，分離菌株發(fā)酵葡萄糖、阿拉伯糖、乳糖、麥芽糖、棉籽糖、木糖均產(chǎn)酸產(chǎn)氣；鳥苷酸脫羧酶和賴氨酸脫羧酶呈陽(yáng)性；苯丙氨酸脫羧酶、精氨酸脫羧酶、氧化酶、尿素酶、山梨醇和側(cè)金盞花醇呈陰性；不產(chǎn)H2S，VP試驗(yàn)為陰性(表2)。以上結(jié)果符合大腸桿菌的生化 特征。

表1 本研究使用的引物信息Table 1 Information of primers in this study

M.DL2000 plus DNA marker；1.家豬血液DNA cyt b基因擴(kuò)增；2～8.7份野豬糞便DNA cyt b基因擴(kuò)增

M. DL2000 DNA marker；1～7.7份野豬糞便DNA STⅡ基因擴(kuò)增

圖3 分離菌株的在LB上菌落形態(tài)(A)、麥康凱上的菌落形態(tài)(B)與革蘭染色結(jié)果(C)Fig.3 Colony morphology of isolate on LB plate(A) and Maconkey agar plate(B) and Gram staining results(C)

表2 分離菌株生化鑒定結(jié)果Table 2 Results of biochemical identification of isolated strains

2.4 菌株16S rRNA基因序列分析

分離菌株16S rRNA基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小約為1 400 bp，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖4。將目的條帶膠回收后測(cè)序，結(jié)果表明該菌 16S rRNA基因大小為1 397 bp。將序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)(登錄號(hào)：MN368163)，并在 NCBI上對(duì)該序列進(jìn)行Blast比對(duì)分析，結(jié)果顯示，該分離菌的16S rRNA基因序列與大腸桿菌LD91-1菌株(登錄號(hào)：CP042585.1)的16S rRNA基因序列覆蓋度和相似性均為100%。因此結(jié)合生化試驗(yàn)和16S rRNA基因分析，確定該菌種為大腸桿菌。

2.5 菌株毒力基因和耐藥基因的擴(kuò)增

對(duì)分離菌株部分毒力基因和耐藥基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示(圖5)，該分離菌株基因組中攜帶耐熱腸毒素基因STⅡ。而耐藥基因擴(kuò)增表明，該分離菌株基因組中mecA、blaOXA、blaIMP、ant(4′,4′)、tetA、tetB、aph(3′)-Ⅱa、carO和KPC-2擴(kuò)增為陽(yáng)性，電泳條帶與預(yù)期大小相符(圖6)。毒力基因和耐藥基因擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果在線比對(duì)證實(shí)，其與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中相應(yīng)的毒力基因和耐藥基因序列一致。

M.DL2000 plus DNA marker；1.16S rRNA；2.空白對(duì)照

M.DL2000 DNA marker；1. STⅠ；2. STⅡ；3.LT； 4. Stx1；5. Stx2；6.EaeA；7.ial

M.DL2000 DNA marker；1.mecA；2.tetA；3.tetB；4. aac(3′)-Ⅱa；5. sulⅠ；6. sulⅡ；7. aph(3′)-Ⅱa；8.blaDHA；9.blaIMP； 10. ant(4′,4′)；11.blaOXA；12.blaNDM；13.carO；14. KPC-2

2.6 藥敏試驗(yàn)

參照CLSI藥敏紙片擴(kuò)散法對(duì)菌株進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，結(jié)果參照CLSI進(jìn)行判定。表3顯示，分離菌株對(duì)紅霉素、四環(huán)素、頭孢拉定、頭孢他啶、奧格門丁、林可霉素、氨芐西林和氨曲南8種藥物具有抗性，對(duì)阿米卡星、頭孢唑啉、頭孢曲松、鏈霉素、氧氟沙星、慶大霉素、諾氟沙星、氯霉素、復(fù)方新諾明和亞胺培南10種藥物敏感，而阿奇霉素和多粘菌素藥敏結(jié)果為中介。

3 討 論

在自然界中，大腸桿菌廣泛存在于人和動(dòng)物腸道、呼吸道以及土壤、水、農(nóng)產(chǎn)品中，也是一類重要的人畜共患病原菌，當(dāng)人或動(dòng)物機(jī)體抵抗力下降或當(dāng)攜帶某些毒力因子的大腸桿菌侵入腸道和呼吸道外組織或其他器官時(shí)，就會(huì)引起感染[16]?？梢鸶篂a的大腸桿菌被稱為致瀉性大腸桿菌，其往往攜帶某些重要的毒力因子[17]。臨床上，致瀉性大腸桿菌的準(zhǔn)確鑒定，對(duì)腹瀉病的防治尤為重要，傳統(tǒng)上往往采用血清型鑒定對(duì)致瀉性大腸桿菌與正常大腸桿菌進(jìn)行區(qū)分，而大量報(bào)道表明，血清型鑒定存在可重復(fù)性低、工作量大、成本高等特點(diǎn)[18-20]。研究表明，致腹瀉的5類大腸桿菌中，除了彌散粘附性大腸桿菌，其余4種致瀉性大腸桿菌均具有特定的毒力因子[21]。因此，通過不同致瀉性大腸桿菌特定毒力因子的PCR擴(kuò)增檢測(cè)，能夠快速、準(zhǔn)確地對(duì)其進(jìn)行區(qū)分。本研究通過PCR擴(kuò)增致瀉性大腸桿菌特定毒力因子，發(fā)現(xiàn)一株分離于野豬糞便的大腸桿菌攜帶有耐熱腸毒素STⅡ基因，證實(shí)該分離株屬于致瀉性大腸桿菌中的產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(ETEC)。ETEC可同時(shí)攜帶耐熱腸毒素和不耐熱腸毒素，也可僅攜帶耐熱腸毒素或不耐熱腸毒素，在新生兒和幼畜腹瀉中檢出率極高，常引起的劇烈水樣腹瀉和脫水[3]。目前，尚未有野生野豬上分離ETEC的報(bào)道。通過糞便形態(tài)特征和cytb基因序列分析，證實(shí)采集的糞便為野豬糞便。而從野豬糞便的狀態(tài)、顏色、形狀上看，并沒有出現(xiàn)腹瀉癥狀，這可能與宿主機(jī)體狀況以及糞便中ETEC的數(shù)量存在關(guān)系。

表3 分離菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of drug sensitivity of isolated strains

臨床上，抗生素是進(jìn)行大腸桿菌病治療的的首選方法。但是隨著抗生素的不合理使用，導(dǎo)致了大腸桿菌耐藥性和耐藥譜增加，從而增加了臨床大腸桿菌疾病治療的困難。本研究對(duì)四川省臥龍自然保護(hù)區(qū)野豬糞便中分離出的一株大腸桿菌耐藥情況分析發(fā)現(xiàn)，14種耐藥基因中，四環(huán)素類耐藥基因tetA和tetB、大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因mecA、β-內(nèi)酰胺類耐藥基因blaOXA、blaIMP、carO和KPC-2以及氨基糖苷類耐藥基因aph(3′)-Ⅱa和ant(4′,4′)均為陽(yáng)性。而藥敏試驗(yàn)表明，該分離株為多重耐藥菌株，其對(duì)紅霉素、多種β-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類等藥物具有抗性，不過仍然對(duì)β-內(nèi)酰胺類的頭孢唑啉、頭孢曲松、亞胺培南等藥物敏感。亞胺培南作為碳青霉烯類常見抗生素，是目前臨床治療多重耐藥性革蘭陰性菌感染的重要抗生素[22]，而碳青霉烯水解酶的出現(xiàn)，使很多菌株對(duì)碳青霉烯類抗生素產(chǎn)生抗性，其中KPC型碳青霉烯酶作為β-內(nèi)酰胺酶的重要成員被廣泛關(guān)注[23]，此外，carO基因編碼膜孔蛋白，也能夠影響菌株對(duì)β-內(nèi)酰胺類藥物的敏感性[24]。本研究中，雖然分離菌株均攜帶KPC-2和carO基因，但是藥敏結(jié)果顯示，菌株對(duì)亞胺培南仍敏感，可見耐藥基因型與表型之間存在差異，這可能存在耐藥基因未表達(dá)或發(fā)生突變等情況，其具體原因還需要進(jìn)一步研究探討。

野生動(dòng)物生活方式特殊，發(fā)病較少，人為影響也較少，其受抗生素的影響的可能性也較低。然而，隨著抗生素的大量使用及人為對(duì)野生動(dòng)物活動(dòng)區(qū)域的影響，越來(lái)越多的野生動(dòng)物源致病菌均表現(xiàn)出耐藥性。本研究首次對(duì)臥龍自然保護(hù)區(qū)野生野豬源多重耐藥產(chǎn)腸毒素大腸桿菌進(jìn)行報(bào)道。在其他野生動(dòng)物上也有耐藥性大腸桿菌的報(bào)道，在四川地區(qū)圈養(yǎng)長(zhǎng)頸鹿、蜂猴、金絲猴、黃虎等多種野生動(dòng)物源大腸桿菌的耐藥性分析發(fā)現(xiàn)，圈養(yǎng)野生動(dòng)物源大腸桿菌對(duì)多種磺胺類藥物都表現(xiàn)出耐藥[25]。Pavlickova等[26]對(duì)分離自家雞和野雞、野鴨的105株大腸桿菌耐藥基因進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，野雞和野鴨源大腸桿菌主要攜帶CEF、CXM、CTX等頭孢類藥物耐藥基因。此外，在黑鳶、海鷗、狼和狐貍等多種野生動(dòng)物上均發(fā)現(xiàn)多重耐藥大腸桿菌[27]?？梢?，野生動(dòng)物源大腸桿菌耐藥性已經(jīng)比較普遍，這對(duì)于養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展和人類的健康存在重大隱患，值得引起關(guān)注和重視。

綜上所述，本研究通過對(duì)野生野豬源大腸桿菌的分離鑒定、藥敏試驗(yàn)、致病類型、耐藥基因進(jìn)行系統(tǒng)研究，在野生野豬糞便中分離出1株多重耐藥產(chǎn)腸毒素大腸桿菌，為野豬源病原菌的致病性及耐藥性研究奠定基礎(chǔ)。